曾议霆，郭溪浪，周 康*，刘书亮，韩新锋
（四川农业大学食品学院，四川 雅安 625014）
摘 要：对5 种15 株乳酸菌的生长曲线进行了测定，并对亚硒酸钠添加质量浓度、耐硒和富硒能力进行比较，筛选出了富硒优势乳酸菌，并进行了生理生化和分子鉴定。结果表明：适宜的加硒时间为培养后的第6小时，培养时间为24 h。通过对9 株菌株比较，确定了较适宜的亚硒酸钠添加质量浓度为6 μg/mL。最终筛选出BC-25为富硒优势菌株，富硒量425.79 μg/g，硒转化率达27.00%，经16S rDNA分析鉴定其为植物乳杆菌（Lactobacillus plantaru）。
关键词：乳酸菌；富硒；筛选；鉴定
硒是人体14大微量元素之一，已被联合国粮食与农业组织（Food and Agriculture Organization，FAO）/国际原子能组织（International Atomic Energy Agency，IAEA）/世界卫生组织（World Health Organization，WHO）共同确认为人体必需的一种重要微量元素，与机体正常生理功能的维持以及多种疾病的发生发展密切相关 ［1-2］，是哺乳动物体内许多酶活性中心的必需组分，如谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx） ［3］、脱碘酶（iodothyronine deiodinases，ID） ［4］等，具有保护细胞膜的结构和功能免受过度氧化损伤，抗癌、解毒、保肝和提高人体免疫力的生理功能 ［5-6］。据统计我国有2/3的人口居住在低硒或缺硒的地区，约有3亿 人处于缺硒状态，日常食用的食物中硒含量普遍较低，一般不足0.01 ☒g/g，很难满足国际学术组织联合会建议的成年男女膳食硒适宜需要量分别为40 ☒g/d和30 ☒g/d的要求 ［7］。因而人工补硒方法已受到国内外有关专家的广泛关注。时至今日，一般补硒的方法仍是用无机硒化合物制成口服制剂，无机硒即亚硒酸钠，但亚硒酸钠具有较强的毒副作用，研究显示，无机硒经生物转化后的有机硒化合物毒性低且在激发免疫反应上比无机硒显著 ［8］，且吸收率更高，这对于我国推广并用以改善硒缺乏的状态有极大的意义。
由于人工合成有机硒技术难度大，成本高，因而不少学者对利用动植物的吸收、转化作用获取有机硒进行了研究 ［9-11］。富硒常用的载体多为植物类食品 ［12］，富硒肉类食品 ［13-14］也有相关研究，而在以微生物作为载体研究最多的就是酵母菌 ［15］，随着生物化学技术的不断发展，目前，作为益生菌——乳酸菌，其保健功能、良好的风味和可靠的安全性已经被广大消费者所认可 ［16］，作为有机硒的一个新型来源，其生物学效应和 潜在开发应用前景非常广阔。本实验旨在筛选出一株具有富硒优势的乳酸菌，并对其进行生理生化和分子鉴定，为今后关于乳酸菌富硒的进一步研究和应用奠定基础。
1.1 材料
1.1.1 菌种
15 株乳酸菌，编号分别为：2.10、K、M、F、U、Dx、SJ-01、L- N 3、LB-12、JT-03、BC-12、BC-13、BC-23、BC-25、BC-32，由四川农业大学微生物实验室提供。
1.1.2 培养基
改良MRS液体培养基：蛋白胨10.0 g、牛肉粉5.0 g、酵母粉4.0 g、葡萄糖20.0 g、吐温-80 1.0 mL、K 2HPO 4·3H 2O 1.52 g、醋酸钠5.0 g、柠檬酸三铵2.0 g、MgSO 4·7H 2O 0.58 g、MnSO 4·H 2O 0.19 g，蒸馏水1 000 mL，pH 6.2，分装后121 ℃高压灭菌15 min。
1.1.3 试剂与仪器
亚硒酸钠（分析纯）、硝酸、高氯酸、5 g/100 mL乙二胺四乙酸二钠盐（ethylenediamine teraacetic acid disodium salt，EDTA-2Na）、3，3’-二氨基联苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）等均为优级纯。
SW-CJ-2D超净工作台 苏州智净净化设备有限公司；SHP-250恒温培养箱 上海鸿都电子科技有限公司；DL-5000B-II冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂；DK-S28电热恒温水浴锅、DZF-6050电热真空干燥箱上海精宏实验设备有限公司；ESJ210-4A电子精密天平 沈阳龙腾电子有限公司；Carry60紫外-可见分光光度计 安捷伦科技有限公司；T100型梯度PCR仪、580BR 3755荧光定量PCR仪、Dio-Gel-2000凝胶成像仪 美国Bio-Rad公司。
1.2 方法
1.2.1 菌种活化
为了提高菌种的活力，将各菌株接种于液体MRS培养基中，36 ℃适宜条件下培养18 h，并连续活化培养3 代，用生理盐水稀释，调整OD 600 nm为0.60，即得到种子液，备用。
1.2.2 菌种的生化鉴定
挑取典型菌落进行糖发酵试验，参考GB 4789.35—2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》、《伯杰细菌鉴定手册》、《乳酸菌分类鉴定及实验方法》，初步鉴定乳酸菌的属种 ［17-19］。
