凝胶过滤色谱法测定3种不同来源多肽的
相对分子质量分布

蒋腾川1,宋新波1,2,*,张丽娟1

(1.天津中医药大学研究生院,天津 300193;2.天津中一制药有限公司,天津 300193)

 

摘 要:目的:建立凝胶过滤色谱法测定多肽(如大豆肽、白蛋白多肽、羊胎盘多肽)的相对分子质量分布的方法。方法:采用TSK-GEL G2000SWXL色谱柱(300 mm×7.8 mm,5 μm)、流动相为乙腈-水-三氟乙酸(15850.07,
V/V)、流速0.6 mL/min、柱温30 ℃、进样体积10 μL、检测波长220 nm。结果:在相对分子质量189.1~12 355之间,相对分子质量对数与保留时间呈线性关系,相关系数为0.995 6,方法精密度、重复性、稳定性良好,准确度高。结论:本方法操作简便快速、灵敏度高、重复性好,适用于多肽类物质相对分子质量分布的检测。

关键词:凝胶过滤色谱法;大豆;白蛋白;羊胎盘;多肽;相对分子质量

 

Determination of Relative Molecular Weight Distribution of Polypeptides from Three Different Sources by
Gel Filtration Chromatography

 

JIANG Teng-chuan1, SONG Xin-bo1,2,*, ZHANG Li-juan1

(1. Graduate School, Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China;

2. Tianjin Zhongyi Pharmaceutical Co. Ltd., Tianjin 300193, China)

 

Abstract: Objective: To establish a method to determine the relative molecular weight distribution of soy peptide, albumin polypeptide and sheep placenta polypeptide using gel filtration chromatography (GFC). Methods: TSK-GEL G2000SWXL (300 mm × 7.8 mm, 5 μm) column was equilibrated with a mobile phase composed of acetonitrile-water-trifluoroacetic acid (15:85:0.07, V/V) at a flow rate of 0.6 mL/min. The column temperature was 30 ℃ and the injection volume was 10 μL. The detection wavelength was 220 nm. Results: A linear relationship between the logarithm of relative molecular weight and retention time was achieved in the relative molecular weight range of 189.1–12 355 with a correlation coefficient of 0.995 6. The precision, repeatability, stability and accuracy of the GFC method were good. Conclusion: This method is simple, rapid, sensitive, and reproducible for the determination of the relative molecular weight distribution of polypeptides.

Key words: gel filtration chromatography; soybean; albumin; sheep placenta; polypeptides; relative molecular weight

中图分类号:O657.7 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2014)24-0312-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201424060

多肽是相对分子质量介于氨基酸与蛋白质之间的一类物质,其吸收机制与游离氨基酸相比,具有耗能低、转运速度快、载体不易饱和等优点,是当今保健食品领域和生物医药领域的研究热点之一[1]。传统观点认为蛋白质在体内需经蛋白酶、肠内菌群等作用完全消化为氨基酸才可以被吸收。随着蛋白质多肽类物质消化吸收代谢的深入研究,科学家们发现由蛋白质水解得到的小肽(一般认为是二肽、三肽)可被机体完整转运,此后有研究[2-3]表明4个以上氨基酸残基组成的寡肽也能被机体直接吸收。
吴冬梅等[4]对多种多肽在大鼠离体小肠中的吸收情况进行了研究,认为被吸收肽的相对分子质量多在1000以内。多肽除了具有良好的吸收特性外,还具有众多的生理活性,如抗菌、抗氧化、抗疲劳、调节免疫、血管紧张素转换酶抑制作用[5-9]。多肽的相对分子质量与其生理活性密切相关[10],是多肽类产品质量控制的关键因素之一,这就需要建立一种能有效测定多肽相对分子质量的方法。

