等电点沉淀法鱼分离蛋白结构与功能变化研究进展

王 伟,刘俊荣 *,马永生,吴 忠,田元勇

(大连海洋大学食品科学与工程学院,辽宁 大连 116023)

摘 要:以蛋白质分离提取为出发点,系统回顾了国内外有关分离蛋白特别是鱼分离蛋白的研究现状,阐述基于等电点絮凝沉淀原理的蛋白分离技术在食品蛋白配料中的重要性。集中探讨了分离后蛋白质结构与性质的变化,现有研究均表明分离过程中蛋白质空间结构的变化与分离鱼蛋白产物的食品功能特性具有相关性。因此研究鱼分离蛋白的结构变化规律,对于通过调控以改善鱼蛋白配料的食品功能特性有重要指导意义。

关键词:蛋白分离;食品蛋白配料;功能;鱼蛋白

基于等电点絮凝沉淀原理的蛋白质分离技术广泛应用于食品领域。该技术最早应用于植物蛋白的提取分离,如商品化的大豆分离蛋白(soy protein isolate,SPI),因其卓越的功能特性,作为食品蛋白配料已被广泛应用于食品工业领域 [1]。近年来,蛋白质分离技术也越来越多地用于开 发水产蛋白资源 [2]。据中国渔业统计年鉴,2012年全国水产品总产量5 907.68万 t [3]。从 开发功能性蛋白配料角度出发,针对蛋白成分的开发与利用是低值原料及水产加工副产物精深加工利用的有效途径,也是目前我国水产品加工领域亟待解决的问题。

pH调节法是源于等电点絮凝沉淀原理有效分离鱼蛋白的蛋白质分离技术 [4],其特有优势在于可回收肌浆蛋白以提高蛋白质的回收率,能有效地去除中性脂肪等,且回收蛋白质的功能性较好 [2]。这种技术的出现,在解决水产蛋白质分离提取、开发新型功能性鱼蛋白食品配料等领域,具有十分广泛的前景。而鱼蛋白在分离过程中,由于受pH值、温度、离子强度等因素影响,分子结构、空间构象及理化性质等会发生一系列的变化,这些变化对蛋白质的营养性、安全性以及功能特性等将产生影响,因此探讨蛋白质结构与功能特性的关联十分必要。本文针对国内外有关蛋白分离,特别是鱼分离蛋白的研究情况做了系统回顾。

1 蛋白质分离技术与鱼蛋白资源利用

1.1 蛋白质分离技术与功能性食品蛋白质配料

食品蛋白配料被广泛应用于现代食品工业中,根据蛋白配料的不同功能特性,分别用于各类食品的生产制造。所谓等电点絮凝沉淀原理是根据蛋白质的两性特点,在一定pH值条件下,其氨基酸残基侧链基团带净正电或净负电荷,使得蛋白溶解。在蛋白质等电点(pI)时,蛋白质净电荷为零,此时其溶解度最小,进而聚集沉淀 [5],基于这个原理可有效分离纯化蛋白质。早在1952年,Anon [6]利用等电点法从豌豆、坚果及大豆等植物提取分离蛋白;1956年Bolley [7]发现并解决了早期植物分离蛋白的风味缺陷;1957年大豆分离蛋白实现了商业化 [8]。随着技术的不断成熟,作为功能性食品配料大豆分离蛋白已广泛应用于焙烤食品、糖果、肉类加工制品、仿肉制品及婴幼儿配方奶粉等 [9]

