壳寡糖对秀丽隐杆线虫寿命的影响

王 晗,米生权,孙雅煊,赵 卓 *,林 强

(北京联合大学应用文理学院,北京 100191)

摘 要:目的:探讨不同质量浓度的壳寡糖延长秀丽隐杆线虫寿命的活性功能,试图寻求延缓衰老的生物活性物质。方法:以秀丽隐杆线虫为模式生物,以线虫寿命为指标,用相对分子质量≤1 000的壳寡糖(chitooligosaccharides,COS)设立对照组和壳寡糖4 个用药组(50、100、200、400 mg/L),测定线虫的寿命、生殖能力、移动速率和吞咽频率。结果:与对照组比较,壳寡糖质量浓度达到200 mg/L以上时可使线虫的寿命延长(P<0.05),不同质量浓度的壳寡糖对线虫平均寿命和最大寿命均具有延长作用。壳寡糖400 mg/L组延长寿命的效果最为明显。与对照组比较,壳寡糖质量浓度在100 mg/L以上时线虫的移动速率和吞咽频率增加(P<0.01),但当壳寡糖质量浓度为400 mg/L时,线虫的移动速率和吞咽频率的增加幅度趋缓。结论:相对分子质量≤1 000的壳寡糖在50~400 mg/L质量浓度范围内能够延长秀丽隐杆线虫的寿命。

关键词:秀丽隐杆线虫;模式生物;寿命;壳寡糖;抗衰老

从海洋生物中提取的壳聚糖具有多种生物活性,可以作为一种具有生物相容性和生物降解性的新型生物材料 [1],其水解产物壳寡糖(chitooligosaccharides,COS)不但有分子质量小,毒性低、水溶性好等特点,还起到增加人体免疫力、抑制肿瘤、调节血脂和血压等功能 [2],同时还具有抗氧化 [3]、神经保护 [4]、抗肿瘤 [5]、抗炎 [6]、抗菌 [7]、抗感染 [8]等多种药理作用,对细胞内过多的活性氧自由基具有一定的清除作用,同时对细胞接受外界刺激产生的氧化应激也能够起到一定的保护作用 [9-10]。尽管有研究表明,壳寡糖相关产品功能声称具有延缓衰老的特性,但很少有直接的证据支持壳寡糖能够延长寿命。自1995年至今,在中国期刊网上仅有4 篇文献以寿命为研究终点,明确指出壳寡糖具有延缓衰老的作用,其中1 篇为含有壳寡糖等多种成分产品的抗衰老研究(大豆异黄酮-壳聚糖-海藻酸钠缓释微囊的抗衰老能力的实验研究),用壳聚糖-海藻酸钠包埋体系制备大豆异黄酮缓释微囊,评价缓释微囊的抗衰老效应 [11]。其余3 篇文章分别用小鼠和果蝇作为实验对象,研究了壳寡糖的抗衰老作用,但寿命的终点研究均以果蝇为实验对象 [12-14]。本研究选用国际上公认的在延缓衰老研究领域中具有优势的主要模式生物秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans,简称线虫)作为研究对象,以整体动物寿命实验作为检测手段 [15],以线虫的平均寿命、生殖能力、移动速率和吞咽频率作为切入点,研究不同质量浓度的壳寡糖对线虫寿命的影响。

1 材料与方法

1.1 菌株、材料与试剂

菌株E. coli OP50、野生型秀丽隐杆线虫Bristol(N2)由北京生命科学研究所惠赠。

壳寡糖(相对分子质量≤1 000,可溶于水)由大连中科格莱克生物技术有限公司惠赠;5-氟尿嘧啶 美国Sigma公司;琼脂粉 日本协和株式会社。

1.2 仪器与设备

MJ-250F-II霉菌培养箱 上海一恒科技有限公司;S6E体视显微镜 德国Leica公司;5804R离心机 德国Eppendorf公司;MLS-3780高压蒸汽灭菌锅 日本Sanyo公司。

1.3 方法

1.3.1 线虫培养

线虫的培养使用线虫标准培养基(NGM) [16],配制方法:每1 000 mL培养基含有琼脂18~25 g,牛肉蛋白胨2.7 g,Tris-base 0.55 g,Tris-HCl 0.27 g,NaCl 2 g,121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。给线虫饲喂E. coli OP50,培养温度为20 ℃。

