栘[木衣]属植物多酚的含量测定与比较

刘海霞1，刘 刚1，张晓喻1,*，朱明君1，彭 彤2，王战国2

（1.四川师范大学生命科学学院，四川 成都 610101；2.四川大学生命科学学院，四川 成都 610064）

摘 要：以根皮苷为标样，研究Folin-Ciocalteu（FC）比色法测定栘[木衣]属3 个种的多酚含量适宜条件，进一步用此改良法测定和比较多酚含量在栘[木衣]属的3 个种的叶以及在长爪栘[木衣]的不同器官中的差异性。结果表明，FC比色法最佳测定条件为：加质量分数10%的Na2CO3溶液2.5 mL和FC显色剂0.5 mL，在55℃条件下反应7 min。在1.252～15.024 µg/mL范围内，根皮苷的吸光度与其质量浓度呈良好的线性关系（R2=0.999 1），平均加样回收率为（100.08±2.43）%；测定结果还表明，3 个物种的叶片多酚含量的差异显著，云南栘[木衣]最低12.55 g/100 g，长爪栘[木衣]最高25.35 g/100 g；长爪栘[木衣]的不同器官均含有多酚类化合物，含量差异显著（3.75～25.35 g/100 g）（P＜0.05），由低到高为：果核＜根＜果肉＜根皮＜果皮＜茎＜叶。结论：改良后的FC比色法，用于测定栘[木衣]的多酚含量，具有快速、准确、重复性好的特点。栘[木衣]属植物的多酚含量较高，且多酚含量有明显的种间差异性及部位的差异性，栘[木衣]属的植物具有较大的开发和应用价值。

关键词：栘[木衣]；多酚；Folin-Ciocalteu法；改良；测定

Determination of Polyphenol Contents in Docynia Dcne.

LIU Hai-xia1, LIU Gang1, ZHANG Xiao-yu1,*, ZHU Ming-jun1, PENG Tong2, WANG Zhan-guo2

(1. College of Life Science, Sichuan Normal University, Chengdu 610101, China;

2. College of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu 610064, China)

Abstract: Using phlorizin as reference substance, Folin-Ciocalteu colorimetric assay for polyphenols extracted from Docynia Dcne. was systematically investigated for developing an optimal colorimetric method. The contents of polyphenols in three species of Docynia Dcne. were determined and compared as well as in different parts of Docynia longiunguis. The optimum colorimetric conditions were determined as follows: 0.5 mL of FC reagent and 2.5 mL of 10% Na2CO3,
7 min of reaction time, and 55 ℃ of reaction temperature. The absorbance of phlorizin was in good linear relationship with concentration in the range of 1.252–15.024 µg/mL, R2 = 0.999 1, and the average recovery for the analysis of spiked samples was 100.08%, with RSD of 2.43%. The contents of polyphenols in leaves of three species were significantly different, with the lowest and highest levels detected in Docynia delavayi (12.55 g/100 g) and Docynia longiunguis (25.35 g/100 g),
respectively. Moreover, there was a significant difference in polyphenol contents among different organs of Docynia longiunguis, which showed the increasing order: pyrene < root < pulp < root bark < peel < stem < leaf. Conclusion: The established method was simple, stable, accurate, and suitable for the analysis of polyphenols and quality control of Docynia Dcne.. Docynia Dcne. is widespread and abundant with polyphenols, but there is a significant difference among species and organs. Accordingly, the plants of this genus have a high value for development and application.

Key words: Docynia Dcne.; polyphenol; Folin-Ciocalteu; improved method; determination

中图分类号：Q946；Q949.91 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）24-0295-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201424057

