于 微 1，马春丽 2，孙婷婷 1，刘 美 3，邹 莉 1，*
（1.东北林业大学林学院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030；3.辽宁辉山乳业集团有限公司，辽宁 沈阳 110164）
摘 要：从实验室保存的7 株乳酸菌中，经分离纯化，以金黄色葡萄球菌为指示菌，筛选获得1 株高产细菌素的菌株KLDS 1.0338，排除有机酸和过氧化氢的干扰以及蛋白酶敏感性实验，确定抑菌作用是由细菌素产生的。通过菌株形态学分析，生理生化及16S rDNA分析鉴定菌株KLDS 1.0338为干酪乳杆菌ATCC 334。进一步利用该菌株制作农家干酪，考察4 ℃贮藏期间干酪的变化，添加KLDS 1.0338干酪乳杆菌的实验组抑菌活性显著大于未添加KLDS 1.0338干酪乳杆菌组（P＜0.01），实验组的pH值下降平缓，可以有效延长农家干酪的货架期，并保持产品原有的色泽、风味、质构等感官特性。
关键词：细菌素；分离筛选；农家干酪；保质期
细菌素是细菌在代谢过程中通过核糖体产生的具有抗菌活性的多肽或蛋白质，可以杀灭或者抑制环境中的其他微生物 ［1-4］。乳酸菌所产的细菌素能够抑制食品中某些腐败菌和致病微生物生长繁殖 ［5-7］，具有防腐保鲜的重要作用，有望作为天然防腐剂代替化学防腐剂的潜在价值 ［8-10］。因此乳酸菌细菌素的研究和开发利用成为近年来的热点，而备受关注 ［11-14］。目前广泛应用于食品保鲜的乳酸菌素主要有乳酸链球菌素（Nisin）和乳酸片球菌素（Pediocin） ［15-16］，Roberts等 ［17］将Nisin产生菌株与奶酪发酵菌株用于奶酪的生产加工，可以延长奶酪的货架期。但在一些特殊的微生态环境中分离出抑菌谱更宽的乳酸菌素，Topisirovic等 ［18］分离得到的乳杆菌所产的乳酸菌素既能抑制革兰氏阳性菌生长，也能抑制革兰氏阴性菌的生长繁殖，在食品贮藏方面显现出了极大潜力。
本研究从7 株乳酸菌中筛选一株出产细菌素较高的菌株，并将该菌株应用于农家干酪生产，探讨其对延长农家干酪保质期的作用，为该乳酸菌菌株的应用及寻找新型乳酸菌细菌素提供实验依据。
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株及发酵剂
受试菌：鼠李糖乳杆菌KLDS 1.0370、德式乳杆菌保加利亚亚种KLDS 1.0307、干酪乳杆菌KLDS 1.0338、嗜酸乳杆菌KLDS 1.0380、肠膜明串珠球菌KLDS 5.0401、发酵乳杆菌KLD S 1.0640、约氏乳杆菌KLDS 1.0703，均由乳品科学教育部重点实验室工业微生物菌种保藏中心（东北农业大学）保藏。商业干酪发酵剂：乳酸链球菌（Streptococcus lactis）、乳脂链球菌（Streptococcus cremoris），购自丹尼斯克（中国）公司。
指示菌：金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC 25923，购自中国药品生物制品鉴定所。
1.1.2 培养基
MRS培养基培养乳酸菌、NB培养基培养金黄色葡萄球菌，PCA培养基检测细菌总数，培养基成分按照文献［19］配制。
1.1.3 试剂
琼脂糖 美国Sigma公司；DNA回收试剂盒、DNA Marker、Taq DNA聚合酶、dNTP 北京天根生化科技有限公司；胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K、过氧化氢酶日本TaKaRa公司；氢氧化钠、乙酸钠均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
DK-8K恒温水浴锅 英国Stable Micro Systems公司；9700PCR仪 美国Applied Biosystems公司；徕卡DMLB型显微 镜 德国徕卡显微镜公司；GL-21M高速冷冻离心机 上海市离心机械研究所；SPX-150B生化培养箱 上海智城仪器公司；BCN1360型洁净工作台上海佳胜实验设备有限公司；干酪槽 丹麦Foss公司；凝胶成像系统 美国Upland公司；320 pH计 瑞士梅特勒-托利多公司。
1.3 方法
1.3.1 菌株活化与分离纯化
菌株于-80 ℃冷冻保存，使用前接种于MRS液体培养基中活化，将菌液在固体培养基中三区划线，活化传代两次，每次分别于37 ℃过夜培养，选取单菌落进行镜检。指示菌在NB培养基中37 ℃过夜培养。
1.3.2 抑菌活性测定
采用牛津杯琼脂扩散法 ［20］。首先将过夜培养的指示菌悬浊液均匀涂在NB平板上，在无菌状态下，培养皿干燥30 min。将内径为6 mm的牛津杯均匀放置在平板上，下压使其无间隙，将200 μL发酵上清液滴入牛津杯孔内，并在37 ℃培养箱内过夜培养，取出培养皿，用游标卡尺测抑菌圈直径的大小，确定其抑菌效果 ［21］。每个样品做3 次平行实验，确保实验的准确性。
干扰因素的排除：发酵液经12 000 r/min，4 ℃离心15 min后，用浓度为1.0 mol/L的氢氧化钠调整发酵上清液的pH值为7.0，排除有机酸的干扰；将过氧化氢酶溶解在0.02 mol/L的乙酸钠缓冲液（pH 7.0），使过氧化氢酶的终质量浓度为5 g/L，37 ℃水浴2 h，排除过氧化氢的干扰。上清液经0.22 μm滤膜过滤，保存备用。