早期关于鱼肉分离蛋白的研究重在分离,忽视了分离产物的加工性能对功能性的影响。1959年Vogel等 [10]以脂肪含量低于4%的鱼为原料,经等电点沉淀回收得到分离鱼蛋白,进一步进行真空干燥处理,蛋白质不可避免地发生了热变性,因此亲水性遭到破坏。同样,1968年 Libenson等 [11]先利用40~100 ℃的热碱溶液对鱼碎肉进行处理,脱除脂肪等非蛋白组分,再利用等电点法进一步分离提纯,得到的分离蛋白也彻底丧失了持水性。直到20世纪90年代,鱼分离蛋白的研究在过程条件控制与分离产物功能性方面才获得极大的进展。1999年,Hultin等 [4]采用在低温偏离蛋白质等电点的酸(pH<2.5)或碱(pH>10.5)条件下使蛋白 质充分溶出,然后通过离心或过滤将 骨刺、皮和脂肪等不溶物去除,再将pH值调至蛋白质等电点(约5.2~5.5)进行沉淀回收,制备鱼分离蛋白(fish protein isolate,FPI)。值得注意的是,整个提取分离过程是在低温(4 ℃)下进行的,由此蛋白质变性程度小、且蛋白回收率较高。与早期相比,蛋白分离产物在功能特性方面表现出突出的优势,可归纳为 [12]:1)操作简单高效,原料绞碎均质后即可直接进行溶解处理;2)有效去除骨刺、皮和脂类等杂质,由于脂质氧化带来的风味和质地下降问题可得到有效控制;3)有效回收可溶性肌浆蛋白,显著提高了蛋白质的回收率,如Kristinsson等 [13]研究显示,以斑点叉尾鮰为原料,pH调节法能将鱼蛋白回收率由传统鱼糜水洗法的62%提高至70%~86%;4)分离得到的鱼蛋白具有优良的功能特性。很多研究表明,分离鱼蛋白的凝胶特性优于传统鱼糜 [14-15]

总而言之,等电点沉淀法分离鱼蛋白技术在蛋白质回收及功能特性方面表现出巨大优势,同时可弥补鱼蛋白在功能性食品蛋白配料中的空缺。目前已成为国内外水产加工领域的热点之一。

1.2 蛋白分离技术在鱼蛋白领域中的研究进展

国外关于鱼分离蛋白的研究众多,针对海水鱼已有系列报道。对鯔鱼(Mugil cephalus) [16]、石首鱼(Umbrina) [17]、石斑鱼(Epinephelus adscensionis) [18]等白肉鱼分离蛋白的回收率及功能特性研究显示,相比水洗鱼糜,酸溶蛋白的回收率高,碱溶蛋白的凝胶性更好,但太平洋牙鳕(Merluccius productus) [19]分离蛋白没有水洗鱼糜的凝胶性好。另外,Kim等 [20]报道不同pH值对太平洋鳕鱼(Gadus morhua)分离蛋白凝胶特性影响,发现在pH 11条件下溶解鱼肉能获得最佳的凝胶特性。可见不同品种、pH值条件对于分离蛋白产物的凝胶特性有重要影响。对沙丁鱼(Sardina pilchardus) [21]、竹荚鱼(Trachurus japonicus)、日本鲭鱼 [22]等红肉鱼分离蛋白的研究表明,与水洗鱼糜相比,蛋白回收率高但凝胶性差。Undeland等 [23]以鲱鱼(Clupea harengus)为原料制备分离蛋白的研究结果却相反,其碱溶蛋白具有优良的凝胶性。此外,Taskaya等 [24]制备鲢鱼分离蛋白的研究发现回收蛋白若不加功能性添加剂,凝胶性则较差。Foh等 [25]报道发现罗非鱼(Oreochromis niloticus)碱溶分离蛋白的乳化性、起泡性较好。

国内关于鱼分离蛋白的研究报道日益增多。起初陈申如等 [26]研究了酸溶提取鲢鱼肌肉蛋白的最适条件;付湘晋等 [27]发现等电点沉淀法提取鲢鱼分离蛋白的保水性比水洗鱼糜差,酸溶蛋白有较好的乳化性。傅润泽等 [28]优化了鲢鱼肌肉蛋白分离条件,确定pH 2.5酸溶或pH 11.5~12.5范围内碱溶处理,蛋白质回收率可达到89.5%~90.5%。刘俊荣等 [29]制备了罗非鱼分离蛋白,结果表明与中性漂洗相比,回收的分离蛋白具有较好的溶解和分离效果且碱溶回收蛋白的功能性优于酸溶处理。另外,还有对低值的南美白对虾(Penaeus vannamei Boone) [30]、箭齿鲽(Atheresthes stomias) [31]、虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)外套膜 [32]分离蛋白功能特性的研究报道。