栘[木衣]是蔷薇科栘[木衣]属植物的通称，有3 个种：云南栘[木衣]（Docynia delavayi (Franch.) Schneid）、栘[木衣]（Docynia indica (Wall.) Dcne.）[1]和长爪栘[木衣]（Docynia longiunguis Q.Luo et J.L.Liu）[2]，主要分布于云贵川等地，当地称为野苹果、野山楂，常用作健胃消食、行气散瘀的食用果实[3-4]。研究显示，栘[木衣]果实中富含生物碱、皂苷、糖、黄酮、强心苷、多酚等生物活性物质，有保健美容等功能[5]。栘[木衣]果实有舒经活血、和脾燥湿、舒肝止痛、清署消毒、降血糖及降血脂等功效[6]。栘[木衣]的茎皮、叶酸涩、凉，可药食两用，树皮熬膏直接入药，可治大面积烧烫伤；鲜树皮和叶捣烂外敷可治骨折，还具有消炎、收敛等药用功效[7-9]；栘[木衣]提取物具有抗氧化的作用，加入烟丝中可降低香烟对人体的危害[10-11]。

植物多酚是一类多羟基的化合物，存在于植物的叶、根、茎和果肉，是植物中含量仅次于纤维素和木质素的最重要次生代谢产物，其具有抗肿瘤、抗氧化、抗过敏、抑菌、防晒、美白、防治心脑血管疾病等多种生理功能[12-14]。目前，对栘[木衣]的研究开发还处于初级阶段，长爪栘[木衣]是近年发现的新种，因此关于栘[木衣]属3 个种植物的基础性研究还很不足，对种属所含的有效成分的研究较少，其中对栘[木衣]多酚的研究也比较少，开发更少，尚未见关于栘[木衣]多酚含量的研究报道。植物多酚的测定方法有很多种[15-17]，最常用的是没食子酸为对照品的Folin-Ciocalteu比色法[18]。课题组前期研究发现栘[木衣]含有根皮苷，因此本实验选择根皮苷为对照品，对传统的Folin-Ciocalteu比色法做了改良，建立一种专属性强的栘[木衣]多酚的测定方法，并用此方法测定3 个不同种栘[木衣]的叶片多酚含量以及长爪栘[木衣]的果皮、果肉、果核、根、根皮和茎等器官部位的多酚含量，考察种间含量的差异性及部位的差异性，为栘[木衣]资源的综合利用和开发提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

云南栘[木衣]的叶，2013年9月采于云南省普洱市；栘[木衣]的叶和长爪栘[木衣]的叶、果实、根和茎，2013年9月采于四川省西昌市，各样品经西昌学院罗强教授鉴定，符合各物种的特征。

Folin-Ciocaileus试剂（FC试剂） 上海如吉生物科技有限公司；根皮苷标准品（HPLC测定＞98%）
四川省成都市植标化纯有限公司；乙醇、无水Na2CO3等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-1700紫外分光光度计 日本岛津公司；Wizard 2.0真空冷冻干燥箱 美国VirTis公司；B-260恒温水
浴锅 上海亚荣生化仪器厂；KQ5200DE超声波清洗仪 昆山超声仪器有限公司；BP211D电子天平 德国赛多利斯公司。

1.3 方法

1.3.1 储备液与样品提取液的制备

根皮苷储备液：精确称取25.04 mg根皮苷标准品，用体积分数70%乙醇溶解后定容至50 mL，即得到质量浓度500.8 µg/mL的储备液。

样品处理：分别取3 种栘[木衣]的叶片以及长爪栘[木衣]的茎、根和根皮，清水清洗，60℃烘干，研磨，备用。将长爪栘[木衣]果实的果皮、果肉和果核分开，冷冻干燥后，研磨，备用。

制备栘[木衣]多酚的提取液：称取1.00 g预处理的样品粉末，加20 mL体积分数70%乙醇，室温、200 W、40 KHz超声提取30 min、过滤。提取3 次，合并滤液。滤液浓缩，用体积分数70%乙醇定容至25 mL，得样品的提取液。

1.3.2 选择Folin-Ciocalteu比色法的测定条件

1.3.2.1 检测波长的选取

分别准确移取根皮苷储备液、云南栘[木衣]叶片提取液各0.5 mL，均加入7.5 mL蒸馏水、0.5 mL FC试剂，摇匀后静置1 min，分别再加入1.5 mL质量分数20% Na2CO3溶液，摇匀，75℃保温10 min，迅速冷却至室温，以体积分数70%乙醇0.5 mL为空白，用紫外-可见分光光度计在200～800 nm波长范围进行显色前、后的扫描，确定最佳测定波长。

