固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法测定
牛乳和猪肉中5 种青霉素类抗生素

刘莉萍

（深圳职业技术学院，广东 深圳 518055）

摘 要：建立一种用固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法检测牛乳和猪肉中苄星青霉素G、氨苄西林、苯唑西林、氯唑西林、双氯西林5种青霉素类抗生素方法。样品经乙腈提取，Bond Elut C18固相萃取柱净化，用高效液相色谱-串联质谱检测，外标法定量。结果表明，本方法5 种青霉素在2.0～200 μg/L范围内呈良好线性关系，线性相关系数大于0.999；牛乳样品添加回收实验，回收率为85.2%～122.7%，相对标准偏差为3.43%～16.8%（n=6）；猪肉样品添加回收实验在50 μg/kg和100 μg/kg添加水平，除氨苄西林外，回收率在94.3%～116.4%，相对标准偏差为1.62%～5.09%（n=6）。方法定量限为1.0～2.0 μg/kg。该方法具有简便快捷、准确度高、定量限低的优点，适用于牛乳和猪肉中青霉素类抗生素的测定。

关键词：固相萃取；高效液相色谱-串联质谱；青霉素；牛乳；猪肉

Determination of 5 Penicillin Residues in Milk and Pork by SPE-HPLC-MS-MS

LIU Li-ping

(Shenzhen Polytechnic, Shenzhen 518055, China)

Abstract: A method was established for the determination of 5 penicillin residues in milk and pork by solid-phase extraction and high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (SPE-HPLC-MS-MS). The samples were extracted with acetonitrile, purified on a Bond Elut C18 column by solid-phase extraction, and finally detected by HPLC-MS-MS and quantified by an external standard method. As a result, the method showed a good linearity with a correlation coefficient higher than 0.999 in the range from 2.0 to 200 μg/L for 5 penicillin compounds. The average recoveries of these five penicillins in milk were in the range of 85.2% to 122.7% with relative standard deviations (RSDs) of 3.43% to 16.8% (n = 6). As for pork samples spiked at 50 and 100 μg/kg, the average recoveries were between 94.3% and 116.4% except for ampicillin with RSDs of 1.62% to 5.09%. The limit of quantification (LOQ) was in the range of 1.0–2.0 μg/kg. In conclusion, the method is convenient, rapid, accurate and sensitive so that it can be applied to determinate penicillin residues in milk and pork.

Key words: solid-phase extraction; high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS-MS); penicillins; milk; pork

中图分类号：TS207.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）24-0308-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201424059

青霉素类抗生素主要用于治疗革兰氏阳性菌引起的各种感染，因高效低毒，成本低，在畜禽中广泛应用。据文献[1]报道，青霉素可产生各种过敏反应，严重的会引发过敏性休克，同时还能产生耐药性，对人体健康造成严重危害。因此世界各国对青霉的最大残留量（maximum residue limits，MRL）均提出了限量要求[2-3]，
我国农业部规定食用动物组织中氨苄青霉素的MRL均为50 μg/kg；美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）规定青霉素类抗生素在各类农产品中的MRL不超过5 μg/kg。青霉素类抗生素的分析方法主要有微生物法[4]、免疫分析法[5-7]、电化学分析法[8]、光学分析法[9-11]、毛细管电泳法[12]、高效液相色谱法[13-14]和液相色谱-质谱联用法[15-22]，其中高效液相色谱-质谱联用因可弥补其他方法准确定性、高灵敏检测的困难，而成为国际上广泛采用的青霉素类抗生素分析方法。本实验采用固相萃取-高效液相色谱-串联质谱（solid-phase extraction and high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，SPE-HPLC-MS-MS）法同时检测牛乳和猪肉中青霉素类抗生素残留，方法简便快捷、定量限低，完全能满足兽残分析要求。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲醇、乙腈（均为色谱纯）；磷酸二氢钠、正己烷、磷酸、氢氧化钠、乙酸铵、氯化钠（均为分析纯）。

青霉素类抗生素标准品：氯唑西林、双氯西林、苄星青霉素G、氨苄西林和苯唑西林（纯度为96%～99%） 德国Riedel-Dehaen公司；苄青霉素-D7 德国Dr. Ehrenstorfer公司。

1.2 仪器与设备

API 3000液相色谱-质谱仪（配有电喷雾离子源和1100高效液相色谱仪） 美国应用生物系统公司；LV型吹氮浓缩仪 美国Zymark公司；Minishaker MS1型旋涡混合器 德国IKA公司；UNIVERSAL 32R型低温离心机 德国Hettich公司；4000旋转蒸发仪 德国
Heidolph公司；TF-123组织切碎机 日本Hitachi公司；POLYGRON PT3000型均质器 德国Brinkmann公司；Bond Elut C18固相萃取柱（500 mg，6 mL） 美国Varian公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

