杏鲍菇多糖对S180荷瘤小鼠的保护作用

刘海英 1,范刘士博 2

(1.唐山市农业科学研究院,河北 唐山 063000;2.天津市宝坻区第四中学,天津 301800)

摘 要:目的:分析杏鲍菇多糖对S180荷瘤小鼠的保护能力和对化疗效果的影响。方法:将小鼠随机分为6 组:空白对照组(A组)、用糖对照组(B组)、肿瘤模型组(C组)、化疗组(D组)、感染用糖组(E组)和化疗用糖组(F组)。其中“用糖”是指在40 d的实验期间内一直腹腔注射100 mg/(kg·d)(以体质量计,下同)杏鲍菇多糖,“感染”是指在实验第1天一次性后肢皮下注射3 mL/kg新鲜制备的含有S180肿瘤细胞的种鼠腹水;“化疗”是指小鼠接种S180细胞10 d后腹腔注射5.0 mg/kg顺铂,间隔1 d注射一次,共注射5 次。接种20~40 d时观测死亡率、体质量、白细胞数量和腹水超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)活性及丙二醛(malondialdehyde,MDA)浓度。结果:杏鲍菇多糖能够显著降低S180荷瘤小鼠的死亡率,延长小鼠存活时间,增加血液内白细胞数量,增强腹水SOD和CAT的酶活性,降低MDA浓度,降低化疗对小鼠免疫能力的影响(P<0.05)。结论:杏鲍菇多糖对S180荷瘤小鼠具有极强的保护作用,并且能够降低顺铂化疗的副作用。

关键词:杏鲍菇多糖;S180肿瘤细胞;化疗;保护作用

目前,真菌多糖抗肿瘤的免疫调节作用受到越来越多的重视。例如,灵芝多糖已成为临床治疗肿瘤的辅助药物,香菇多糖(lentinanum)已被制成抗癌针剂,用于胃肠道肿瘤患者的治疗 [1]。真菌多糖虽然不能杀死肿瘤细胞,但能够增强机体免疫力,抑制肿瘤细胞的增生,激活免疫细胞,吞噬、清除老化细胞和异物 [2]。杏鲍菇是一种集食用、药用于一体的名贵珍稀食用菌,杏鲍菇多糖是其主要的活性物质,具有降血脂、降胆固醇、防止动脉硬化、促进胃肠消化、增强机体免疫力和美容的功效 [3-4]。杏鲍菇多糖具有较强的清除羟自由基(·OH)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基和NO 2 -自由基能力 [5]的体外抗氧化活性 [6-7],还具有抗疲劳、提高老龄小鼠的运动能力 [8]、对白色链球菌和产气杆菌的抑菌作用 [9],而且抑制Ⅰ型单纯疱疹病毒的作用强度与阿昔洛韦相当 [10]。迟桂荣等 [11]发现杏鲍菇多糖具有一定的抑瘤作用,本研究在此基础上,系统分析了杏鲍菇多糖对S180荷瘤小鼠的保护作用,同时观测了杏鲍菇多糖与顺铂化疗协同作用的抑瘤效果,为杏鲍菇多糖的临床应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料、动物与试剂

杏鲍菇:PL7菌株,购自河北农业大学园艺学院。

小鼠:清洁型,雄性,7 周龄,体质量(18.2± 1.62) g,购于河北联合大学实验动物中心,动物合格证编号:08048,动物使用许可证号:SYXK(冀)2004-0038。S180(小鼠腹水型肝癌)细胞:用注射器取接种S180细胞7 d种鼠的腹水1.0 mL,以无菌生理盐水稀释后,用血球计数板进行活细胞计数,调整细胞数为1×10 7个,制成肿瘤细胞悬液(活细胞率>95%),使用前新鲜制备。

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)测试盒(A001-1,羟胺法)、过氧化氢酶(catalase,CAT)测试盒(A007-2,紫外分光光度法)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)测试盒(A003-1,硫代巴比妥酸比色法) 南京建成生物工程研究所。顺铂(cisplatin) 锦州九泰药业公司。

1.2 仪器与设备

752N紫外分光光度计 上海精密科学仪器有限公司;YX-280高压蒸汽灭菌器 合肥华泰医疗设备有限公司;TGL-16GR多用途台式高速冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂;HH-8数显恒温水浴锅 江苏省金金坛市医疗器厂;Adventurer TM精密分析天平 奥豪斯仪器(上海)有限公司;奥林巴斯CX41光学显微镜 奥林巴斯(中国)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 杏鲍菇多糖的提取和质量浓度测定

利用热水浸提法提取杏鲍菇菌丝多糖 [12],利用Sevag方法 [13]去除蛋白质,利用茚三酮反应检测蛋白质,利用蒽酮比色法 [14]制作葡萄糖标准曲线,按刘海英等 [15]的方法测定菌丝多糖的质量浓度。

1.3.2 动物分组及处理

清洁型小鼠基础饲料预饲养7 d,称质量并编号,选取60 只体形一致、毛色相同、精神状态饱满的小鼠,按10 只/组随机分为6 组:空白对照组(A组)、用糖对照组(B组)、肿瘤模型组(C组)、化疗组(D组)、感染用糖组(E组)和化疗用糖组(F组)。均饲喂相同批次基础饲料。