1.3.2.2 确定反应的温度

准确移取0.5 mL根皮苷储备液于各比色管，加7.5 mL蒸馏水、0.5 mL FC试剂，摇匀后静置1 min，再加1.5 mL 质量分数20% Na2CO3溶液，摇匀，分别在25、35、45、55、65、75℃和85℃水浴保温10 min，迅速冷却至室温，在760 nm波长处测得吸光度，考察反应温度对显色效果的影响，确定最佳反应温度。每个处理重复3 次。

1.3.2.3 确定反应的时间

准确移取0.5 mL根皮苷储备液于各比色管，加7.5 mL蒸馏水、0.5 mL FC试剂，摇匀后静置1 min，加1.5 mL质量分数20% Na2CO3溶液，摇匀，在55℃水浴分别保温3、5、7、10、15、20 min和25 min，迅速冷至室温，在760 nm波长处测得吸光度，每个处理重复3 次，考察反应时间对显色效果的影响，确定最佳反应时间。

1.3.2.4 确定显色体系中Na2CO3的质量分数

准确移取0.5 mL根皮苷储备液于各比色管，加7.5 mL蒸馏水、0.5 mL FC试剂，摇匀后静置1 min，分别加质量分数5%、10%、15%、20% Na2CO3溶液各1.5 mL，摇匀后55℃保温7 min，迅速冷却至室温，在760 nm波长测定吸光度，确定最佳Na2CO3溶液浓度。每个处理重复3 次。

1.3.2.5 确定显色体系中各试剂的用量

最佳Na2CO3溶液用量：准确移取0.5 mL根皮苷储备液于各比色管，分别加8.5、8.0、7.5、7.0、6.5、6.0、5.5 mL蒸馏水，均加入0.5 mL的FC试剂，摇匀静置1 min，对应加0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL质量分数10% Na2CO3溶液，混匀后55℃保温7 min，迅速冷却至室温，在760 nm波长处测定吸光度，分析Na2CO3溶液用量对比色测定的影响，确定FC试剂与Na2CO3溶液的最佳比例。每个处理重复3次。

FC试剂用量：准确移取0.5 mL根皮苷储备液于各比色管，分别加8.25、6.5、5.75、3.5 mL蒸馏水，分别加0.25、0.5、0.75、1.0 mL FC试剂，混匀后，按照FC试剂-Na2CO3溶液（1∶5，V/V），再加相应体积的质量分数10% Na2CO3溶液，混匀后55℃保温7 min，迅速冷却至室温，在760 nm波长处测得吸光度，确定FC试剂的用量。每个处理重复3 次。

1.3.3 标准曲线的绘制

分别准确移取根皮苷储备液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于7支10 mL容量瓶，用体积分数70%乙醇定容，得不同质量浓度根皮苷的标准溶液。取0.5 mL不同质量浓度根皮苷标准液，加6.5 mL蒸馏水0.5 mL FC试剂，摇匀后静置1 min，再加2.5 mL质量分数10% Na2CO3溶液，摇匀，55℃保温7 min，迅速冷却至室温，在760 nm波长处测定吸光度。以根皮苷质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标进行线性拟合，得根皮苷标准曲线。

1.3.4 FC法测定栘[木衣]多酚的方法学评价

精密度：分别准确移取根皮苷低、中、高质量浓度的标准溶液各0.5 mL，按1.3.3节方法处理后测定吸光度，计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），对该分析方法的精密度进行评价。

重复性：准确称取1.00 g云南栘[木衣]叶的粉末6 份，按1.3.1节方法进行样品前处理，在1.3.3节条件下测定吸光度，计算多酚含量及结果的RSD，对该分析方法的重复性进行评价。

稳定性：准确移取云南栘[木衣]叶提取液0.5 mL，按1.3.3节的方法处理。分别测定样品液反应后0、1、2、3、4、5、6、7 h后的吸光度，计算RSD，分析该测定方法在一定时间内的稳定性。