蛋白酶敏感性实验：将发酵上清液的pH值调至各酶最适pH值，分别加入胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K（酶的质量浓度1.5 g/L），在37 ℃条件下处理1 h后，沸水浴处理3 min使酶失活，冷却后调pH值为7，测定抑菌活性的变化情况 ［22］。
1.3.3 目标菌株鉴定
形态学鉴定：在MRS培养基中，37 ℃过夜培养的目的菌株进行革兰氏染色，在显微镜下观察菌体形态。同时观察目标菌在MRS固体培养基中培养48 h的菌落状态。
生理生化鉴定：根据糖醇发酵实验、特异性酶实验，对菌株进行生理生化鉴定 ［19］。
16S rDNA分析：将筛选出抑菌活性强的乳酸菌菌种，用细菌通用引物以及特异性引物直接进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增。PCR采用20 μL反应体系：无菌水13.8 μL，10×Buffer 2 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，10 μmol/L引物F 0.5 μL，10 μmol/L引物R 0.5 μL，DNA模板1 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min，在94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min并循环30 次；最后72 ℃终延伸10 min ［23］。PCR产物经1.0%琼脂凝胶电泳后，用北京天根生化科技有限公司的DNA回收试剂盒回收目的片段并测序。
1.3.4 农家干酪的制作
对照组为商业发酵剂，实验组为商业发酵剂+干酪乳杆菌KLDS 1.0338。
农家干酪的加工工艺：脱脂乳→标准化→均质→杀菌→冷却（30～32 ℃） →发酵剂→氯化钙→凝乳酶→凝乳→切割→静止（20～40 min）→加温搅拌→排乳清→清洗→沥干→拌盐（1%）→贮藏（4 ℃） ［24］。
1.3.5 农家干酪贮藏过程中相关指标的测定
成品的农家干酪于4 ℃条件下贮藏18 d，每3 d测定1 次干酪的细菌总数、pH值以及抑菌活性，每6 d对干酪进行1 次感官评定。
细菌总数测定：采用平板菌落计数法测定 ［19］。将25 g奶酪样品加到225 mL的生理盐水中，用电子搅拌器均质。在生理盐水中依次进行倍比稀释，选择3 个适当的稀释梯度，使用PCA营养琼脂培养基，37 ℃培养48 h，计数。
感官评定：在食品工艺室内进行，选择10 名从事本专业的研究人员组成评定小组，评定方法根据中华人民共和国国家标准NY478—2002《软质干酪》中非成熟软质干酪感官要求，稍有改动，具体如表1所示。
表1 感官评分标准
Table1 Sensory evaluation criteriaa
项目特性特性描述及评分标准7～10 分4～6 分0～3 分滋味和风味乳香味乳香感强乳香感一般无乳香感酸度酸度适中酸度一般酸度过强或过弱苦涩味无苦涩味微有苦涩味苦涩味严重组织状态质地细腻且柔软粗糙松散可塑性可塑性强可塑性一般无可塑性气泡有少量气泡有气泡大量气泡外观颜色接近于白色呈乳黄色异常光泽度明显不明显无光泽口感光滑度无颗粒感稍微有颗粒感有颗粒感硬度适中微硬过硬
2.1 高产细菌素乳酸菌的筛选
表2 不同乳酸菌抑菌活性
Table2 Antimicrobial activities of bacteriocins from seven strains of lactic acid bacteria
菌株编号KLDS 1.0370 KLDS 1.0307 KLDS 1.0338 KLDS 1.0380 KLDS 5.0401 KLDS 1.0640 KLDS 1.0703抑菌圈直径/mm 18.25±0.08 17.16±0.1520.11±0.12 19.06±0.1117.86±0.0618.05±0.11 17.26±0.07
选取Staphylococcus aureus为指示菌，用活化后的7 株乳酸菌发酵上清液进行抑菌实验，如表2所示，筛选出具有较强抑菌效果的菌株KLDS 1.0338。由表3可知，菌株KLDS 1.0338发酵上清液中排除有机酸、过氧化氢的干扰，仍保持抑菌活性，表明发酵上清液中有机酸、过氧化氢不是主要的抑菌物质，对发酵上清液进行胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K的酶解实验，表明抑菌物质对胰蛋白酶、胃蛋白酶敏感性较高，对蛋白酶K不敏感，确定发酵上清液中抑菌活性物质是蛋白类物质，是一类细菌素。
Table3 Antimicrobial activity of bacteriocin from strain KLDS 1.0338
after different treatments
样品抑菌圈直径/mm中和前发酵上清液15.63±0.15过氧化氢酶处理后的发酵上清液11.10±0.30 pH 7.0的发酵上清液12.20±0.20
2.2 菌株KLDS 1.0338的鉴定
2.2.1 形态学鉴定结果
图1 菌株KLDS 1.0338菌落形态（a） 和菌体形态（b，放大100 倍）图
Fig.1 Colony morphology （a） and cell morphology （b， 100× amplification） of strain KLDS 1.0338