从大量的研究报道可见国内外研究焦点主要集中在分离鱼蛋白产物的凝胶特性及蛋白回收率两个方面。结果表明蛋白回收率均提高但分离蛋白的凝胶特性各有差异,碱溶蛋白相比酸溶蛋白的凝胶特性好,但与水洗鱼糜相比,不同因素对凝胶特性影响不同,目前对分离鱼蛋白的凝胶机制尚不十分清楚。

2 分离鱼蛋白结构变化与功能特性

2.1 分离过程中蛋白质结构变化的研究进展

鱼蛋白分离产物的功能性是蛋白分离技术的研究价值所在。在分离处理过程中,蛋白质所发生的空间结构变化势必影响到分离产物的功能特性。Choi等 [33]对太平洋鳕鱼(Gadus macrocephalus)的肌肉蛋白质分离机理做了研究,经分析发现其肌球蛋白重链和肌动蛋白在提取过程中发生了降解,表面疏水性和巯基含量分析表明二者均下降。另外针对岩鱼(Sebastes fl avidus) [18]的研究发现,岩鱼蛋白在分离过程中肌原纤维蛋白和肌浆蛋白均发生变性,表现为溶解性下降和热吸收峰的消失;此外,巯基含量分析发现,与鱼肉和水洗鱼糜相比,碱溶处理所得分离蛋白的二硫键交联程度最大,其凝胶特性的分析结果也验证了这一点,表现出较高的破断力和形变值。Rawdkuen等 [34]针对罗非鱼(Orechromis niloticus)的研究结果表明,酸溶提取分离蛋白的肌原纤维蛋白发生了部分降解。孙月娥等 [35]研究发现酸提鲢鱼蛋白的肌球蛋白重链明显降解,肌动蛋白含量显著降低。王瑛 [36]对罗非鱼肌球蛋白在pH值调节下结构和性质变化进行了报道,发现偏离等电点时,肌球蛋白的表面疏水性逐渐增大、巯基含量逐渐减小、色氨酸荧光强度减弱。这表明肌球蛋白疏水基团暴露、分子结构发生变化。可见,在分离提取过程中鱼肉蛋白的组分及结构均会发生变化,而国内外关于分离后蛋白质的结构变化及其变化对分离蛋白产物功能特性影响的基础研究较少。因此,有必要探讨等电点沉淀法分离蛋白后蛋白结构与性质变化和蛋白质结构与功能特性的关系等基本理论。

2.2 肌球蛋白在分离过程中的变化

鱼肉中的蛋白质根据溶解性的不同分为3 类:盐溶性的肌原纤维蛋白、水溶性的肌浆蛋白和不溶性的肌基质蛋白。其中肌原纤维约占鱼肉总蛋白质的65%~80%,而肌球蛋白是肌原纤维中最丰富的功能性蛋白质。肌球蛋白复杂的结构,特别是在其氨基端,肌球蛋白杆部折叠起来呈球状结构,赋予了肌球蛋白纤维状和球状结构特征 [37]。许多研究发现,肌球蛋白主要决定了肌肉组织的持水性、凝胶性、乳化性与发泡性等 [38]。2003年,Kristinsson等 [37]报道了大西洋鳕鱼(Gadus morhua)肌球蛋白经pH值调节分离过程中的构象和结构变化。结果发现pH 2.5酸溶处理使蛋白展开,肌球蛋白杆部由于静电斥力作用可能完全解离,但在pH 11碱溶条件下无解离。同时极端pH值下均导致肌球蛋白重链的球状头部组分有显著的构象变化。当pH值调整至中性,肌球蛋白的重链球状头部发生重折叠,但并未恢复到其天然状态,而球状头部区域不可逆的变化使得其暴露出更多的巯基,导致疏水性增强、结构稳定性较差。Mohan等 [39]研究鲻鱼肌球蛋白时也发现了类似的结果。鲻鱼肌球蛋白头部比杆状尾部对酸碱更敏感。发生重折叠后,酸处理肌球蛋白的三级结构依然有部分保持解离状态,碱处理肌球蛋白却没有类似结果。大量研究都将在这期间肌球蛋白的分子结构部分展开继而发生重折叠的状态,即蛋白质的三级结构被破坏,但仍然保持其类似天然的二级结构和致密性,称之为熔球态(molten globule) [40-42]。在蛋白质去折叠和重折叠过程中,都存在这样相似的中间构象,主要通过疏水相互作用保持稳定。下面具体探讨下肌球蛋白二级结构和三级结构发生的变化。