加标回收率：准确称取6份云南栘[木衣]叶的粉末样品，各0.5 mg，置10 mL容量瓶，再分别精密加入根皮苷标准溶液（30.05 µg/mL）1、2 mL各3 份，按1.3.1节方法提取，按1.3.3节条件处理后，测定吸光度，计算多酚含量，以总检出量减去样液含量再除以加标量计算回收率，再计算RSD。

1.3.5 样品中多酚含量的测定

准确移取按1.3.1节方法制备的各样品溶液0.5 mL，分别加6.5 mL蒸馏水和0.5 mL FC试剂，摇匀后静置1 min，再加2.5 mL质量分数10% Na2CO3溶液，混匀后55℃保温7 min，迅速冷至室温，在760 nm波长处测吸光度。将吸光度带入回归方程，计算多酚质量浓度，根据下列公式计算样品的总多酚含量。

式中：ρ为样液中多酚质量浓度/（µg/mL）；V为样液的体积/mL；m为叶子质量/g；n为稀释倍数。

1.4 统计与分析

实验数据用SPSS 17.0软件处理，组间比较用方差分析，多重比较用最小显著差数（least significant difference，LSD）法。

2 结果与分析

2.1 选择FC比色法的测定条件

2.1.1 检测波长的选取

对根皮苷溶液、云南栘[木衣]叶的提取液，分别进行显色前、后的全波长扫描，结果见图1、2。

a.显色前；b.显色后。

图 1 根皮苷（A）、云南栘[木衣]叶提取液（B）显色前后的光谱比较

Fig.1 Spectra of phlorizin standard (A) and leaf extract from
Docynia Dcne. (B) before and after colorization

从图1可以看出：根皮苷标准溶液和样品溶液，显色前均在295 nm波长处有最大吸光度，显色后，最大吸收波长范围为740～765 nm，并基本位于波长760 nm处，所以，选择760 nm为比色波长。

2.1.2 反应温度的确定

多酚物质与FC试剂反应需要一定的温度，过高或过低的温度都不利于反应的进行。不同温度条件下测定吸光度，见图2。

图 2 反应温度变化对吸光度的影响

Fig.2 Effect of reaction temperature on polyphenols determination

从图2可知，反应温度为25～55 ℃范围时，吸光度缓慢上升，统计分析表明，各温度间的吸光度有显著差异（P＜0.05）。温度超过55 ℃后，吸光度开始明显下降，这可能是因为在55 ℃后，随反应温度的升高，碱性条件中根皮苷与酚试剂生成的蓝色络合物的性质变得不稳定而被分解的原因。因此，测定温度条件选择55 ℃。

2.1.3 反应时间的确定

图 3 反应时间变化对吸光度的影响

Fig.3 Effect of reaction time on the determination of polyphenols

由图3可知，反应时间对吸光度影响比较大，在3～7 min内，随时间延长吸光度逐渐增大，10 min时吸光度开始降低，在10～25 min随着反应时间的延长吸光度显著降低，这可能是加热时间长导致根皮苷与酚试剂在碱性环境中所生成的络合物变得不稳定。因此，选择反应加热时间为7 min。

2.1.4 显色体系中Na2CO3质量分数的确定

图 4 Na2CO3质量分数变化对吸光度的影响

Fig.4 Effect of sodium carbonate concentration on
the determination of polyphenols

Na2CO3为FC比色法测定多酚反应提供碱性环境，FC试剂与多酚在碱性环境中生成蓝色络合物。由图4可知，当Na2CO3质量分数10%时，在760 nm波长处的吸光度最大，之后随着Na2CO3质量分数的增大吸光度开始降低。分析原因，可能是反应体系中碱液质量分数的增大抑制了络合物的形成。因此，选择Na2CO3溶液质量分数为10%。

