甘薯叶酸性磷酸酶的分离纯化及部分性质研究

（西南大学生命科学学院，重庆市甘薯工程研究中心，三峡库区生态环境教育部重点实验室，重庆 400715）

摘要：以新鲜甘薯老叶为材料，经过匀浆、硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose阴离子交换层析和Superdex-200凝胶层析等步骤后，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定获得了电泳纯的酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP），纯化后ACP比活力为251.49 U/mg，纯化了169.07 倍，回收率为3.50%。酶学性质研究结果表明：ACP为单亚基酶，全酶分子质量为42.3 kD，单亚基分子质量为41.2 kD；最适反应温度65 ℃，最适pH 5.2；在40 ℃以下和pH 4.0～6.0范围内酶活性较稳定；以对硝基苯磷酸二钠为底物时，测得其米氏常数K m值为0.258 mmol/L；Ca 2+和Mg 2+对ACP酶活性有明显激活作用，K +和Li +对ACP酶活性无影响，甲醇、乙二胺四乙酸和草酸对ACP酶活性的抑制作用较大；Hg 2+和Ag +对ACP酶活性的抑制作用非常明显。

酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP，EC 3.1.3.2）是一种在酸性环境中催化磷酸单酯水解释放出无机磷酸的水解酶［1］，在动植物和微生物中都广泛存在［2-3］。该酶可作为食品添加剂，在农产品农药残留检测中有重要作用［4-5］。植物体内存在3 种磷酸酶：酸性、中性和碱性磷酸酶，而ACP是植物体内重要的一种酶，对植物生长发育有重要影响［4］。在植物体内，ACP是一种诱导酶，在缺磷的条件下能显著提高其活性［5］。但因种属差异，目前关于ACP具体的生理生化机制仍然存在争议。甘薯属于旋花科甘薯属甘薯种草本植物，若生长在热带地区为多年生植物，若生长在温带地区则为一年生植物。甘薯作为一种粮食作物在我国广泛种植，并且作为多种产品的原材料被大量加工使用［6］。本实验以甘薯老叶作为研究材料，分离纯化酸性磷酸酶，并对其部分酶学性质进行研究，为从植物中分离纯化酸性磷酸酶以及甘薯的综合开发利用提供理论参考依据。

1　材料与方法

对硝基苯磷酸二钠美国A m r e s c o公司；DEAE-Sepharose层析柱、Superdex-200凝胶柱、凝胶层析分子质量标准品、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）蛋白标准品美国GE公司；考马斯亮蓝G-250 美国Bio-Rad公司；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺瑞士Fluka公司；其余试剂均为国产分析纯。

Seven Easy pH计瑞士Mettler-Toledo公司；GL-21M高速冷冻离心机长沙湘仪离心机仪器有限公司；UV-2550型紫外分光光度计日本岛津公司；AKTA Prime plus纯化系统美国GE公司；Milli-Q Plus纯水仪美国Millipore公司；MC4L冷冻干燥机德国Uni-Equip公司；垂直电泳槽和电泳仪美国Bio-Rad公司。

新鲜甘薯叶，选择老叶部分（预实验表明老叶酶活力较幼叶更高）洗净擦干，准确称取100 g，剪碎，以1：4（m/V）的提取比例加入预冷的50 mmol/L乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 5.0）；放入组织捣碎机中搅碎，4 ℃提取2 h，用4 层纱布过滤2 次后在4 ℃条件下12 000 r/min离心60 min，收集上清液，即为粗酶液，测定粗酶液的酶活力和蛋白质含量。

硫酸铵粉末经烘箱干燥后，缓慢加入粗酶液中，使粗酶液中硫酸铵含量为10%（体积分数），4 ℃静置2 h后，4 ℃条件下12 000 r/min离心40 min，弃去沉淀，收集上清液；然后继续向粗酶液中加入硫酸铵至40%，4 ℃冰箱静置2.5 h，4 ℃条件下12 000 r/min离心40 min，弃去上清液，收集沉淀；50 mmol/L乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 5.0）溶解沉淀，测定酶活力和蛋白质含量后装入透析袋中，于5 mmol/L乙酸-乙酸钠透析液（pH 5.0）中4 ℃透析24 h。

DEAE-Sepharose层析柱用200 mL 50 mmol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 5.0）平衡后，取经过透析的10 mL酶液上样，用0～1.0 mol/L NaCl、50 mmol/L乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 5.0）进行线性梯度洗脱（10 h NaCl浓度由0变为1 mol/L），收集洗脱液5 mL/管，流速设定为0.5 mL/min，测定各管酶活力以及蛋白质含量，收集酶活力较高的几管，透析12 h后冷冻干燥，于-20 ℃保存备用。