测定相对分子质量的方法有多种,如超滤法[11]、凝胶电泳法[12]、凝胶过滤色谱法[13-14]、质谱法[15-16]等。其中超滤法只能较为粗略地测定相对分子质量分布,在分离纯化部分应用较多;凝胶电泳法存在操作繁琐、重现性差的缺点[17],且对小肽的相对分子质量测定有很大的局限性,适用于蛋白质、多肽相对分子质量分布研究的初期阶段;质谱法能较为精确地测定分子质量分布,但设备昂贵,不宜做常规分析手段[18];凝胶过滤色谱法具有操作简便快速、重复性好、精确度高的特点[19-20],已广泛应用于测定多肽、多糖等大分子物质的相对分子质量及其分布[21-23]。本实验采用凝胶过滤色谱法来测定大豆肽、白蛋白多肽、羊胎盘多肽的相对分子质量,旨在为同类产品的生产制备和质量控制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

相对分子质量标准物质:细胞色素C(Mr 12355)、胰蛋白酶抑制剂(Mr 6511)、人血管紧张素Ⅱ(Mr 1045.5)、乙氨酰乙氨酰酪氨酰精氨酸(Mr 451.2)、乙氨酰乙氨酰乙氨酸(Mr 189.1) 中国计量科学研究院;大豆肽(编号:SS12204)、白蛋白多肽(编号:SS12265) 武汉天天好生物制品有限公司;羊胎盘
多肽 实验室自制;乙腈(色谱纯) 赛默飞世尔科技(中国)有限公司;其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

LC-20AD高效液相色谱仪(配有SPD-10A紫外检测器、CTO-10A柱温箱) 日本岛津公司;TSK-GEL G2000SWXL色谱柱(300 mm×7.8 mm,5 μm) 东曹
(上海)生物科技有限公司;AL204型电子天平 瑞士
Mettler-Toledo公司;Milli-Q超纯水系统仪 美国Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 相对分子质量标准物质溶液的配制

分别精密称取相对分子质量标准物质细胞色素C、胰蛋白酶抑制剂、人血管紧张素Ⅱ、乙氨酰乙氨酰酪氨酰精氨酸、乙氨酰乙氨酰乙氨酸适量,加超纯水溶解配成2.5 mg/mL的溶液。按11(V/V)的比例将上述溶液混合后摇匀,制成0.5 mg/mL的标准物质溶液,用0.45 µm的滤膜过滤备用。

1.3.2 供试品溶液的配制

分别精密称取各样品适量,加超纯水溶解配成5.0 mg/mL的溶液,用0.45 µm的滤膜过滤备用。

1.3.3 色谱条件

色谱柱:TSK-GEL G2000SWXL(300 mm×
7.8 mm,5 μm);流动相为乙腈-水-三氟乙酸(15850.07,
V/V);流速0.6 mL/min;柱温30 ℃;进样体积10 μL;检测波长220 nm。

1.4 统计分析

采用SHIMADZU GPC数据处理软件分析色谱图。

1.5 数均相对分子质量和重均相对分子质量的计算[20]

809799.jpg (1)

式(1)中:Ni为第i种分子的物质的量;Mi为第i种分子的分子质量。

809816.jpg (2)

式(2)中:Wi为第i种分子的质量;Mi为第i种分子的分子质量。

2 结果与分析

2.1 色谱柱的考察

851359.jpg 

1.普通批次凝胶色谱柱的分离效果;2.特殊批次凝胶色谱柱的分离效果。

图 1 凝胶色谱柱对混合标准物质的分离

Fig.1 Selection of column for GFC analysis

考察TSK-GEL G2000SWXL凝胶柱(普通批次)和TSK-GEL G2000SWXL凝胶柱(特殊批次)对混合标准物质分离度的影响,结果显示:采用TSKGEL G2000SWXL凝胶柱(普通批次)时混合标准物质不能实现有效分离,如图1中1号色谱图所示,而采用TSKGEL G2000SWXL凝胶柱(特殊批次)时混合标准物质得到有效分离,如图1中2号色谱图所示,其中最小分离度2.75,最小理论塔板数10248.8,最大理论塔板数32146.3。故最后选择TSKGEL G2000SWXL凝胶柱(特殊批次)测定大豆肽、白蛋白多肽、羊胎盘多肽相对分子质量及其分布。