2.1.5 显色体系中各试剂用量的确定

改变FC试剂与质量分数10% Na2CO3的比例，用以确定根皮苷与FC试剂反应所需碱环境的强弱，即FC试剂与Na2CO3的最佳比例，见图5。

图 5 试剂用量变化对吸光度的影响

Fig.5 Effect of reagent dosage on the determination of polyphenols

从图5可看出，当FC试剂加入量不变时，Na2CO3由0.5～1.0 mL，吸光度明显增大，之后，随着Na2CO3量的增大，吸光度呈缓慢上升的趋势，当Na2CO3加入量达到2.5 mL，
即V（FC试剂）∶V（10% Na2CO3）=1∶5时，吸光度最大，之后，趋于平稳。综合考虑，选择最佳10% Na2CO3加入量为2.5 mL，FC试剂与质量分数10% Na2CO3最佳体积比为1∶5。

变化显色体系中酚试剂的用量，同时按1∶5比例变化Na2CO3用量时，当FC试剂加入体积0.75 mL，10% Na2CO3加入体积3.75 mL时，显色体系中有白色沉淀出现，随着FC试剂加入量的增大，沉淀随之增多，这可能是因为显色体系中Na2CO3过量，多余的Na2CO3与其他物质发生了反应。因此，选择加入FC试剂的量为0.5 mL比较合适。

2.2 根皮苷溶液的标准曲线

根据上述优化的测定条件，制作根皮苷溶液标准曲线，得到线性方程：y=0.067 3x＋0.038 9、R2=0.999 1，表明当根皮苷质量浓度在1.252～15.024 µg/mL范围时，质量浓度与其对应吸光度呈良好的线性关系，可以用于总多酚含量的测定。

2.3 FC比色法测定栘[木衣]多酚的方法学评价

表 1 精密度实验的结果

Table 1 Results of precision experiments

分别用不同的样品对测定方法的精密度、重复性、稳定性、加标回收率进行考察。以根皮苷标准溶液为测定样品，对测定方法进行精密度实验，结果见表1。

由表1可以看出，用根皮苷标准溶液的低、中、高3 个质量浓度，分别重复测定6 次，测定值的RSD分别为0.236%、0.053%、0.067%，表明该测定方法的精密度良好。

以云南栘[木衣]预处理样品为测定样品，对测定方法进行重复性实验，结果见表2。可以看出，重复测定的云南栘[木衣]预处理样品，平均值为13.45 g/100 g，测定值的RSD为1.63%，表明该方法的重复性良好。

表 2 重复性实验

Table 2 Results of repeatability experiments

以云南栘[木衣]预处理样品为测定样品，对该测定方法进行稳定性实验，结果见表3。可以看出，待测云南栘[木衣]预处理样品溶液，在反应结束后7 h内，RSD为0.30%。在前60 min内，该方法测得的吸光度基本保持不变（RSD为0.04%），表明该方法的稳定性良好。

表 3 稳定性实验

Table 3 Results of stability experiments

以云南栘[木衣]预处理样品为测定样品，加标回收率实验，结果见表4。可以看出，6 次加标的平均回收百分率为100.08%，RSD为2.43%，表明该方法准确可靠，可用于栘[木衣]中多酚含量的测定。

表 4 加标回收率实验

Table 4 Results of recovery experiments with spiked samples

2.4 测定和比较植物中多酚的含量

2.4.1 3 种栘[木衣]及苹果的多酚含量的测定与比较

对栘[木衣]属中的3 个种及同科的苹果，分别测定叶所含多酚的量，结果见表5。

表 5 栘[木衣]属不同种及苹果的叶中多酚含量比较

Table 5 Polyphenol contents in leaves of different species of
Docynia Dcne. and apple

注：肩标不同大写字母表示样品间差异极显著（P＜0.01）。

由表5可知，栘[木衣]属植物均富含多酚类物质，3 个种的叶中多酚含量均在10 g/100 g以上，按干质量计，长爪栘[木衣]叶中多酚含量最高（25.35 g/100 g），栘[木衣]叶中多酚含量次之（17.87 g/100 g），云南栘[木衣]叶中多酚含量最少（12.55 g/100 g）。统计分析表明，3 个种的植物叶中多酚含量存在极显著的差异性
（P＜0.01），长爪栘[木衣]的多酚含量是云南栘[木衣]的2 倍。

