实时荧光定量PCR检测转基因玉米59122的
方法建立及测量不确定度评估

宋 君，郭灵安*，雷绍荣，王 东，尹 全，张富丽，刘文娟，常丽娟

（四川省农业科学院农产品质量标准研究所，四川 成都 610066）

摘 要：为了准确定量检测非故意扩散的转基因玉米59122，建立转基因玉米59122及产品的实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）检测方法，并用特异性、准确度、灵敏度以及测量不确定度等指标评价该方法。结果显示，利用该方法只能检出转基因玉米59122；16 次重复测量含量为1%的转基因玉米59122样品，平均测量值（0.9%）接近真实值（1%），相对误差为10%，测试回收率为90%，测量不确定度为0.002；能检测到最低含量为2拷贝的59122分子片段；除去3 次偏离平均值较大的测量值外，13 次重复测量值的变异系数为0.05。因此，实验建立的转基因玉米59122实时荧光定量PCR方法具有较高的特异性、准确度、灵敏度、精密度，较低的测量不确定度。

关键词：转基因玉米59122；定量检测方法；方法学评价

An Accurate Quantitative Assay for Genetically Modified Maize Event 59122: Method Establishment and Assessment of Its Measurement Uncertainty

SONG Jun, GUO Ling-an*, LEI Shao-rong, Wang Dong, Yin Quan, Zhang Fu-li, Liu Wen-juan, Chang Li-juan

(Institute of Quality Standards and Testing Technology for Agro-Products,
Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Chengdu 610066, China)

Abstract: Genetically modified maize (Event 59122) used as a feedstock has been approved to be imported to China since 2012. But, there has so far been no quantitative assay available to detect the genetically modified corn 59122 and its derivatives. In this study we established a quantitative detection method for this modified maize corn using real-time fluorescent quantitative PCR in order to accurately examine whether it is spread unintentionally, ensure the safety of corn production in China and reduce the ecological risk. Meanwhile, the method was evaluated by several methodological indicators such as specificity, sensitivity, accuracy and measurement uncertainty. Our experimental results showed that this method was specific for modified maize corn 59122. The average of 16 replicate detections for 1% modified maize corn 59122 was 0.9% with a relative deviation of 10%. The recovery was 90%, and the measurement uncertainty was 0.002. The lowest detectable level was 2 copies of DNA fragments from the modified maize crop 59122. The variation coefficient for the remaining 13 replications was 0.05 when the 3 replicate detections deviated largely from the average value (0.9%) were removed. Therefore, the quantitative detection method described in this paper for modified maize maize 59122 has fairly high specificity, accuracy, sensitivity and precision as well as low measurement uncertainty.

Key words: genetically modified maize 59122; quantitative detection method; methodological assessment

中图分类号：Q03 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）24-0259-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201424050

转基因玉米59122（OECD Unique Identifier，DAS-59122-7）是先锋高技术育种国际公司（Pioneer Hi-Bred International Inc.）和陶氏益农公司（Dow AgroSciences LLC）将遗传修饰的新型抗虫基因cry34Ab1、cry35Ab1以及抗除草剂的标记基因pat，通过根癌农杆菌介导转化入受体玉米株系（Hi-Ⅱ）的抗虫、耐除草剂玉米。2004年转基因玉米DAS-59122-7最早在美国、墨西哥被批准用于食用或饲料原材料，2005年在美国被批准环境释放；同年这种转基因玉米在加拿大获得环境释放和食用或饲料应用；日本于2006年同时批准该转基因玉米在本国环境释放和食用及饲料加工应用；澳大利亚、菲律宾、韩国等国于2005年只批准转基因玉米59122在本国用于食用及饲料加工。2013年3月，欧盟食品安全局就转基因玉米59122面向市场用于种植、食品饲料加工发布意见，认为转基因玉米59122同普通玉米一样安全，不会对动物以及人体健康构成威胁[1]，但该意见并未明确同意进口该转基因玉米。目前，我国已批准进口转基因玉米59122为加工原料，有效期限为2012年12月20日至2015年12月20日。

迄今我国尚无转基因玉米59122的定量检测标准，为了准确、定量检测非故意扩散的转基因玉米59122，保障我国玉米生产安全和降低生态风险，本实验拟建立一种针对转基因玉米59122转化事件的实时定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）检测方法，并对其进行了方法学评价和测量不确定度评估，以期为我国农产品质量安全监管提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

含量为10%的转基因玉米59122标准物质、含量为1%的转基因玉米59122测试样品、转基因玉米TC1507、NK603、MON863、MON810、3272非目标转化体粉末样品和转基因大豆、棉花、油菜、甜菜种子粉末样品 欧盟
联合研究中心测量与标准物质研究所。