由图1可知，菌株KLDS 1.0338在MRS固体培养基上37 ℃培养48 h后，菌落中等大小，呈乳白色，周边无褶皱，有光泽，菌落周围有明显透明圈。菌株KLDS 1.0338在MRS液体培养基中过夜培养，菌体革兰氏染色呈阳性，无芽孢，菌体呈短杆状，菌体间成链状。
2.2.2 生理生化鉴定
目标菌株KLDS 1.0338的生理生化特征如表4所示。根据参考文献［25］初步鉴定该菌株为干酪乳杆菌。
表4 生理生化实验结果
Table4 Results of physiological and biochemical experiments
注：+. 反应呈阳性；-. 反应呈阴性。
实验项目结果实验项目结果葡萄糖+山梨醇+麦芽糖+纤维二糖+阿拉伯糖-蜜二糖-木糖-七叶苷+核糖+甘露醇+果糖+水杨酸+半乳糖+吲哚实验-乳糖+明胶液化-蔗糖+V-P实验+棉子糖-KOH实验-鼠李糖+触酶实验-
2.2.3 16S rDNA分析
图2 KLDS 1.0338 PCR扩增结果
Fig.2 Results of PCR amplification of KLDS 1.0338
由图2可知，菌株KLDS 1.0338在1 500 bp处获得目的条带，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收并测序。将测序结果在NCBI上进行BLAST分析，菌株KLDS 1.0338与Lactobacillus casei ATCC 334的同源性为99%，从而初步确定为干酪乳杆菌。
2.2.4 特异性PCR结果分析
用干酪乳杆菌的特异性引物PCR扩增，扩增产物1%琼脂糖凝胶电泳检测结果如图3所示，菌株KLDS 1.0338在416 bp处获得了预期的特异性唯一条带，无杂带，进一步验证了鉴定结果的正确性。
图3 KLDS 1.0338特异性PCR结果
Fig.3 Result of specific PCR of KLDS 1.0338
2.3 干酪4 ℃贮藏期间的变化
2.3.1 干酪4 ℃贮藏期间细菌总数的变化
图4 干酪在4 ℃贮藏时细菌总数的变化
Fig.4 Changes in total bacterial count of cheese stored at 4 ℃
由图4可知，贮藏期间细菌总数呈上升趋势，前3 d添加干酪乳杆菌（实验组）和未添加干酪乳杆菌（对照组）两组干酪的细菌总数变化较小，曲线变化比较迟缓，表明两组干酪的细菌总数变化差异不明显。第3天以后，对照组的细菌总数明显增加，曲线呈上升趋势，并且细菌总数的增加速率较为明显，而添加KLDS 1.0338干酪的细菌总数也有所增加，但是变化曲线相对较 小，说明实验组的细菌总数增加速率较慢，对照组的细菌总数显著高于实验组（P＜0.05）。国家标准是干酪的细菌总数超过5.00×10 5CFU/g为不合格，对照组的干酪在第9天已经超标，而实验组的干酪放到第15天时将超
干酪贮藏过程中，添加KLDS 1.0338实验组和未添加KLDS 1.0338对照组的变化整体呈逐渐下降趋势，说明细菌素的抑菌活性逐渐降低，见图6。在贮藏前3 d，实验组的抑菌活性与对照组相比是比较显著（P＜0.05），随着贮藏时间的延长，抑菌活性发生明显变化，实验组显著高于对照组（P＜0.01），但12 d之后，对照组与实验组的抑菌活性下降速率加快，并且差异不显著（P＞0.05）。
2.3.4 干酪4 ℃贮藏期间感官评价
通过外观、口感、风味等方面对农家干酪进行感官评定，干酪保持了良好的状态，见蜘蛛网图7。获得的结论是，随着贮藏时间的延长，两组干酪的质地慢慢变疏松、易碎，苦味有所增加，光泽度下降，但都在可接受的范围之内。加入干酪乳杆菌KLDS 1.0338的干酪外观、标，所以添加干酪乳杆菌能够有效抑制农家干酪中微生物的生长，在冷藏条件下，可以使农家干酪的保质期延长一倍。
2.3.2 干酪4 ℃贮藏期间pH值的变化
图5 干酪在4 ℃贮藏时pH值的变化
Fig.5 Changes in pH of cheese stored at 4 ℃
由图5可知，贮藏期间未添加KLDS 1.0338对照组与添加KLDS 1.0338实验组的pH值均呈逐渐下降的趋势，初始阶段对照组pH值显著高于实验组（P＜0.05），但是随着贮藏时间的延长，到12 d时实验组与对照组的pH值差异不显著（P＞0.05）。在4 ℃贮藏条件下，实验组的pH值变化趋势与对照组相比下降的更平稳，说明产酸速率降低，更有利于货架期的延长。
图6 干酪在贮藏过程中抑菌活性的变化
Fig.6 Changes in antimicrobial activity during storage of cheese
2.3.3 干酪4 ℃贮藏期间抑菌活性的变化质地、口感与对照组基本一致，并且实验组的风味比对照组的更加浓厚，后香感更强，可能由于干酪乳杆菌在发酵过程中所产生的风味化合物融合 到了干酪中。因此，干酪乳杆菌做为辅助发酵剂对于农家干酪的感官评定不会产生不良的影响，反而会增强干酪的风味效果。
图7 贮藏期间干酪感官评价
Fig.7 Results of sensory evaluation during storage of cheese