2.2.1 肌球蛋白的二级结构在分离过程中的变化

蛋白质一般具有4 级结构,其高级结构主要靠共价键、氢键、静电作用、疏水作用等维持。蛋白质特定的结构是其行使其功能的物质基础,蛋白质的各种功能又是其结构的表现。从某种程度上说,蛋白质的二级结构、三级结构、四级结构比一级结构与功能的关系更大。肌球蛋白的二级结构主要是α-螺旋结构,两条重链尾部折叠形成。目前测定蛋白质二级结构的方法常用的主要有圆二色谱 、红外光谱(infrared spectroscopy,IR)、拉曼光谱(Raman spectroscopy)和核磁共振,前3 种方法可以确定蛋白质二级结构的类型和相对含量,核磁共振的化学位移则可以确定二级结构在一级结构中的具体位置 [43]。Kristinsson等 [37]对大西洋鳕鱼(Gadus morhua)肌球蛋白的研究就通过远紫外圆二色谱分析得出:肌球蛋白经极端酸或碱处理其二级结构基本未发生变化,其杆部仍然为α-螺旋结构。尤其是与变性剂盐酸胍处理的蛋白相比,经酸/碱处理的肌球蛋白二级结构没有显著性变化。Raghavan等 [44]研究酸诱导鲶鱼肌球蛋白发现,不同种类的酸处理肌球蛋白的二级结构没有显著性变化,但在肌球蛋白展开前添加NaCl其α-螺旋含量会显著性增加,表明盐可以阻碍肌球蛋白变性展开而起到保护作用。同样,Raghavan等 [45]研究碱诱导鲶鱼肌球蛋白发现,NaOH处理的肌球蛋白的二级结构在不同pH值下没有显著性变化。

2.2.2 肌球蛋白的三级结构在分离过程中的变化

蛋白质的三级结构是多肽链在二级结构基础上通过侧链基团的相互作用进一步卷曲折叠,借助次级键维系使α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲等相互配置而形成的特定的构象。肌球蛋白的三级结构主要在于球状头部,在蛋白分离提取过程中球状头部会发生展开再折叠,这期间必然引起肌球蛋白的三级结构的变化。如Kristinsson等 [37]研究鳕鱼(Gadus morhua)肌球蛋白采用近紫外圆二色谱分析肌球蛋白的三级结构变化。结果表明极端酸(pH 2.5)处理和碱(pH 11)处理均使肌球蛋白的三级结构有显著的变化,所有蛋白质显然失去了其三级相互作用。这就可以解释“熔球态”的形成。

蛋白基团微环境变化也可反映蛋白的三级结构变化,主要是蛋白内源生色基团(Trp、Tyr和Phe)由蛋白质内部的疏水区向亲水环境暴露,在极性环境下由于溶剂的淬灭作用特征基团的荧光强度降低或增强,最大发射峰位红移或蓝移,这种变化可用来衡量蛋白质分子发生去折叠的程度,进而反映三级结构的变化。Kristinsson等 [37]研究了鳕鱼肌球蛋白微环境中色氨酸残基的变化,结果表明在酸和碱展开时有显著的荧光猝灭,但最大荧光波长并没有移动。而盐酸胍作用下的蛋白分子有更明显的荧光猝灭,荧光波长有显著红移。相比之下更加说明经酸碱处理的肌球蛋白的三级结构发生了显著的变化。Raghavan等 [44]通过色氨酸荧光光谱研究加盐顺序对酸诱导鲶鱼的肌球蛋白的影响,结果发现无盐时肌球蛋白的色氨酸荧光强度下降最快,暴露出色氨酸残基数目增多使蛋白展开变性程度增加。但在肌球蛋白展开前加盐其表现出较高的荧光强度,说明暴露的色氨酸残基较少进而减少了蛋白质展开的程度。同样Raghavan等 [45]对碱诱导鲶鱼肌球蛋白的结构变化研究也表现出相似的结果,可见加盐顺序对蛋白的构象和结构有很大的影响。