植物基因组DNA纯化试剂盒、探针型（TaqMan水解探针）实时PCR试剂盒 天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 仪器与设备

Nanodrop®1000超微量分光光度计 美国Thermo Fisher Scientific公司；7500实时荧光PCR系统 美国Applied Biosystem公司；以上仪器分别用于测试从转基因玉米59122中分离、纯化的基因组DNA的质量和扩增玉米zSSⅡb内源基因以及59122转化事件DNA片段。

1.3 方法

1.3.1 DNA的分离与纯化

称取含量为10%的转基因玉米59122标准物质和含量为1%的转基因玉米59122粉末各0.1g。按照植物基因组DNA纯化试剂盒说明书分离、纯化转基因玉米59122基因组DNA。

1.3.2 引物和探针设计

采用GB 19495.5—2004《转基因产品检测：核酸定量PCR检测方法》中的引物序列[2]，扩增玉米内标基因zSSⅡb；根据转基因玉米59122的旁侧序列（http://www.shgmo.org/welcome.htm），设计跨越基因表达调控元件（CaMV35S）和玉米基因组的特异引物和探针（表1）。

表 1 转基因玉米59122定量检测的引物和探针

Table 1 The primers and probes used for the quantitative detection of genetically modified maize 59122

1.3.3 标准曲线制备和反应体系

将含量为10%的转基因玉米59122标准物质基因组DNA，按照1∶5稀释成5个质量浓度梯度：100、20、4、0.8、0.16 ng/µL；将含量为1%的转基因玉米59122基因组DNA的质量浓度稀释成50 ng/µL。取上述DNA稀释液3 µL加入到25 µL反应体系：TaqMan Master mix（2×）12.5 µL，上下游引物（10 µmol/L）各1µL，探针（10 µmol/L）0.5 µL，补水至25 µL。每个梯度质量浓度的DNA稀释液做3个平行反应，测试样品重复16 次扩增反应。

把配制好的反应体系置于7500型荧光定量PCR仪器上，运行如下程序：首先95 ℃预变性DNA模板，10 min；然后运行45 个热循环反应：95 ℃变性15 s；59 ℃退火60 s。

1.3.4 方法的特异性、灵敏度和精密度

为了检验方法的特异性，除了将本实验设计的引物和探针在数据库（EMBL、GenBank、Patent等）中搜索比对外，还用设计的引物和探针扩增转基因玉米TC1507、NK603、MON863、MON810、3272非目标转化体粉末样品和转基因大豆、棉花、油菜、甜菜种子粉末样品的DNA，确定方法的特异性。

根据玉米基因组大小（5×109 bp），计算出4 µL含量10%的59122玉米粉末DNA溶液（16.54 ng/µL）含1 224 个拷贝59122转化事件分子片段，然后连续4 次按照1∶5梯度稀释，获得59122分子片段的5 个梯度拷贝数分别为1 224、245、49、10、2 拷贝，分别以这5 个梯度拷贝数的DNA为模板进行实时扩增以测定方法的灵敏度。

对转基因成分含量为1%的样品进行16 次重复检测，然后计算这些测量数据的变异系数和回收率来评估方法的精密度。变异系数和测量回收率的计算见公式（1）、（2）：

（1）

（2）

式中：C1为样品转基因成分测量值的平均值；C2为样品转基因成分真实值（约定值）。

1.3.5 转基因玉米59122测量不确定度的计算

根据实验获得zSSⅡb（内源基因）和59122分子片段（外源基因）的标准曲线方程Ct=K×lgA＋B（Ct为定量PCR仪检测到的超过荧光信号背景阈值的热循环数，A为基因的绝对含量，B为一次函数的截距），计算出测试样品中zSSⅡb基因和59122分子片段的绝对含量（A），再根据公式（3）计算出转基因玉米59122的相对含量[3]。

（3）

实验中微量液体体积转移误差和标准曲线拟合数据对之间的非线性偏离是转基因成分定量分析中的主要不确定度来源[3-8]。根据测量不确定度的评定[9-12]，先计算实验中随机效应产生的A类不确定度（uA），然后计算数据对的非线性偏离、微量液体转移误差引起的B类不确定度（uB），再将A、B两类不确定度合成为合成不确定度（uc）；最后计算出本实验的测量不确定度（U）。