Superdex-200层析柱经50 mmol/L乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 5.0）平衡后，取浓缩后的酶液3 mL上样，用50 mmol/L乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 5.0）进行洗脱，每管收集3 mL，流速设定为0.3 mL/min，测定各管酶活力以及蛋白质含量，收集酶活力较高的1至2 管，用超纯水透析12 h后冷冻干燥，得到的酶纯品于-20 ℃保存备用，酶纯品粉末用50 mmol/L乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 5.0）溶解，使酶液酶活力约为50 U/mL，用于做酶性质研究。

参考文献：［7］方法并改进：向试管中加入2.9 mL 50 mmol/L乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 5.0）（含5 mmol/L的β-巯基乙醇）和底物（1 mL 5 mmol/L的对硝基苯磷酸二钠），于37 ℃水浴锅保温5 min后，再加入100 μL酶液，反应10 min后加入2.5 mL的0.2 mol/L NaOH溶液终止反应。以100 μL 50 mmol/L乙酸-乙酸钠（pH 5.0）缓冲液代替酶液作为对照调零，在420 nm波长处测定吸光度。根据吸光度对应对硝基苯酚浓度的标准曲线计算出产物生成量。酶活力单位（U）定义为：在37 ℃条件下，以对硝基苯磷酸二钠为底物，每分钟每升溶液中底物水解后生成产物的微摩尔数。

采用紫外分光光度法和考马斯亮蓝G-250法对蛋白质含量进行测定［8-9］。

用SDS-PAGE对凝胶层析过后的样品进行纯度鉴定以及单亚基分子质量的测定［10］，凝胶过滤法对全酶分子质量进行测定［11］。

分别在30～70 ℃和pH 3～8的条件下测定酶活力，分别以最适条件下测定的酶活力为100%，其余条件下的酶活力与之相比得到相对酶活力。

分别在30～70 ℃和pH 3～8条件下，处理1～5 h，每隔1 h测定酶活力。分别以未处理时的温度和pH值条件下的酶活力为100%，其余温度和pH值条件下测得的酶活力分别与之相比为相对酶活力。

在根据1.3.8.1节所测得的最适温度和最适pH值条件下，在不同底物浓度（对硝基苯磷酸二钠0.1、0.2、0.4、0.5 mmol/L）条件下，测定ACP活力，采用双倒数作图法（Lineweaver-Burk法）求出其K m值。

分别将甲醇、乙醇和异丙醇与酶液混合，混合后有机溶剂的体积分数分别为10%、20%、30%、40%、50%，37 ℃条件下处理30 min，再加入1 mL 5 mmol/L的对硝基苯磷酸二钠反应10 min，最后加入2.5 mL 0.2 mol/L NaOH溶液终止反应。测定不同有机溶剂影响下的酶活力，以不加有机溶剂时的酶活力为100%。

分别将尿素、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetra acetic acid，EDTA）、抗坏血酸和草酸与酶液混合，混合后化合物的浓度分别为10、20、30、40、50 mmol/L，37 ℃条件下处理30 min，再加入1 mL 5 mmol/L的对硝基苯磷酸二钠反应10 min，最后加入2.5 mL 0.2 mol/L NaOH溶液终止反应。测定不同化合物对酶活力的影响，以不加化合物时的酶活力为100%。

分别将各种不同金属离子与酶液混合，混合后反应液中金属离子的浓度分别为1、2、3、4、5 mmol/L，37 ℃条件下处理30 min，再加入1 mL 5 mmol/L的对硝基苯磷酸二钠反应10 min，最后再加入2.5 mL 0.2 mol/L NaOH溶液终止反应。测定不同金属离子对酶活力的影响，以不加金属离子时的酶活力为100%。

2　结果与分析

图1　甘薯叶ACP的DEAE-Sepharose离子交换柱层析色谱图
Fig.1 DEAE-Sepharose chromatography of ACP from sweet potato leaves

图2　甘薯叶ACP的Superdex-200凝胶柱层析色谱图
Fig.2 Superdex-200 chromatography of ACP from sweet potato leaves

硫酸铵分级沉淀透析后的酶液经DEAE-Sepharose柱层析后的结果见图1，酶活力最高管为第46管。收集酶活力较高的组分，经透析冷冻干燥浓缩后，Superdex-200凝胶柱层析结果见图2，酶活力最高管为第36管，收集酶活力最高的组分，冷冻干燥后于-20 ℃冰箱保存备用。整个分离纯化过程的结果如表1所示。

表1　甘薯叶酸性磷酸酶的分离纯化结果
Table1 Purification of ACP from sweet potato leaves

纯化步骤总活力/U总蛋白含量/mg比活力/（U/mg）纯化倍数回收率/%匀浆后离心10 384.176 981.151.491.00100.00硫酸铵沉淀4 727.85308.3515.3310.3145.53 DEAE-Sepharose柱层析1 746.0020.3086.0257.8316.81 Superdex-200柱层析363.301.44251.49169.073.50