赵艳敏等[19]的研究发现，同属蔷薇科的苹果，其叶中也含根皮苷。所以，本实验同时用优化测定方法对苹果叶的多酚进行测定，得到其多酚含量为（6.80±0.45）g/100 g。
与栘[木衣]属植物比较，3 种栘[木衣]叶的多酚含量均远高于苹果叶中多酚的含量，含量最低的云南栘[木衣]是其2 倍，含量高的长爪栘[木衣]是其4 倍。

2.4.2 长爪栘[木衣]不同器官多酚含量的测定与比较

在3 种栘[木衣]的叶中，长爪栘[木衣]的多酚含量最高，因此，进一步对长爪栘[木衣]各器官的多酚含量进行测定与比较，结果见表6。

表 6 长爪栘[木衣]不同器官多酚含量比较

Table 6 Polyphenol contents in different organs of Docynia longiungui

由表6可以看出，长爪栘[木衣]各器官均含有多酚，多酚的含量由低到高依次为，果核、根、果肉、根皮、果皮、茎、叶。多酚含量最高的是叶，为（25.35±2.42）g/100 g，次之的是茎，为（10.60±1.01）g/100 g，果皮为（8.57±0.45）g/100 g，根皮为（7.70±0.14）g/100 g；果核、根和果肉中的含量较低。

统计分析表明：长爪栘[木衣]各器官中，叶中多酚含量远高于其他器官；茎、果皮、根皮、果肉中多酚含量的差异性极显著（P＜0.01）；果核与根间的差异性不显著（P＞0.05），长爪栘[木衣]各器官多酚含量的高低顺序是：叶＞茎＞果≈根。同一器官中，不同部位的含量也有明显差异，果皮的多酚含量高于果肉的，果肉的又高于果核的；根皮的含量高于根的。因此，栘[木衣]多酚的分布在各器官、同一器官的不同部位均有显著的差异性。

3 讨 论

目前用于测定植物多酚含量的传统FC比色法，是以没食子酸为对照品，没有考虑样品中是否含有没食子酸，或没食子酸是否是特征性化合物，因此，在测定不同样品多酚含量时有一定的缺陷。根据课题组前期研究结果[20]，可知栘[木衣]中含有根皮苷，所以选择其为标准品，对于该样品的多酚测定具有很强的专属性。由于对照品的改变，对传统FC比色法的条件进行优化，并进行方法学的考察。结果表明，优化的FC比色法具有快速、准确、简便、稳定和高灵敏的特点，可快速测定栘[木衣]中多酚的含量，可否用于其他含根皮苷植物的多酚含量测定，有待进一步的研究。

对栘[木衣]属3 个物种的多酚含量进行测定和比较，结果表明，栘[木衣]属植物富含多酚，其叶的多酚含量高达10 g/100 g以上，明显比其他植物的高[21-22]。栘[木衣]属的植物间多酚的含量差异性极显著，这很可能是由于栘[木衣]属种间遗传基因及土壤、气候等环境因子的差异性导致的[23]。对长爪栘[木衣]的不同部位，其多酚含量差异性显著，此与对石榴[24]、丹参[25]等植物中特征性物质的差异性研究，结论相似。测定和比较栘[木衣]属3 个物种的多酚含量，对合理利用和综合开发此植物提供了有力的理论依据。

栘[木衣]属3 个种为常绿或半常绿乔木，抗逆性强，可在贫瘠的土壤生长，是兼具观赏价值和药食价值的植物资源[26-28]。栘[木衣]的资源丰富，目前，云南栘[木衣]在云南普洱市作为野生果树进行栽培和利用，但仅限于鲜果销售及果实的初加工，其他两种栘[木衣]还处于野生状态，未进行开发。栘[木衣]果实具有良好的保健功能，这可能与其富含多酚物质有关。研究结果已知，栘[木衣]叶、茎的多酚含量远高于果实，因此，栘[木衣]叶是潜在的多酚资源，其叶片一年四季均可采集，资源量大，可用于提取多酚类物质，开发抗氧化、抑菌等的功能食品[29-30]。

本实验确立了栘[木衣]多酚的测定方法，比较了栘[木衣]属植物的多酚含量，本研究有助于对该属植物系统、合理、全面的开发利用，同时也拓宽了提取多酚类物质的资源植物。

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