2.2 流动相的考察

821758.jpg 

0.01%~0.08%分别代表流动相中三氟乙酸的体积分数。

图 2 流动相的考察

Fig.2 Optimization of the mobile phase

在流动相中乙腈-水为1585(V/V)的前提下,通过调节流动相中三氟乙酸的体积分数(0.01%~0.08%),考察三氟乙酸对混合标准物质分离度的影响,结果显示(图2)混合标准物质分离度随三氟乙酸的体积分数增大而增大,但考虑到该色谱柱的pH值适用范围为2.5~7.5,三氟乙酸体积分数过大会对色谱柱造成损伤,最后将三氟乙酸的的体积分数定为0.07%。

2.3 标准曲线的绘制

取混合标准物质溶液,进样10μL,记录色谱图,如图3所示。

809869.jpg 

1~5.峰号。

图 3 混合标准物质凝胶过滤色谱图

Fig.3 GFC chromatogram of mixed standards

5种标准物质的保留时间、相对分子质量和相对分子质量对数的关系见表1。

表 1 5种标准物质的保留时间和相对分子质量的对应关系

Table 1 Relationships of retention time with relative molecular weights of five standards

峰号

相对分子质量

标准物质

保留

时间/min

相对分

子质量

相对分子质量

对数(lgM

1

细胞色素C

9.634

12 355

4.092

2

胰蛋白酶抑制剂

11.292

6 511

3.814

3

人血管紧张素Ⅱ

13.749

1 045.5

3.019

4

乙氨酰乙氨酰酪氨酰精氨酸

14.838

451.2

2.654

5

乙氨酰乙氨酰乙氨酸

16.204

189.1

2.277

 

 

以标准物质相对分子质量对数lgM对保留时间t做线性回归,得回归方程为lgM=―0.286t+6.939,相关系数r=0.9956,说明在相对分子质量189.1~12355范围内,5种标准物质相对分子质量对数与保留时间呈良好的线性关系。

2.4 精密度实验

取羊胎盘多肽供试品溶液10 μL,按1.3.3节色谱条件连续进样6 次,测定保留时间为14.8 min左右的主色谱峰的保留时间和峰面积,计算其相对标准偏差分别为0.040%、0.037%,表明方法的精密度良好。

2.5 重复性实验

精密称取羊胎盘多肽供试品6 份,每份25 mg,按1.3.2节制备供试品溶液,按1.3.3节色谱条件分别进样,测定保留时间为14.8 min左右的主色谱峰的保留时间和峰面积,计算其相对标准偏差分别为0.033%、0.273%,表明方法的重复性良好。

2.6 稳定性实验

取羊胎盘多肽供试品溶液10 μL,按1.3.3节色谱条件分别于取样后0、2、4、6、8、18、24 h进样,测定保留时间为14.8 min左右的主色谱峰的保留时间和峰面积,计算其相对标准偏差分别为0.147%、0.255%,表明方法的稳定性良好。

2.7 准确度实验

精密称取相对分子质量标准物质人血管紧张素Ⅱ6份,加超纯水溶解配成0.5 mg/mL的溶液。按1.3.3节色谱条件分别进样分析,通过凝胶过滤色谱法得到的相对分子质量与标准物质已知相对分子质量相对照,基本吻合(表2)。

表 2 准确度实验结果

Table 2 Results of accuracy tests

标准物质序号

1

2

3

4

5

6

测得相对分子质量

1 021

1 021

1 029

1 025

1 020

1 030

已知相对分子质量

1 045

1 045

1 045

1 045

1 045

1 045

相对误差/%

-2.30

-2.30

-1.53

-1.91

-2.39

-1.44

 

 

2.8 样品测定

809891.jpg 

809901.jpg 

809919.jpg 

1~12.峰号。

图 4 大豆肽(A)、白蛋白多肽(B)、羊胎盘多肽(C)
凝胶过滤色谱图

Fig.4 GFC chromatograms of soy peptide (A), albumin polypeptide (B), and sheep placenta polypeptide (C)