肌球蛋白的三级结构主要依靠疏水相互作用力来维持。除了蛋白质自身内在因素外,蛋白质在分离过程中表面疏水性的强弱也反映了肌球蛋白三级结构的变性程度。目前常在蛋白质分子的特殊部位引入外源荧光,测定外源荧光物质的荧光进而分析蛋白质的疏水微环境。常用的荧光探针主要有ANS(8-苯胺基-1-萘磺酸)、PRODAN(N,N-二甲基-6-丙酰-2-萘胺)等。Raghavan等 [45]使用PRODAN荧光探针研究加盐顺序对碱诱导肌球蛋白结构的影响,结果发现与对照组相比,肌球蛋白展开前加盐的疏水性降低,重折叠后加盐的疏水性升高。疏水性增大,溶解度减小,蛋白变性程度增大,展开前加盐疏水性降低表明盐可以阻碍肌球蛋白变性展开而起到保护作用。

2.3 肌浆蛋白在分离过程中的变化

肌浆蛋白质主要包括肌溶蛋白、肌红蛋白、肌浆酶、肌粒蛋白、肌质网蛋白等,这些蛋白质溶于水或低离子强度的中性盐溶液,是肉中最易提取的蛋白质。研究人员已证明动物源蛋白(卵清蛋白、α-乳清蛋白、β-乳球蛋白)和一些酶(如溶菌酶)具有熔球态,进一步的研究还发现处于中间态的蛋白其乳化和起泡等功能性质均有改善 [46-47]。Kim等 [48]研究了在阿拉斯加狭鳕鱼糜凝胶中添加石斑鱼肌浆蛋白的影响。结果发现凝胶中加入2%肌浆蛋白,破断力显著增加,但其变形值略有下降,表明肌浆蛋白可以改善蛋白凝胶特性。

2.3.1 肌浆蛋白的二级结构在分离过程中的变化

蛋白在分离过程中某些氢键体系会发生变化,与此同时其侧链基团如酪氨酸、色氨酸吲哚环、苯丙氨酸的单基取代苯基羟苯基环及C=O伸缩振动都有轻微变化。拉曼散射光谱和红外吸收光谱均可得到振动光谱,两种手段可提供互补信息。通过检测蛋白质酰胺键吸收红外辐射的频率,即可利用振动光谱来估算蛋白质中二级结构的含量。尤其是酰胺Ⅰ带(80%为C=O伸缩振动,1 650 cm -1附近)、Ⅱ带(60% N—H弯曲振动,1 550 cm -1附近)和Ⅲ带(40% C—N伸缩振动,30% N—H 弯 曲 振 动,1 300 cm -1附近)通常被用来研究蛋白质的二级结构。Tadpitchayangkoon等 [49]采用傅里叶变换红外-拉曼光谱分析研究了条纹鲶鱼(Pangasius hypophthalmus)肌浆蛋白经酸碱处理过程中结构的变化。结果显示肌浆蛋白经酸处理α-螺旋转化为β-折叠,而碱处理却对α-螺旋无影响。据推测,酸处理主要中断氢键的重排导致β-折叠形成。蛋白质分子的聚合已被证实涉及分子间的反平行β-折叠结构的形成 [50-51]。这表明酸诱导的蛋白质变性程度比碱诱导的高。

2.3.2 肌浆蛋白的三级结构在分离过程中的变化

针对肌浆蛋白三级结构研究的很少。Tadpitchayangkoon等 [52]研究了条纹鲶鱼(Pangasius hypophthalmus)肌浆蛋白在不同pH值处理下构象变化。其中分别使用ANS和PRODAN外源荧光探针测定肌浆蛋白在不同pH值处理的表面疏水性,结果发现极端酸性(pH 2~4)诱导肌浆蛋白的巯基氧化,导致蛋白聚集和表面疏水性下降;而在碱性pH值条件下肌浆蛋白结合外部荧光探针的能力增强,说明肌浆蛋白在碱性下暴露的疏水基团增多,增大蛋白质展开程度。