0.15 mmol/L磷酸缓冲溶液（pH 8.5）：准确称取0.018 g磷酸二氢钠，用去离子水溶解，并使溶液总体积达到约950 mL，然后用磷酸或氢氧化钠溶液调节pH值至8.5，用去离子水定容至1 000 mL。

1∶1乙腈溶液：500 mL乙腈与500 mL去离子水等体积混合。

标准贮备溶液（100 mg/L）：分别称量经折算相当于10 mg（精确到0.1 mg）的各种青霉素标准品，用乙腈-水（50∶50，v/v）溶液溶解，定容至100 mL。此溶液各种青霉素质量浓度分别为100 mg/L。溶液可在－18 ℃条件下避光保存6 个月。

标准使用溶液（1 mg/L）：准确吸取1.00 mL标准贮备溶液至100 mL容量瓶中，用乙腈-水（50∶50，v/v）溶液定容。此溶液各种青霉素质量浓度分别为1 mg/L。溶液可在4 ℃条件下避光保存1 个月。

标准工作溶液：用20 mmol/L磷酸缓冲溶液（pH 7.0）配制质量浓度分别为0、5、10、50、100、200 mg/L青霉素标准工作溶液（现用现配）。

1.3.2 色谱条件

色谱柱：SunFireTM C18（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）；柱温30 ℃；进样量20 mL；流速0.3 mL/min；流动相A为乙腈，流动相B为5 mmol/L乙酸铵溶液（pH 4.5），梯度洗脱程序：0～10.0 min，5%～80% A；10.0～11.0 min，80%～90% A；11.0～12.0 min，90% A；12.0～13.0 min，90%～5% A；13.0～18.0 min，5% A。

1.3.3 质谱条件

电喷雾离子源；正离子扫描；多反应监测；喷雾电压：4 000 V；离子源温度：450 ℃；雾化气流量：
11.00 L/min；气帘气流量：11.00 L/min；碰撞气流量：5.00 L/min；射入电压：10.00 V。其他质谱参数见表1。

表 1 5种青霉素类抗生素的质谱分析参数

Table 1 Mass spectrometric parameters for analysis of 5 penicillins

1.3.4 样品处理

1.3.4.1 猪肉试样

取代表性猪肉样品（应尽量避免取脂肪部分），用组织切碎机搅碎，均质处理。准确称取均质良好的样品2 g（精确到0.01 g）于15 mL具塞离心管中，加入苄青霉素-D7内标50 μg/kg，再加入2 mL磷酸缓冲溶液（50 mmol/L）和8 mL乙腈，涡旋2 min，在低于10 ℃条件下2 500×g离心10 min。上层清液转移到另一干净的50 mL具塞离心管中，分别加入8、5 mL乙腈进行提取，合并提取液。

1.3.4.2 牛乳试样

准确取5 mL牛乳样品于50 mL具塞离心管中，称量和记录其质量。加入内标苄青霉素-D7 4 μg/kg，再加入5 mL 磷酸缓冲溶液（50 mmol/L）和30 mL乙腈，涡旋2 min，在低于10 ℃条件下2 500×g离心10 min。取20 mL上清液到另一个干净的50 mL具塞离心管中，注意不要混入析出的乳脂肪。

1.3.5 样品的净化

在提取液中加入10 mL正己烷，涡旋2 min，以5 000 r/min
离心5 min，去除上层有机相，正己烷重复去脂一次。于45 ℃水浴旋蒸至约5 mL，加入5 mL 0.15 mol/L
磷酸缓冲溶液（pH 8.5），混合均匀。

取Bond Elut C18固相萃取柱，依次用3 mL甲醇、3 mL水处理和3 mL磷酸缓冲溶液平衡。当溶剂液面达到小柱吸附层表面时，立即将上述提取液加入萃取柱中（以1 mL/min流速），依次用3 mL 50 mmol/L磷酸缓冲溶液（pH 8.0）和3 mL水洗柱，最后用3 mL乙腈-水（1∶1，v/v）洗脱，定容至5.0 mL。过0.22 mm滤膜供HPLC-MS-MS分析。

2 结果与分析

2.1 提取液的选择

选择去离子水、4%氯化钠溶液和磷酸二氢钠缓冲液（0.15 mol/L）作为提取液，5 种青霉素测定回收率实验，结果见表2。

表 2 不同提取液对5 种青霉素回收率的影响

Table 2 Effects of different extractants on recoveries of 5 penicillins

%

由表2可见，选择去离子水和4%氯化钠溶液作为提取液时，氨苄西林的回收率小于30%，其他4 种青霉素的回收率均在87%～101%之间，故此应选用磷酸二氢钠缓冲液作为5种青霉素提取液。