按1.3.3节色谱条件分别对大豆肽、白蛋白多肽、羊胎盘多肽进样测定,记录色谱图,如图4所示。采用SHIMADZU GPC数据处理软件分别对以上色谱图进行处理。各样品中一些主要色谱峰的保留时间、重均相对分子质量(Mw)、数均相对分子质量(Mn)、多分散系数d(Mw/Mn)的基本情况如表3所示。

表 3 大豆肽、白蛋白多肽、羊胎盘多肽相对分子质量及其
分布的测定结果

Table 3 Relative molecular weights and distribution of soy peptide, albumin polypeptide and sheep placenta polypeptide

样品名称

峰号

保留

时间/min

重均相对

分子质量

数均相对

分子质量

多分散

系数

大豆肽

4

13.864

935

913

1.02

5

14.948

459

441

1.04

6

16.598

169

162

1.04

7

17.177

94

93

1.01

总计

 

604

125

4.81

 

 

 

 

 

 

白蛋白多肽

3

14.857

479

459

1.04

4

16.518

180

172

1.05

5

17.39

87

86

1.01

6

17.959

58

57

1.02

总计

 

 

328

 

100

 

3.27

 

 

 

 

 

 

 

羊胎盘多肽

5

13.846

986

955

1.03

6

14.969

483

462

1.04

7

16.564

180

170

1.06

总计

 

730

202

3.61

 

 

从表3可知,大豆肽、羊胎盘多肽、白蛋白多肽的重均相对分子质量都在1 000以下,其中大豆肽的重均相对分子质量主要集中在169~935之间、羊胎盘多肽的重均相对分子质量主要集中在180~986之间,而白蛋白多肽的重均相对分子质量相对较小。

3 讨 论

根据凝胶过滤原理,同一类型化合物的保留时间与组分的相对分子质量有关,大分子保留时间短,小分子保留时间长,根据标准物质的保留时间与相对分子质量的线性关系便可推算出未知组分的相对分子质量。利用此法测定肽类物质的相对分子质量及其分布具有较高的精密度,而且操作简单、结果可靠,适用于各种来源多肽的相对分子质量及其分布的测定。

蛋白质、多肽类产品的分子质量具有多分散性,所以其分子质量只具有统计平均的意义。用实验方法测定的相对分子质量只是统计平均值,若要确切描述多肽的相对分子质量,除了知道统计平均值外,还应明确多肽的相对分子质量分布。数均相对分子质量(Mn)是根据样品中不同相对分子质量分子的数目统计的平均相对分子质量;重均相对分子质量(Mw)是根据样品中不同相对分子质量分子的质量统计的平均相对分子质量;多分散系数d为重均相对分子质量与数均相对分子质量的比值,用以表征样品分子质量的分散程度。d值越大,说明分子质量越分散,d值为1时,说明分子质量呈单分散[20]。

在采用酶法水解蛋白质制备多肽的过程中,水解过度会产生苦味肽和大量氨基酸,水解不全将得不到理想的多肽。有报道[24]称鸡肉在酶解过程中,其呈味成分会随着水解程度的改变而改变。此外,水解度与酶解产物的乳化性、起泡性、溶解性、稳定性等也具有一定的关系[25-26]。因此,在水解过程中必须严格控制蛋白质的水解度。多肽的相对分子质量分布与蛋白质水解度密切相关,可直接客观地反映出水解程度。采用凝胶过滤色谱法测定多肽的相对分子质量分布,对多肽的生产制备和质量控制都具有重要的指导意义。

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收稿日期:2012-11-20

作者简介:蒋腾川(1989—),女,硕士研究生,主要从事中药研究与开发。E-mail:jiangtengchuan@163.com

*通信作者:宋新波(1964—),男,研究员,学士,主要从事中药研究与开发。E-mail:songxinbo@tjutcm.edu.cn