1.2.3 乳酸菌生长曲线测定
通过测定乳酸菌生长曲线，确定适宜的加硒时间和培养时间。种子液以5%的接种量接入到改良MRS液体培养基中，装液量150 mL/250 mL三角瓶（以下接种相同） ［20］，36 ℃静止培养。每隔2 h取出，采用比浊法，测定乳酸菌菌液的OD 600 nm值，绘制生长曲线。
1.2.4 适宜硒质量浓度的选择
根据生化鉴定结果，每种菌属选出一些菌株，接种于含不同亚硒酸钠质量浓度（0、2、4、6、8、10、12、14 μg/mL）的液体培养基中培养24 h，5 000 r/min离心10 min，观察菌体颜色变化，确定最适加硒质量浓度 ［21］。
1.2.5 耐硒能力测定
测定所有株菌在适宜无机硒质量浓度下的生物量，每株菌两个平行，同时做空白对照实验，选出耐硒能力较强的菌株，-20 ℃保藏备用。
1.2.6 富硒能力实验
将选出的耐硒能力较强的菌株接种于含适宜硒浓度的改良MRS液体培养基中，每组做两个平行，同时做空白对照实验，36 ℃适宜条件下富硒培养。收集菌体培养物，测富硒量和硒转化率，选出一株富硒能力强的乳酸菌，-20 ℃保藏备用。
1.2.7 乳酸菌生物量的测定
将菌体培养物于65 ℃烘干至恒质量，计算每100 mL培养基菌体干质量。
1.2.8 菌体培养物制备
菌体培养物以5 000 r/min离心10 min，倾去上清液，加入30 mL双重蒸馏水，混合均匀后离心（5 000 r/min，10 min），倾去上清液。如此反复洗涤3 次，将附着于细胞表面的硒洗去。最后5 000 r/min离心20 min获得最终菌体培养物，65 ℃烘干，密封保存。
1.2.9 硒含量测定
采用DAB分光光度法检测硒含量 ［22］。
1.2.9.1 标准曲线绘制
准确吸取10 μg/mL的硒标准溶液0、2、4、6、8、10 mL分别加到100 mL的烧杯中，加水至35 mL，再加入5 g/100 mL EDTA-2Na溶液1 mL，摇匀，并用1：1的盐酸调节pH值至2～3，各加0.5% DAB溶液4 mL，摇匀，置于暗处30 min，再用5% NaOH调节pH值至中性，加入到分液漏斗中，加入10 mL甲苯振摇2 min，静置分层，去水层，收集甲苯层于比色皿中，于420 nm波长处测吸光度，绘制标准曲线 ［23］。
1.2.9.2 菌体培养物中硒的测定
称取约0.1 g干菌体样品于带刻度具玻璃塞10 mL 试管中，加入混合酸消化液（硝酸-高氯酸（5：1，V/V））0.6 mL，放置过夜。然后将试管置于100 ℃水浴锅中加热4 h。当试管内黄褐色气体排尽后，取出试管放冷却，加入30%过氧化氢溶液2 mL，继续置于沸水浴中消化，至消化液呈现无色或淡黄色即达终点。取出试管放冷却后，以超纯水定容至10 mL，待上机测定。同时作空白对照 ［24］。
1.2.9.3 培养上清液中残留硒含量测定
取20 mL上清液，加水至35 mL，加入2 mL 5 g/100 mL EDTA-2Na溶液，以下同标准曲线制定步骤 ［25］。同时作空白对照。
1.2.10 乳酸菌菌株16S rDNA分析
采用细菌基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）试剂盒提取菌株的DNA；向各无菌EP管中依次加入9.5 μL超纯水、12.5 μL 2×PCR Master Mix、上下游引物各1 μL、DNA模板1 μL，瞬离后置于荧光定量PCR仪中，于如下PCR扩增条件中扩增：94 ℃预变性5 min，一次循环；94 ℃变性1 min，65 ℃复性1 min，72 ℃延伸20 s，经30 个循环后，72 ℃继续延伸10 min，一次循环；扩增后的DNA在1%琼脂糖凝胶板上于80 V电泳50 min，再凝胶成像；将DNA送检测序，通过BLAST方法比对，鉴定出所得菌株。
2.1 生化鉴定结果
通过19 种糖发酵管鉴定出15 种菌的种属，结果见表1。
表1 生化鉴定结果
Table1 Biochemical identification resultss
乳酸菌种类乳酸菌编号植物乳杆菌Dx、K、M、JT-03、SJ-01、BC-23、L-N 3、BC-25干酪乳杆菌F、U、BC-12干酪乳杆菌假植物亚种LB-12、2.10嗜酸乳杆菌BC-13木糖乳杆菌BC-32
图1 乳酸菌生长曲线
Fig.1 Growth curves of lactic acid bacteria （LAB）
2.2 加硒时间和培养时间的确定
15 株乳酸菌的生长曲线如图1所示，在培养6 h后，菌的生长开始进入对数期，24 h后，部分菌开始降解。由于加硒时间越早，对菌生长的抑制作用越强，在对数期菌的生长代谢旺盛，转化率高。Suhajda等 ［26］研究发现，在酵母细胞对数生长期前期添加无机硒，所得酵母的含硒量最高，并随着对数期细胞增殖，富硒能力增强，以后随稳定期接近而逐渐减弱。靳志强等 ［27］研究也发现，在对数生长初期加入亚硒酸钠可以得到菌体硒含量和细胞硒转化率均最大的结果。因此从转化率和生长周期考虑，选择乳酸菌进入对数生长初期时加入无机硒，即培养6 h后加入亚硒酸钠溶液，培养24 h。