2 结果与分析

2.1 方法的特异性和标准曲线

采用本实验设计的引物和探针分别对转基因玉米59122、TC1507、NK603、MON863、MON810、3272非目标转化体粉末样品和转基因大豆、棉花、油菜、甜菜种子粉末样品的DNA进行扩增（图1），只有转基因玉米59122的DNA得到扩增，扩增曲线呈典型“S”型曲线，说明设计的定量分析59122分子片段的引物和探针能够用于检测转基因玉米59122，不能用于其他转基因作物和其他转基因玉米非59122品系检测，设计的引物和探针具有很高的特异性。

“S”型曲线为转基因玉米59122的扩增曲线，
水平直线为非转基因玉米59122样品的扩增曲线。

图 1 转基因玉米59122扩增的特异性

Fig.1 The specificity of amplification of genetically modified maize 59122

根据最小二乘法原理，Applied Biosystem Corporation 7500软件拟合出标准曲线（图2和图3）。转基因玉米59122的标准曲线方程为Y=－3.57X＋30.62（图2），相关系数R2为0.983，扩增效率为90.56%；玉米内源基因zSSⅡb的标准曲线方程为Y=－3.58X＋
31.10（图3），相关系数R2为0.998，扩增效率为90.37%。实验结果显示本实验的内源（zSSⅡb）、外源（59122分子片段）基因扩增效率高（大于90%），线性关系好（R2≥98%），说明本实验设计的引物和探针扩增效率高，建立的标准曲线方程的数据对间的线性关系好。

图 2 59122分子片段标准曲线

Fig.2 Standard curve of specific fragment of genetically modified maize 59122

图 3 zSSⅡb基因标准曲线

Fig.3 Standard curve of zSSⅡb gene of genetically modified maize 59122

2.2 方法的灵敏度和精密度

用1 224、245、49、10、2 个拷贝的59122分子片段作为模板，实时扩增结果表明本方法能检测到2个拷贝的59122分子片段（图4），本实验建立的转基因玉米59122定量检测方法的检测低限为2拷贝。

图 4 转基因玉米59122检测方法的灵敏度

Fig.4 The sensitivity of the detection method for genetically modified maize 59122

表 2 测试样品（1%）转基因玉米59122定量检测结果

Table 2 Quantitative detection of the molecular fragment from genetically modified maize 59122 in samples

表 3 59122分子片段标准曲线拟合

Table 3 Standard curve fitting for of the molecular fragment from event 59122

表 4 zSSⅡb基因标准曲线拟合

Table 4 Standard curve fitting for zSSⅡb gene

2.3 测量不确定度

2.3.1 A类不确定度

根据贝塞尔公式计算由随机效应导致的A类不确定度，

（4）

式中：xi为59122分子片段测量值；x为16 次测量59122分子片段的平均值；n为测量次数16。

（5）

（6）

（7）

2.3.2 B类不确定度

2.3.2.1 标准曲线拟合中数据对非线性的不确定度

（lgA外、Ct外）在标准曲线拟合中的非线性关系标准差，为：

（8）

（9）

式中：n为标准曲线上数据对的总数；Ct外拟合值、Ct外测量值分别为由已知梯度含量值根据标准曲线计算出的Ct（Ct拟合值）和定量PCR仪测量到的Ct（表3）。

测量次数p为16，最小二乘法引入的不确定度分量为：

（10）

（11）

式中：s（Ct外）为由标准溶液Ct值残差（表3）计算的标准差；n为标准曲线上数据对总数；p为测量次数；

lgA外

为试样重复测量p次结果的平均值；

lgAi外

为绘制拟合直线全部（n个）输入值lgAi的总平均值。

（12）

（13）

其相对不确定度为：

（14）

同理计算lgA内的响应值Ct内对zSSⅡb标准曲线的标准差：

（15）

zSSⅡb标准曲线的不确定度u（Ct内）分量为：

（16）

（17）

（18）

其相对标准不确定度为：

（19）

标准曲线的不确定度的自由度为n－2。

所以：

uA外=n－2=15－2=13 （20）

vA内=n－2=15－2=13 （21）

2.3.2.2 微量移液器的不确定度

经中国测试研究院对本实验中使用的微量移液器校准，10～100 µL测量范围内的最大允差为±0.8µL，因为微量移液器造成的不确定度呈均匀分布，所以10～100 µL微量移液器的测量不确定度 u1=0.8/

3

=0.4619µL，该移液器在本次实验中的加样体积为12.5 µL，其相对标准不确定度为urel1=0.461 9/12.5=0.037；0.5～10 µL量程微量移液器的最大允差为±0.12 µL，其测量不确定度u2=0.12/

3

=
0.069 µL，在本实验中的加样体积分别为3、7 µL，故其相对不确定度分别为urel2=0.069/3=0.023、urel3=0.069/7=0.010；0.1～2.5µL的微量移液器最大允差为±0.04 µL，其测量不确定度u3=0.04/