由于磷酸二氢钠缓冲溶液浓度和pH值对氨苄西林回收率的影响较大，分别比较磷酸二氢钠浓度和pH值对氨苄西林回收率的影响，见表3。

表 3 不同浓度磷酸二氢钠缓冲溶液和pH值对氨苄西林回收率的影响

Table 3 Effect of buffer concentration and pH on recoveries of ampicillins

注：*.磷酸二氢钠缓冲溶液浓度为0.15 mol/L。

由表3可见，磷酸二氢钠浓度在0.03～0.1 mol/L之间，回收率和重复性不好；当磷酸二氢钠浓度大于0.17 mol/L时，峰形变宽，流速减慢。本方法选择0.15 mol/L的磷酸二氢钠缓冲溶液作为提取液，pH值为8.5。

2.2 固相萃取柱及洗脱条件的选择

2.2.1 固相萃取柱的选择

分别选用Oasis HLB固相萃取柱、Bond Elut C18固相萃取柱、ENVI-18固相萃取柱、Octadecyl C18固相萃取柱、LiChrolut EN固相萃取柱和Sep-Pak C18固相萃取柱对5 种青霉素类抗生素的提取效率和净化效果进行比较，结果表明：Bond Elut C18固相萃取柱提取效率和净化效果较好，重复性好；ENVI-18固相萃取柱、Octadecyl C18固相萃取柱、LiChrolut EN固相萃取柱和Oasis HLB固相萃取柱回收率均良好，但样品溶液过柱速度较慢，样品预处理时间长，不同批次之间回收率有显著差异；Sep-Pak C18固相萃取柱回收率小于60%，净化效果不理想。本方法选用Bond Elut C18固相萃取柱净化样品。

2.2.2 洗脱条件的选择

本方法选用乙腈-水（1∶1，v/v）为固相萃取样品洗脱剂，比较不同用量洗脱剂对5 种青霉素回收率的影响，见表4。

表 4 乙腈-水洗脱剂用量对5种青霉素回收率的影响

Table 4 Effect of elution with different amounts of acetonitrile-water on recoveries of 5 penicillins

%

由表4可见，当洗脱剂用量小于3 mL时，氨苄西林的回收率偏低，其他4 种青霉素的回收率为82.0%～94.0%；当洗脱剂用量为3 mL时，5种青霉素回收率为95.6%～102.2%，满足工作要求。洗脱剂用量为4 mL时，5 种青霉素回收率没有显著提高。因此，本方法使用3 mL乙腈-水（1∶1，v/v）作为固相萃取柱的洗脱剂。

2.3 液相色谱分析柱的选择

分别使用μBondapak C18（300 mm×4.0 mm，10 μm）色谱柱和SunFireTM C18（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）色谱柱对5 种青霉素分析进行比较。实验发现，这两种色谱柱的灵敏度均能满足要求，但μBondapak C18色谱柱对氯唑西林分离度不如SunFireTM C18色谱柱好。μBondapak C18柱流速在1.5 mL/min时，进质谱仪之前必须分流，但分流时对5种青霉素结果的测定会产生一定误差；而使用SunFireTM C18柱则不需分流，定量准确度优于μBondapak C18柱。本方法选用SunFireTM C18（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）色谱柱为5 种青霉素的分析柱。

2.4 线性范围和方法定量限

配制含苯唑西林质量浓度为1.0～200 μg/L；苄星青霉素G、氨苄西林、氯唑西林、双氯西林质量浓度分别为2.0～400 μg/L的样品基质混合标准溶液。在选定的条件下进行测定，进样量为20 μL，以各青霉素与苄青霉素-D7峰面积之比为纵坐标，各青霉素质量浓度为横坐标进行线性回归分析。采用空白样品中添加青霉素抗生素的方法，以RSN不小于10的方法确定定量限，5 种青霉素的线性方程、相关系数和定量限见表5。

表 5 5种青霉素线性方程、相关系数和定量限

Table 5 Linear equations, correction coefficients and LOQs for 5 penicillins

2.5 方法的回收率和精密度

用空白样品进行加标回收率和和精密度实验，样品中添加3 个不同水平的5 种青霉素后，按本方法提取和净化，用HPLC-MS-MS进行测定，其回收率和精密度结果见表6。

表 6 牛乳和猪肉中5 种青霉素加标回收率和精密度（n=6）

Table 6 Recoveries and precision (RSDs) of 5 penicillins from spiked milk and pork (n = 6)

由表6可见，对于牛乳样品，2、4 μg/kg和8 μg/kg添加水平5 种青霉素加标回收率在85.2%～122.7%之间，相对标准偏差均在3.43%～16.8%之间；对于猪肉样品，5 μg/kg添加水平，5 种青霉素加标回收率均较低；
50 μg/kg和100 μg/kg添加水平，除氨苄西林外，回收率为94.3%～116.4%，相对标准偏差均在1.62%～5.09%，符合兽药残留分析要求。

3 结 论

猪肉组织的基质非常复杂，其中的微量青霉素很难检测。本实验采用SPE-HPLC-MS-MS分析技术建立了牛乳和猪肉中5 种青霉素类抗生素残留的检测和确证方法，该方法适用于牛乳和猪肉中青霉素类抗生素的定量检测。

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