1.3.2 线虫同步化

用无菌水把成年的秀丽隐杆线虫从NGM平板上冲洗至无菌的离心管中,1 200 r/min离心2 min,弃上清液,加入5 mL裂解液(每100 mL水中含有0.5 mol/L氢氧化钾溶液10 mL,10%次氯酸钠溶液10 mL,现用现配),室温下充分振荡溶液5 min直到线虫破开,以M9缓冲液清洗虫卵3 次。用M9缓冲液悬浮离心管底部虫卵,滴在铺有E. coli OP50的NGM平板上,于20 ℃培养箱中恒温倒置培养约48 h,当受精卵发育为L4期幼虫时用于寿命测定实验。

1.3.3 线虫寿命测定

配制线虫寿命测定生长培养基NGM,对照组培养基中含有无菌去离子水,受试组培养基中壳寡糖的终质量浓度分别为50、100、200、400 mg/L,每个质量浓度设两个平行。室温放置过夜,将在37 ℃条件下培养16 h的E. coli OP50巴氏消毒法处理之后涂在测试用的NGM平板上,随机挑取25 条同步化后的L4期幼虫到各组NGM培养基上,于20 ℃培养箱中倒置培养。从转移时刻起开始计算线虫的存活天数,转移当天记为寿命实验的第0天,每2~3 d记录线虫存活数量,并将存活线虫转移至新铺好的含有E. coli OP50菌液和相同质量浓度壳寡糖的NGM培养基上,实验持续至最后一条线虫死亡为止,以铂金丝碰触线虫仍然不动即判定为死亡。依据线虫生存、死亡的条数绘制生存曲线。

1.3.4 生殖能力测定

随机挑取25 条同步化后的L4期幼虫至壳寡糖终质量浓度分别为50、100、200、400 mg/L的NGM培养基上,同时设空白对照组,每组2 个平行。每48 h把线虫转移至新铺含有E. coli OP50菌液和相同质量浓度壳寡糖的NGM培养基上,换下的旧板倒置于20 ℃培养24 h,记录幼虫数量,直到线虫生殖能力丧失。将每天产生的子代数目相加即为线虫终身产卵量。

1.3.5 移动速率测定

随机挑取10 条同步化后的L4期幼虫至壳寡糖终质量浓度分别为50、100、200、400 mg/L的NGM培养基上,同时设对照组,每组2 个平行。测定其移动速率,观察时将线虫挑至没有食物的NGM平板上,先让线虫自由运动2 min,在显微镜下观察并记录1 min内线虫的身体弯曲次数,作为身体弯曲频率的指标。1 次弯曲定义为线虫相对于身体长轴方向上的一个波长移动。

1.3.6 吞咽频率测定

随机挑取10 条同步化后的L4期幼虫至壳寡糖终质量浓度分别为50、100、200、400 mg/L的NGM培养基上,同时设对照组,每组2 个平行。观测其吞咽频率,在显微镜下观察并记录1 min内线虫的吞咽次数,作为线虫吞咽频率的指标。

1.4 统计学分析

采用SPSS统计分析软件对线虫寿命的实验数据进行Kaplan-Meier法的生存分析,对线虫寿命相关生理指标的数据进行One-Way ANOVA分析,相关性采用Spearman检验。

2 结果与分析

2.1 壳寡糖对线虫寿命的影响

表1 不同质量浓度的壳寡糖对线虫寿命的影响
Table 1 Effect of chitooligosaccharides with different concentrations on the lifespan of C. elegans

壳寡糖质量浓度/(mg/L)平均寿命/d最大寿命/d 0(对照组)32.232 5033.235 10033.438 20033.740 40035.040

图1 不 同质量浓度的壳寡糖对线虫寿命的影响
Fig.1 Effect of chitooligosaccharides with different concentrations on the lifespan of C. elegans

经Kaplan-Meier生存分析得出(表1),对照组线虫的平均寿命为32.2 d, 最大寿命为32 d;壳寡糖400 mg/L组线虫的平均寿命和最大寿命最长。与对照组相比有统计学差异(P<0.05)。线虫的生存曲线如图1所示,与对照组相比,50、100、200、400 mg/L壳寡糖均能使线虫的生存曲线右移并延长线虫的平均寿命,以壳寡糖400 mg/L组最为显著。根据Spearman相关分析得出,壳寡糖50、100、200、400 mg/L组延缓线虫衰老作用具有一定的剂量依赖性(P<0.05),本实验中400 mg/L组效果优于其他剂量组。

2.2 壳寡糖对线虫生殖能力的影响

图2 不同质量浓度的壳寡糖对线虫生殖能力的影响
Fig.2 Effect of chitooligosaccharides with different concentrations on the reproductive capacity of C. elegans