3

=0.023µL，在本实验中的加样体积分别为0.5、1、1µL，故其标准不确定度为urel4=0.023/0.5=0.046，urel5=0.023/1=0.023，urel6=0.023/1=0.023。由于3种不同量程的移液器在实验过程中具独立性，因此由微量移液器允差带来的合成不确定度为：

（22）

用最大偏差估计不确定度的自由度为无穷大，ν3=ν4=ν5=∞。

2.3.2.3 B类标准不确定度的合成

因为各分量urel外、urel内、urel移液器不确定度彼此独立，灵敏系数都为1，urel外、urel内、urel移液器合成为B类合成不确定度（urelB）。

（23）

（24）

2.3.3 合成不确定度uc

又因为A类不确定度和B类不确定度彼此独立，所以

（25）

（26）

2.3.4 扩展不确定度U

根据扩展不确定公式，U=k×uc，在置信水准P等于95%时，有效自由度veff为219的t分布临界值，按照非整ν内插计k为1.96，所以扩展不确定度U为0.002，所以测量结果C为0.009±0.002。

3 讨 论

目前转基因成分含量的分析主要采用荧光定量PCR方法[13-15]，本实验设计了扩增转基因玉米59122的引物和探针，用含量为10%转基因玉米59122作为标准物质，建立了转基因玉米59122的实时定量PCR检测方法。引物和探针的高特异性是PCR方法检验基因或分子片段的首要要求。本实验设计的引物和探针在NCBI数据库中比对，除了能与转基因玉米59122的外源基因旁侧序列（外源基因插入受体玉米基因组整合位点两侧的序列）结合外，没有发现别的结合位点。此外，本实验还用设计的引物和探针进一步扩增了抗除草剂和抗虫转基因玉米其他品系，仍然没有检测到59122分子片段，说明本实验建立的定量分析转基因玉米59122的方法具有很高的特异性。在实际操作中，PCR的扩增效率在90%～110%的范围内，对应的标准曲线斜率的平均值在－3.6～－3.1之间，测试样品的Ct值在18～30个循环数范围内，能够获得可靠的测量结果[4]。R2是反映标准曲线数据对相关性的重要参数，在基因的定量分析中，一般要求相关系数R2大于或等于0.98。本实验用建立的转基因玉米59122定量PCR检测方法，制备的标准曲线斜率为－3.57，扩增效率为90.56%，相关系数R2为0.983，用该标准曲线得到的检测结果（0.9%）接近样品中59122含量的真实值（1%）。测量值与真实值的相对误差（10%）小于25%，而且样品测试的回收率为90%，充分显示本方法的检测结果具有较高的准确度。灵敏度是评价一种检测方法的主要指标，在分析化学中一般是指测定方法能检测出物质的最低量或最低浓度。方法的灵敏度一般用检测低限来表示，检测低限越低，检测方法越灵敏。本实验建立的方法可以从反应体系中检测到连续按照1∶5稀释后的2拷贝59122分子片段，说明本方法具有很高的灵敏度。精密度是用来表征各次测量的数据大小彼此接近的程度。测量精密度越高，说明各次测量数据比较接近，测量精密度是偶然误差的反映。通过连续16 次重复测量同一样品，测量值分布在0.7%～1.1%之间，变异系数为0.1。16 次测量值中有3 次测量值偏离平均值（0.9%）较大，1次测量值为1.1%，2次测量值为0.7%，这可能是由于模板DNA溶液微量转移的误差被PCR放大的结果。如果去掉这3次偏离平均值较大的数据，13次重复测量值的变异系数为0.05，显示本方法具有较高的灵敏度。测量不确定度是与测量结果关联的一个参数，用于表征合理赋予被测量的值的分散性[8]，是评估检测数据质量的重要参数。关于测量不确定的评估在理化分析文献中报道较多[16-23]，在转基因生物检测中测量不确定度评估工作报道相对较少。本实验按照不确定度评定[24]，分别计算了实验中随机效应产生的不确定度uA，标准曲线数据对的非线性偏离、微量液体转移误差引起的不确定度uB，在此基础上合成了各类不确定度，根据合成不确定度uc算出本实验的测量不确定度U为0.002，测量值的分布范围较窄，在0.7%～1.1%之间，说明本法检测质量较高。因此，从方法的特异性、灵敏度、精密度、准确度以及构建的标准曲线斜率和相关系数等评价指标看，本实验建立的转基因玉米59122实时定量PCR检测方法是一种精准检测技术，能为我国转基因生物安全监管提供良好的技术支持。

参考文献：

[1] EFSA Panel on Genetically Modified Organisms (GMOs). Statement supplementing the environmental risk assessment conclusions and risk management recommendations on genetically modified insect-resistant maize 59122 for cultivation in the light of new scientific information on non-target organisms and regionally sensitive areas[J]. EFSA Journal, 2013, 11(11): 3443.