图3　甘薯叶ACP的SDS-PAGGEE图
Fig.3 SDS-PAGE of purified ACP from sweet potato leaves

如图3所示，甘薯叶ACP纯化后，经SDS-PAGE检测显示为单一条带，说明该酶样品已达到电泳纯，通过迁移率计算出单亚基分子质量约为41.2 kD；而凝胶过滤层析法测定的全酶分子质量约为42.3 kD（图4），由此推断甘薯叶ACP是为单亚基酶，这与大多数文献报道的多数ACP为单亚基酶的结论一致［12-15］。

图4　Superdex-200层析法测得甘薯叶ACP的全酶分子质量
Fig.4 Estimation of the molecular weight of ACP from sweet potato leaves by Superdex-200 chromatography

在不同温度和pH值条件下测定ACP活力，结果表明：该酶的最适反应温度为65 ℃（图5），最适反应pH值为5.2（图6）。

图5　温度对甘薯叶ACP活力的影响
Fig.5 Effect of temperature on the activity of ACP from sweet potato leaves

图6　pH值对甘薯叶酸性ACP活力的影响
Fig.6 Effect of pH on the activity of ACP from sweet potato leaves

图7　甘薯叶ACP的热稳定性
Fig.7 Thermal stability of ACP from sweet potato leaves

图8　甘薯叶ACP的pH值稳定性
Fig.8 pH Stability of ACP from sweet potato leaves

实验结果表明，ACP在40 ℃以下较稳定，60～70 ℃温度范围内酶稳定性较低，在70 ℃保温1 h以后，酶活力几乎完全丧失（图7）。在pH 4～6条件下，稳定性较好，酶活力变化趋势比较缓慢，pH 5条件下放置5 h后，相对酶活力还高达90%以上； pH值＜4或者≥7时，酶蛋白分子结构发生变化，酶活力下降很快，5 h后相对酶活力只剩下不到10%（图8）。

在最适温度和pH值条件下，将不同浓度底物（对硝基苯磷酸二钠0.1、0.2、0.4、0.5 mmol/L）加入酶反应体系中，测定不同浓度底物下的ACP酶活力，利用双倒数作图法得K m为0.258 mmol/L（图9）。

图9　双倒数法测得甘薯叶ACP的米氏常数K m
Fig.9 K mDetermination of ACP from sweet potato leaves by Lineweaver-Burk plot

图10　不同有机溶剂对甘薯叶ACP活力的影响
Fig.10 Effects of various organic solvents on the activity of ACP from sweet potato leaves

如图10所示，ACP在甲醇、乙醇作用下，酶活力均受到强烈抑制，随着有机溶剂体积分数的增大，抑制作用增强，当有机溶剂体积分数达到50%时，甲醇几乎抑制了该酶40%的酶活力，而异丙醇体积分数在低于20%时，对酶有少许的激活作用，体积分数高于20%后，则表现出对酶有抑制作用。

如图11所示，随着浓度的增大，多数化合物对甘薯叶ACP的酶活力表现出了抑制作用，其中，草酸对该酶的抑制作用非常明显，当草酸浓度达到40 mmol/L时，ACP基本上检测不到酶活力，尿素对该酶影响作用不明显，而EDTA在高浓度下也对酶活性表现出抑制作用，抗坏血酸在低于40 mmol/L时表现出对酶活力少许的激活作用，而在高于40 mmol/L后又体现出对ACP活力有抑制作用。

图11　不同化合物对甘薯叶ACP活力的影响
Fig.11 Effect of various compounds on the activity of ACP from sweet potato leaves

图12　不同金属离子对甘薯叶ACP活力的影响
Fig.12 Effect of various metal ions on the activity of ACP from sweet potato leaves

如图12所示，不同金属离子对甘薯叶ACP活性有不同的影响。随着离子浓度的增加，Ca 2+、Ba 2+和Mg 2+对酶活力稍有激活作用，Pb 2+、Zn 2+、Hg 2+、Ag +则对该酶有较强的抑制作用，其中Hg 2+、Ag +对该酶抑制作用最明显，当Hg 2+浓度达到0.2 mmol/L时，ACP活力完全丧失。

3　讨论

酶的分离纯化是酶学研究的基础和前提，本实验从甘薯的老叶中得到了电泳纯的ACP。但是与其他材料中分离纯化的ACP相比较，回收率偏低，可能原因有：ACP在甘薯中的同工酶较多［12］，纯化过程中可能丢失了部分同工酶；另外，在上柱过程中温度不同和洗脱液条件对酶稳定性的影响使酶活力降低，从而也可能致使回收率降低；在透析过程以及上离子柱之前的离心过程中可能损失了部分酶活力，这需要进一步的实验验证。