表1 不同品种的鱼蛋白经等电点沉淀法分离后结构变化的研究回顾
Table 1 Overview on conformational changes of proteins from different fi sh species induced by acid and alkaline protein isolation

品种等电点沉淀法结构变化参考文献鳕鱼 肌球蛋白酸性(pH 2.5)下蛋白完全解离;碱性(pH 11.0)下蛋白没有解离;调至等电点后蛋白折叠回原有二级结构,三级结构被破坏[37]鲻鱼肌球蛋白肌球蛋白重链的球状头部构象完全改变无法重折叠到原有构象[39]鲶鱼肌球蛋白使用HCl调节pH值至1.5,肌球蛋白变性程度最大;酸处理之前加盐,肌球蛋白的变性程度较小[44]鲶鱼肌球蛋白使用KOH调节pH值至11,肌球蛋白变性程度最大;碱处理之前加盐,肌球蛋白的变性程度较小 [45]罗非鱼肌球蛋白肌球蛋白疏水基团暴露、分子结构发生变化,且肌球蛋白在碱性条件变性程度较酸性条件下弱 [36]条纹鲶鱼肌浆蛋白pH 10~12内肌浆蛋白的构象变化与pH 2~4相 比,肌浆蛋白在pH 10~12下去折叠程度更严重且暴露更多的疏水性基团[49]条纹鲶鱼肌浆蛋白酸处理肌浆蛋白α-螺旋转化为β-折叠;碱处理对肌浆蛋白的α-螺旋无影响;酸处理的蛋白质变性和聚集程度比碱处理的高[52]

综上所述,如表1,无论是酸溶还是碱溶,均会导致肌肉蛋白空间结构发生变化而后在等电点沉淀发生重折叠。这些变化影响蛋白质表面界面活性和巯基含量等。因此,研究提取分离中蛋白质的结构变化规律,对于通过调控蛋白质结构变化机制来改善分离鱼蛋白功能特性有重要意义。

3 结 语

虽然基于等电点絮凝沉淀原理的蛋白质分离技术经过十余年的发展,在鱼蛋白利用领域取得了较快的发展,但是还存在一系列的科学瓶颈问题有待进一步探索。目前国内外研究主要集中于分离鱼蛋白提取和功能特性的表征,对鱼蛋白在分离过程中结构的变化研究还较少,且结论各异。而且如前所述,研究的鱼类品种还较少,因此很难找到鱼蛋白在分离过程中结构的变化规律及其作用机理。因此,我们需要从鱼蛋白分子空间结构变化规律出发,在表征鱼蛋白的功能特性前提下,进一步研究蛋白质结构的变化规律以及其与功能特性的相互关系。

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Advances in Research on Structural and Functional Variation of Fish Protein Isolate Extracted by Isoelectric Precipitation

WANG Wei, LIU Junrong*, MA Yongsheng, WU Zhong, TIAN Yuanyong
(College of Food Science and Engineering, Dalian Ocean University, Dalian 116023, China)

Abstract:The current status of studies on the extraction and processing of isolated proteins is reviewed systematically with emphasis on fi sh protein isolate. Various food protein ingredients extracted from different raw materials based on isoelectric precipitation method are discussed with particular emphasis on the development and utilization of fi sh protein. The present analysis is focused on the conform ation and structure of the protein molecules during isolation. Research has shown that large changes in conformation and structure are always accompanied by signifi cant changes in functional properties of the protein isolates. Therefore, it is essential to explore the mechanism of protein molecular structure during isolation in order to r egulate specifi c functional properties of the fi sh protein ingredients.

Key words:protein isolation; food protein ingredients; functional properties; fi sh protein

中图分类号:TS254.1

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2015)01-0250-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201501048

收稿日期:2014-03-01

基金项目:国家自然科学基金面上项目(31271980)

作者简介:王伟(1989—),女,硕士研究生,研究方向为农产品加工与贮藏。E-mail:wangwei889331@163.com

*通信作者:刘俊荣(1963—),女,教授,博士,研究方向为水产品加工与质量安全。E-mail:ljunrong@dlou.edu.cn