[2] GB 19495.5—2004 转基因产品检测核酸定量PCR检测方法[S]. 北京: 中国标准出版社, 2007.

[3] 宋君, 雷绍荣, 郭灵安, 等. 实时荧光定量PCR检测转基因玉米MON863的测量不确定分析[J]. 玉米科学, 2012, 20(5): 45-49.

[4] 宋君, 雷绍荣, 刘勇, 等. 实时荧光定量PCR检测转基因玉米MON863结构特异基因的测量不确定度[J]. 安徽农业科学, 2011, 39(33): 20312-20315.

[5] 王东, 宋君, 叶先林, 等. 转基因大豆外源基因NOS终止子定量测定的不确定度分析[J]. 大豆科学, 2013, 32(5): 601-605.

[6] 王东, 宋君, 雍彬, 等. 转基因水稻外源基因NOS终止子定量测定的不确定度分析[J]. 江西农业学报, 2013, 25(10): 96-99.

[7] 王东, 宋君, 叶先林, 等. 转基因大豆GTS40-3-2定量测定的不确定度分析[J]. 山西农业科学, 2013, 41(9): 919-923.

[8] 王东, 宋君, 郭灵安, 等. 转基因大豆外源基因CaMV35S启动子测定不确定度分析[J]. 西南农业学报, 2014, 27(1): 40-45.

[9] 国家质量监督检验检疫总局. JF 1059.1—2012 测量不确定度评定与表示[M]. 北京: 中国计量出版社, 2012.

[10] 张海滨, 王中宇, 刘智敏. 测量不确定度评定的验证研究[J]. 计量学报, 2007, 28(3): 193-197.

[11] 王承忠. 测量不确定度原理及在理化检验中的应用: 第一讲: 测量不确定度的基本概念及A类标准不确定度[J]. 理化检验: 物理分册, 2003, 39(1): 57-60.

[12] 曹宏燕. 分析测试中测量不确定度及评定: 第三部分: 分析测试中主要不确定度分量的评定[J]. 冶金分析, 2003, 39(1): 57-60.

[13] 陈颖, 徐宝梁, 苏宁, 等. 实时荧光定量PCR技术检测转基因大豆方法的建立[J]. 食品与发酵工业, 2003, 29(8): 65-69.

[14] 敖金霞, 高学军, 仇有文, 等. 实时荧光定量PCR技术在转基因检测中的应用[J]. 东北农业大学学报, 2009, 40(6): 141-144.

[15] 陈颖, 徐宝梁, 苏宁, 等. 实时荧光定量PCR技术在转基因玉米检测中的应用研究[J]. 作物学报, 2004, 30(6): 602-607.

[16] 樊垚, 黄翠丽, 王力清, 等. 超高效液相色谱法测定婴幼儿配方乳粉中的VD3含量的不确定度评定[J]. 食品科学, 2013, 34(12): 143-146.

[17] 郝晓莉, 赵瑛博, 陈芳芳. 分光光度法测定白菜中亚硝酸盐的不确定度评定[J]. 食品科学, 2013, 34(6): 208-210.

[18] 赵健亚, 陈丹, 谢怀根, 等. 高效液相色谱法测定鸡肉中磺胺类药物残留的不确定度评定[J]. 食品科学, 2013, 34(10): 144-147.

[19] 牛华, 牛之瑞, 冯雷. 高效液相色谱法测定辣椒粉中罗丹明B的测量不确定度评估[J]. 食品科学, 2014, 35(8): 165-168.

[20] 杨洋, 徐春祥, 车文军. 高效液相色谱法测定奶粉中的三聚氰胺及其不确定度分析[J]. 食品科学, 2010, 31(4): 250-253.

[21] 霍晓敏. 气相色谱法对干海参中的六六六、滴滴涕测量结果不确定度的评定[J]. 食品科学, 2013, 34(8): 244-248.

[22] 王吉祥, 张学忠, 王亚. 气相色谱法和气相色谱-质谱法测定茶叶中联苯菊酯的不确定度评定[J]. 食品科学, 2014, 35(12): 200-203.

[23] 姜诚, 张平. 用原子荧光法测定银耳中汞的不确定度[J]. 食品科学, 2007, 28(9): 493-496.

[24] 林瑞波. 检测实验室参数测量不确定度评定浅析[J]. 中国计量, 2011, 20(8): 71-73.