甘薯叶ACP全酶分子质量约为42.3 kD，一般低于其他材料的ACP分子质量，如韭菜（59.58 kD）［12］、斑玉蕈（65 kD）［13］、长毛对虾（73 kD）［14］，远低于意蜂工蜂（135 kD）［15］和海参（147.9 kD）［16］，但比绿豆（34.6 kD）［17］高，说明了不同种类材料的ACP分子质量之间存在着较大的差异，推测可能是由于生物体为了适应环境形成的。

甘薯叶ACP的最适温度为65 ℃，与其他材料的ACP最适温度相比较高，与韭菜（65 ℃）［12］相同，高于绿豆（40 ℃）［17］、背角无齿蚌（50 ℃）［18］、草鱼（45 ℃）［7］、刺参（45 ℃）［19］。该酶在40 ℃以下活力较稳定，这与大多数文献报道的情况相符。最适pH值为5.2，与绿豆（pH 5.2）［17］相同，与背角无齿蚌（pH 4.8）［18］和麦芽（pH 5.4）［20］相近，略高于草鱼（pH 4.4）［7］，远高于真菌类树状多节孢（pH 3.0）［21］和海洋藻类三角褐指藻、塔胞藻、海链藻（pH 3.0）［22］，甘薯叶ACP在pH 4.0～6.0条件下较为稳定，并且在pH 5.0时放置5 h后酶活力几乎不发生变化，说明甘薯叶ACP在其最适pH值附近稳定性较好。

甘薯叶ACP的K m约为0.258 mmol/L，与来自草鱼的ACP（K m值为0.232 mmol/L）［7］较为相近，比绿豆酸性磷酸酶（K m值为4.28 mmol/L）［17］低很多，和其他植物材料相比都要低很多，说明甘薯叶ACP对底物对硝基苯磷酸二钠的亲和力较大。

Pb 2+、Zn 2+、Hg 2+、Ag +对甘薯叶ACP活力都有较强的抑制作用，尤其是Hg 2+、Ag +，在较低浓度下即能对甘薯叶ACP的酶活力产生抑制作用，这与Pb 2+及Ag +对斑玉蕈［13］和刺参［19］中ACP的强烈抑制作用相似，Zn 2+与重金属离子均为该酶的抑制剂，这些离子直接作用于ACP活性中心的巯基从而导致酶活性丧失。Ca 2+和Mg 2+对甘薯叶ACP酶活力有明显的激活作用，推测可能是金属离子与酶的活性中心结合促进了酶的结合部位与底物之间的结合，从而促进酶的催化反应，这与多数文献一致［19-22］，只在洋葱［23］中发现Mg 2+对ACP活力反而有抑制作用，说明了同一种金属离子对不同材料来源的ACP活性有不同的影响作用。

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Isolation， Purification and Characterization of Acid Phosphatase from Sweet Potato Leaves

LI Xing， WANG Jie， WANG Hongyang， TANG Yunming *
（Key Laboratory of Eco-environments in Three Gorges Reservoir Region， Ministry of Education， Chongqing Sweet-potato Engineering Research Center， School of Life Science， Southwest University， Chongqing 400715， China）

Abstract：Electrophoresis-pure acid phosphatase （ACP） was obtained from sweet potato old leaves via a series of consecutive procedures， including homogenization， extraction， ammonium sulfate fractional precipitation， DEAE-sepharose chromatography and Superdex-200 gel filtration and then identified with sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis （SDS-PAGE）. In this process， the purification fold was 169.07 and the recovery of ACP activity was 3.50%. The specific activity of the purified enzyme was 251.49 U/mg. The result showed that the enzyme was a single subunit protease with a relative molecular weight of 42.3 kD， and the subunit molecular weight was 41.2 kD. The optimum temperature and pH of the ACP enzyme were 65 ℃ and 5.2， respectively. This ACP was stable below 40 ℃ and in the pH range from 4.0 to 6.0. Its Michaelis-Menten Kinetics （K m） towards p-nitrophenyl phosphate was 0.258 mmol/L. The enzyme activity could be obviously inhibited by methanol， EDTA and oxalic acid and also strongly inhibited by Hg 2+and Ag +.

Key words：sweet potato leaves； acid phosphatase； isolation and purification； characterization

作者简介：李星（1988—），男，硕士研究生，研究方向为蛋白质与酶工程。E-mail：848322361@qq.com

*通信作者：唐云明（1960—），男，教授，博士，研究方向为蛋白质与酶工程。E-mail：tbright@swu.edu.cn

甘薯叶酸性磷酸酶的分离纯化及部分性质研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨 论

1　材料与方法

2　结果与分析

3　讨论