2.3 适宜硒质量浓度的确定
根据表1的生化鉴定结果，每个种属乳酸菌选择一些进行不同硒质量浓度的富硒实验，植物乳杆菌：M、BC-23、L-N 3、BC-25，干酪乳杆菌：U、BC-12，干酪乳杆菌假植物亚种：2.10，嗜酸乳杆菌：BC-13，木糖乳杆菌：BC-32，共9 株菌。不同菌株在不同亚硒酸钠质量浓度下的菌体颜色变化见表2。
表2 9 株菌在不同亚硒酸钠质量浓度下培养24 h后的菌体颜色变化情况
Table2 Color changes of 9 strains cultured at different concentrations of sodium selenite for 24 h
注：-. 正常；+. 微红；++. 淡红；+++. 红。
菌株编号0 μg/mL2 μg/mL4 μg/mL6 μg/mL8 μg/mL10 μg/mL 12 μg/mL 14 μg/mL BC-23---+++++++ M--+++++++++++ 2.10---+++++++ L-N 3---++++++++++++ U---++++++++ BC-12--++++++++++++ BC-13---++++++++ BC-25---++++++++ BC-32---++++++++
由表2可知，在所设定的亚硒酸钠质量浓度范围内，菌体颜色变红的程度与亚硒酸钠质量浓度呈正相关，说明亚硒酸钠质量浓度越高，转变成为单质硒的量越多 ［28］。质量浓度低于6 μg/mL时菌体颜色正常，6 μg/mL时菌体颜色变红不明显，为了使更多的无机硒进入细胞转化成有机硒，较少单质硒的转化。因此，以6 μg/mL作为加硒质量浓度。
2.4 耐硒筛选结果
同属不同种细菌对无机硒的耐受能力不同 ［25］，耐硒能力大小可以用多种指标反映，如细菌光密度（OD 600 nm）值 ［29］、透明圈大小、红硒现象出现所对应的无机硒质量浓度 ［30］、生物量 ［31］等。本实验通过比较相同无机硒质量浓度下生物量变化大小，以筛选出耐硒能力较强的菌株。15 株菌在6 μg/mL亚硒酸钠质量浓度下富硒培养后，各株菌的生物量测定结果如表3所示。
表3 15株菌在6μg/mL亚硒酸钠质量浓度下培养后的生物量测定结果
Table3 Biomasses of 15 strains cultured with 6μg/mL sodium selenite
菌株编号生物量/（g/100 mL）加硒与空白的生物量差值/（g/100 mL）空白加6 μg/mL无机硒Dx0.205 30.202 3-0.003 0 K0.050 00.042 2-0.007 8 M 0.208 50.132 7-0.075 8 JT-030.193 50.187 4-0.006 1 SJ-010.155 50.147 6-0.007 9 BC-230.180 80.173 3-0.007 5 L-N 30.161 10.140 1-0.021 0 BC-250.247 2 0.257 2 0.010 0 F0.057 80.047 1-0.010 7 U0.047 90.045 8-0.002 1 BC-120.261 8 0.260 8 -0.001 0 LB-120.205 50.198 8-0.006 7 2.100.147 10.139 0-0.008 1 BC-130.271 7 0.281 3 0.009 6 BC-320.288 5 0.289 5 0.001 0
比较加硒与未加硒乳酸菌生物量的变化（表3）发现，加了6 μg/mL亚硒酸钠后，除BC-25、BC-13、BC-32生物量有增加外，其他12 株菌的生物量均有不同程度的降低，说明6 μg/mL亚硒酸钠的添加能抑制大多数菌的生长，而促进BC-25、BC-13、BC-32的生长。生物量增加顺序为：BC-25＞BC-13＞BC-32，BC-25和BC-13明显高于BC-32，说明BC-25和BC-13存活的总菌数大于BC-32，因此，确定BC-25、BC-13两株菌株均具有相对较强的耐硒能力。
2.5 富硒能力测定结果
表4 分光光度法测硒含量结果
Table4 Sodium selenite concentration in cultured cells and supernatants as determined spectrometrically by spectrophotometer
菌株编号上清液中残留硒含量/（μg/mL）菌体中硒含量/（μg/mL）富硒量/（μg/g）硒转化率/%空白组加硒组空白组加硒组BC-132.82.650.62.25188.9613.27 BC-252.01.700.64.80425.7927.00
由表4可知，未加硒的空白上清液中测出的硒含量也较高，可能是培养基的色素被有机溶剂提取出来了，干扰了测定结果，使对照组测定结果较高，因此以菌体培养物中硒含量测定来分析硒转换率。
由菌体中硒含量测定结果可知，富硒量和硒转化率都一样BC-25＞BC-13，因此确定BC-25具有相对较强富硒能力。关于富硒能力研究，Calomme等 ［32］通过对3 株乳酸菌进行富硒培养时发现，添加硒（Ⅳ）质量浓度为1 mg/L时，3 株菌的硒含量分别为（253±50）、（375±33）、（407±108） μg/g，本实验筛选出的BC-25富硒量425.79 μg/g，说明BC-25具有较好富硒性能。