*. 与对照组相比,差异显著(P<0.05);**. 与对照组相比,差异极显著(P<0.01)。下同。

经One-Way ANOVA分析得出,对照组线虫平均产卵200 枚;壳寡糖50、100、200、400 mg/L组线虫平均产卵分别为203、207、218、229 枚,与对照组相比,壳寡糖50、100、200、400 mg/L组的平均产卵数略高于对照组。如图2所示,对照组线虫的平均产卵量最少,壳寡糖400 mg/L组线虫的平均产卵量最多。与对照组相比,壳寡糖各剂量组对线虫的生殖能力均有影响,但影响程度不大。同时在显微镜下观察到,高质量浓度壳寡糖组线虫体内卵数量明显增多,最后死亡时仍有大量卵未排出体外,而对照组却无此现象出现。

2.3 壳寡糖对线虫移动能力的影响

经One-Way ANOVA分析得出,对照组线虫在1 min内的平均移动距离是4.8;壳寡糖50、100、200、400 mg/L组线虫的平均移动距离分别为5.2、5.3、5.4、5.3,壳寡糖100、200、400 mg/L组与对照组相比有统计学差异(P<0.01)。如图3所示,1 min内对照组线虫的平均移动距离最短,壳寡糖200 mg/L组线虫的平均移动距离最长。与对照组相比,壳寡糖各剂量组对线虫的移动能力均有影响,在50~200 mg/L质量浓度范围内能提高线虫的移动速率,但与200 mg/L组相比,400 mg/L的壳寡糖反而会导致线虫的移动速率降低。

图3 不同质量浓度的壳寡糖对线虫移动速率的影响
Fig.3 Effect of chitooligosaccharides with different concentrations on the movement speed of C. elegans

2.4 壳寡糖对线虫吞咽频率的影响

图4 不同质量浓度的壳寡糖对线虫吞咽频率的影响
Fig.4 Effect of chitooligosaccharides with different concentrations on the swallowing frequency of C. elegans

经One-Way ANOVA分析得出,对照组线虫在1 min内的吞咽频率是80.9;壳寡糖50、100、200、400 mg/L组线虫的平均吞咽频率分别为83.0、84.3、85.6、82.5,壳寡糖50、100、200 mg/L组与对照组相比有统计学差异(P<0.05或P<0.01)。如图4所示,1 min内对照组线虫的吞咽频率最低,壳寡糖200 mg/L组线虫的吞咽频率最高。与对照组相比,壳寡糖各剂量组对线虫的吞咽频率均有影响,50~200 mg/L质量浓度范围内能提高线虫的吞咽频率,但与200 mg/L组相比,400 mg/L的壳寡糖会导致线虫的吞咽频率降低。

3 讨 论

由于产卵数主要反映了秀丽线虫的繁殖能力。因此,测定产卵数可以帮助研究壳寡糖对秀丽线虫在繁殖能力方面所形成的延长寿命作用。移动速率和吞咽频率是秀丽线虫最基本的运动。运动行为常被作为反映神经系统基本功能的指标,也可以间接反应出线虫寿命及生存状态,检测以上指标,操作和观察较方便、实验周期较短、实验成本也较低 [17]。本实验发现壳寡糖一定质量浓度范围内可延缓秀丽线虫衰老,使用不同剂量的壳寡糖(50、100、200、400 mg/L)干预秀丽线虫的衰老,结果表明在寿命方面,随着壳寡糖质量浓度的升高,线虫的平均寿命显著延长,具有一定的促生殖峰期作用,其中400 mg/L的壳寡糖作用效果优于其他剂量。在生殖能力方面,随着壳寡糖质量浓度的升高,线虫的产卵量有一定程度的增加,但卵排出体外过程有受阻现象,对终身排卵数的影响不大,但实际产卵数明显提高,并且在壳寡糖组均出现了线虫体内有大量卵细胞滞留、生殖孔处膨出体外的现象,这可能是造成最后整体排卵数区别不大的原因。在移动能力和吞咽能力方面,壳寡糖在一定质量浓度范围内能提高线虫的移动速率和吞咽频率,当壳寡糖的质量浓度超出一定范围时,线虫的移动速率和吞咽频率又会有不同程度的下降,这可能是由于高质量浓度的壳寡糖会对线虫机体产生一定的毒性作用,线虫通过降低运动频率来减少对有毒物质的吸收,从而保障其基本生存能力。