本实验通过牛津杯法，排除有机酸和过氧化氢的干扰，从实验室现存的7 种不同的乳酸菌菌种中筛选获得一株具有较强抑菌活性的KLDS 1.0338菌株，通过表型鉴定、生理生化鉴定以及特异性引物PCR分析确定KLDS 1.0338为干酪乳杆菌。
在4 ℃贮藏过程中，添加干酪乳杆菌KLDS 1.0338的干酪表面光滑、无裂痕，质地细腻，无异味，与对照组相比感官评价无显著差异。贮藏3 d后对照组的细菌总数上升速率明显高于实验组，贮藏期间添加干酪乳杆菌的干酪pH值下降更为平缓，随着贮藏时间的延长抑菌活性显著高于对照组（P＜0.01），说明干酪乳杆菌所产的细菌素可以有效控制农家干酪中微生物的生长，从而延长干酪的保质期。通过观察农家干酪中添加干酪乳杆菌的变化，建立贮藏保鲜的新技术，以解决运输和保藏中遇到的困难。
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Screening of Bacteriocin-Producing Lactic Acid Bacteria and Application in Extending Shelf-Life of Cottage Cheese
YU Wei
1， MA Chunli
2， SUN Tingting
1， LIU Mei
3， ZOU Li
1，*
（1. College of Forestry， Northeast Forestry University， Harbin 150040， China； 2. College of Food Science， Northeast Agricultural University， Harbin 150030， China； 3. Liaoning Huishan Dairy Group Co. Ltd.， Shenyang 110164， China）
Abstract：The strain KLDS 1.0338 capable of producing a high yield of bacteriocin， an antimicrobial substance effective against Staphylococcus aureus， was screened from 7 strains of lactic acid bacteria preserved in our laboratory by separation and purification. By eliminating the interference of organic acid and hydrogen peroxide and by conducting protease sensitivity tests， we confirmed the antimicrobial role of this bacteriocin. Based on morphological， physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence analysis， the strain was identifi ed as Lactobacillus casei ATCC 334. This strain was used to produce cottage cheese and the changes in cheese quality during storage at 4 ℃ were examined. The experimental group obtained from co-fermentation with L. casei was compared with the control group fermented without using L. casei. In the experimental group， the antibacterial activity was significantly enhanced （P ＜ 0.01）， the pH value decreased gradually， the shelf-life of cottage cheese was effectively extended while maintaining the original color， fl avor，texture and other sensory characteristics of products.
Key words：bacteriocin； isolation and screening； cottage cheese； shelf-life
中图分类号：TS201.3
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2015）03-0142-05
doi：10.7506/spkx1002-6630-201503027
收稿日期：2014-05-04
基金项目：教育部“长江学者和创新团队发展计划”项目（IRT0959，NEAU）；国家自然科学基金青年科学基金项目（31101318）
作者简介：于微（1982—），女，博士研究生，研究方向为食品生物技术。E-mail：yuwei_www@163.com
*通信作者：邹莉（1966—），女，教授，博士，研究方向为食品微生物。E-mail：13903650896@163.com