2.6 BC-25的16S rDNA分析结果
图2 BC-25的16S rDNA PCR扩增产物电泳图
Fig.2 Electrophoretogram of PCR-amplified 16S rDNA of BC-25
表5 菌株BC-25的BLAST同源性比较结果
Table5 Homology between BC-25 and other strains by BLAST analysis
菌种匹配分值总体分值覆盖率/%E值相似度/%序列号Lactobacillus plantarum WCFS12 66313 297970.099NC 004567.2 Lactobacillus brevis ATCC 3672 17010 843960.094NC 008497.1 Pediococcus claussenii ATCC BAA-344 2 1348 524930.095NC 016605.1
由系统发育树和对比结果（表5）可知，被测菌株BC-25与Lactobacillus plantarum WCFS1的匹配一致性达到99%，同时结合生化鉴定结果来看，可以确定被测菌株BC-25即为一株植物乳杆菌。
本实验通过对15 株菌生长曲线测定，确定适宜的加硒时间为培养后的第6小时，培养时间为24 h；通过适宜硒质量浓度选择，确定适宜的亚硒酸钠添加质量浓度为6 μg/mL；根据耐硒能力、富硒能力及硒含量测定，选出BC-25为富硒优势菌株，富硒量为425.79 μg/g，硒转化率为27.00%，具有相对较强的富硒能力。16S rDNA序列分析鉴定结果确定BC-25为Lactobacillus plantarum。本研究为在益生菌中寻找富硒载体提供了一定依据，但是本实验筛选出的乳酸菌富硒能力还有待提高，为了进一步提高它的耐硒富硒能力，可以考虑对其进行更多富硒条件优化，如耐硒驯化、紫外诱变等。
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Screening and Identification of Se-Enriching Lactic Acid Bacteria
ZENG Yiting， GUO Xilang， ZHOU Kang
*， LIU Shuliang， HAN Xinfeng
（College of Food Science， Sichuan Agricultural University， Ya’an 625014， China）
Abstract：A total of 15 lactic acid bacteria derived from 5 species were studied by comparing their growth curves and abilities to tolerate and enrich Se. We also identified and characterized the selected strain by biochemical and molecular biological methods. The results showed that the optimum time to add Se was at the end of 6-hour culture period after which the culture was carried out for another 18 hours. The optimum sodium selenite concentration for Se enrichment was found to be 6 μg/mL by comparing 9 selected strains. The strain BC-25 was eventually selected as the best Se-enriching strain， which could enrich 425.79 μg/g of Se with a transformation rate of 27.00%. The 16S rDNA sequence results indicated that BC-25 is Lactobacillus plantarum.
Key words：lactic acid bacteria； Se enrichment； screening； identification
中图分类号：TS254
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2015）03-0178-05
doi：10.7506/spkx1002-6630-201503034
收稿日期：2014-10-09
作者简介：曾议霆（1990—），女，硕士，研究方向为食品质量与安全。E-mail：1032401816@qq.com
*通信作者：周康（1983—），男，副教授，博士，研究方向为食品质量与安全。E-mail：kang_zhou@163.com