在寿命方面,有研究人员用川芎提取物 [18]、白藜芦醇 [19]、青蒿素 [20]、淫羊藿总黄酮 [21]、香椿叶总黄酮 [22]、大鲵粗提物 [23]、百草枯 [24]等药物对线虫寿命方面作了相关研究。在抗氧化方面,有研究人员以小鼠作为实验对象研究壳寡糖的抗氧化作用,证明壳寡糖在小鼠体内能显著降低脂质过氧化产物丙二醛(malondialdehyde,M D A)的含量,提高肝组织中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的活力 [25];在体外可以清除超氧阴离子自由基及羟自由基,具有清除自由基及抗脂质过氧化的作用,是一种天然抗氧化剂 [26]。通过采用电子自旋共振技术就壳寡糖对超氧阴离子自由基的抑制作用进行考察,证明不同分子质量的壳寡糖具有明显的清除自由基,抑制其活性的效果 [27],这种抑制作用很可能与分子链中大量的活性羟基有关。不同分子质量的壳寡糖性质差异很大,有时甚至表现出截然相反的特性,因而在清除自由基的活性方面也就存在很大差异 [28-29],清除自由基的活性随壳寡糖分子质量的减小而增强 [30],特别是低分子质量的壳寡糖表现出较高的清除自由基活性 [31]。这为壳寡糖及其金属配合物的进一步开发应用提供了理论依据,为进一步研究低分子质量壳寡糖的抗自由基活性研究提供了实验基础,从而在分子水平上的一个方面揭示了壳寡糖作为医用保健品的机理 [32]。本实验以秀丽隐杆线虫作为模式生物,以寿命作为研究指标,观察壳寡糖对线虫寿命的影响,发现多个质量浓度的壳寡糖对线虫均有延长寿命作用或延长寿命趋势,迄今为止还未见到有关壳寡糖这一药理作用的报道。

由于壳寡糖的分子质量与其生物活性有密切关系,低分子质量壳寡糖含有大量的羟基和氨基,具有较好的水溶性和抗氧化活性,与同剂量的高分子质量壳寡糖相比,低分子质量壳寡糖显示了更优的活性功能 [33]。且目前对壳寡糖抗氧化活性的细胞学实验中,相对分子质量主要集中在10 000以下,以3 000以下活性最好 [34-35]。由于之前研究了寡聚糖1 000 mg/L以下线虫的存活率,通过对LC 50的测定,发现壳寡糖质量浓度≤500 mg/L时对线虫的存活没有影响,此外,其他用寡聚糖做细胞学实验的适宜质量浓度范围为50~125 mg/L [36]。因此本次实验使用相对分子质量≤1 000的壳寡糖,研究壳寡糖活性与其在50~400 mg/L质量浓度范围之间的关系,结果发现相对分子质量≤1 000的壳寡糖在50~400 mg/L范围内具有一定延长线虫寿命的功能,其机制可能与抗自由基的活性有关,但壳寡糖活性与相对分子质量之间的关系及其活性机制,以及高于400 mg/L的壳寡糖对线虫寿命的影响等还有待进一步研究。

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Effect of Chitooligosaccharides on Lifespan of Caenorhabditis elegans

WANG Han, MI Shengquan, SUN Yaxuan, ZHAO Zhuo*, LIN Qiang
(College of Applied Arts and Science, Beijing Union University, Beijing 100191, China)

Abstract:Objective: To explore the lifespan-prolonging effect of chitooligosaccharides (COS) at various concentrations on Caenorhabditis elegans (C. elegans) in order for these compounds to be developed into anti-aging drugs. Methods: C. elegans as a model organism were cultured in the absence (control) or presence of different concentrations (50, 100, 200 and 400 mg/L) of COS with a relative molecular mass not greater than 1 000. The effects of COS on the li fespan, reproductive capacity, movement speed and swallowing frequency of C. elegans were examined. Results: Compared with the control group, the lifespan of C. elegans was prolonged by COS at concentrations larger than 200 mg/L (P < 0.05). COS at all investigated concentrations could signifi cantly extend the mean and maximum lifespan of C. elegans and 400 mg/L was the most effective concentration for prolonging the lifespan of C. elegans. Compared with the control group, the movement speed and swallowing frequency of C. elegans were increased when the concentration of COS was higher than 100 mg/L (P < 0.01), reaching a plateau at 400 mg/L. Conclusion: COS with relative molecular mass equal to or less than 1 000 at concentrations of 50–400 mg/L can signifi cantly improve the mean and maximum lifespan of C. elegans.

Key words:Caenorhabditis elegans; model organism; lifespan; chitooligosaccharides; anti-aging

中图分类号:R114

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2015)01-0229-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201501044

收稿日期:2014-10-10

基金项目:北京市教育委员会科学研究项目(SQKM201311417014);北京市属市管高等学校人才强教计划项目(PHR201107150)

作者简介:王晗(1990—),女,硕士研究生,研究方向为食品毒理学。E-mail:wh900124@sina.com

*通信作者:赵卓(1963—),男,教授,博士,研究方向为食品毒理学。E-mail:zhaozhuo@buu.edu.cn