A组按100 mL/(kg•d)的剂量(以体质量计,下同)腹腔注射生理盐水;B组:按100 mg/(kg•d)的剂量腹腔注射杏鲍菇多糖;C组:在实验第1天按0.2 mL/只的剂量一次性在小鼠后肢皮下注射新鲜制备的S180肿瘤细胞悬浮液;D组:同C组,注射S180细胞10 d后腹腔注射5.0 mg/kg顺铂,间隔1 d注射一次,共注射5 次;E组:同C组,注射S180细胞后第2天按100 mg/(kg•d)的剂量腹腔注射杏鲍菇多糖;F组:同C组,注射S180肿瘤细胞后第2天按100 mg/(kg•d)的剂量腹腔注射杏鲍菇多糖,并在10 d后腹腔注射5.0 mg/kg顺铂,间隔1 d注射一次,共注射5 次。

1.3.3 生理指标分析

接种S180细胞40 d时,统计各组小鼠的存活率、平均存活时间和生存延长率;接种S180细胞20 d时,用注射器抽取小鼠腹水1 mL/只,2 000 r/min离心取上清液,测定SOD活性、CAT活性及MDA含量;接种S180细胞20 d时,试管内放体积分数1%的稀盐酸1.98 mL,断尾,毛细管取血20 ☒L加入稀盐酸内,消去红细胞,用血球计数板在40倍镜下观察,统计白细胞数量;接种S180细胞40 d内,用分析天平称量死亡24 h以内小鼠和最后存活小鼠的体质量,剥离肿瘤,电子天平称量肿瘤质量。按照以下公式计算各项指标。

1.4 数据统计处理

所有数据采用DPS 7.05 进行方差分析和多重比较,数据以 表示。

2 结果与分析

2.1 杏鲍菇多糖的提取和浓度测定结果

利用热水浸提法提取到的杏鲍菇菌丝多糖,经过Sevag方法去除蛋白质后,茚三酮反应检测不到蛋白质。利用蒽酮比色法获得了葡萄糖标准曲线:y=0.01x-0.022 2(R 2=0.992 3)。将PL7菌株的菌丝多糖用无菌水配制100 μg/mL溶液,按照葡萄糖标准曲线,测定其菌丝多糖质量浓度为(3.699±0.230)mg/g。

2.2 杏鲍菇多糖对S180荷瘤小鼠存活率的影响

表1 杏鲍菇多糖对S180荷瘤小鼠存活时间的影响
Table1 Effects of Pleurotus eryngii polysaccharides on survival time of S180-bearing mice

注:同行小写字母不同表示组间差异显著(P<0.05)。下同。

组别A组B组C组D组E组F组存活率/%100.0100.00.00.020.030.0平均存活时间/d 40.0±0.0 a40.0±0.0 a20.9±2.5 d28.8±3.7 c36.8±2.1 ab37.6±1.4 ab生存延长率/%0.037.876.179.9

由表1可知,A组和B组小鼠在实验期间都表现为健康正常。C组小鼠接种S180细胞5 d后有小鼠可触及肿瘤,10 d内小鼠成瘤率100%。成瘤后小鼠饮食减少,活动减少或很少活动,毛发杂乱无光泽,竖毛现象明显。16 d后开始出现小鼠死亡,24 d内所有小鼠死亡,平均存活时间为(20.9±2.5) d。

D组小鼠10 d内成瘤率100%,注射顺铂后小鼠的活动能力有所增强,进食略有增加,竖毛现象略有减少,但毛色依然无光泽,且有脱毛现象。21 d后小鼠开始出现死亡,33 d内小鼠全部死亡,平均存活时间(28.8±3.7) d。

E组小鼠10 d内成瘤率50%,20 d时成瘤率80%,30 d时成瘤率100%。小鼠活泼,皮毛有光泽,竖毛现象不明显。27 d后小鼠开始出现死亡,40 d内小鼠存活率20%,平均存活时间(36.8±2.1) d。

F组小鼠31 d时成瘤率100%。小鼠活泼,皮毛有光泽,竖毛现象和脱毛现象都不明显。29 d后小鼠开始出现死亡,40 d内小鼠存活率30%,平均存活时间(37.6±1.4) d。以B组为对照,E组和F组的生存延长率分别为76.1%和79.9%。

2.3 杏鲍菇多糖对S180荷瘤小鼠体质量和抑瘤率的影响

表2 杏鲍菇多糖对S180荷瘤小鼠体质量和抑瘤率的影响
Table2 Effects of Pleurotus eryngii polysaccharides on body weight and tumor size of S180-bearing mice

组别A组B组C组D组E组F组体质量/g21.5±0.9 c22.0±0.7 c26.2±1.3 a24.8±1.5 ab23.3±0.4 b22.8±0.5 c实体瘤质量/g4.71±0.96 a3.31±1.76 b1.44±0.51 c1.11±0.42 c抑瘤率/%0.0029.72 a69.43 b76.43 b

由表2可知,与A组小鼠相比,B组小鼠的体质量没有显著变化,而C组荷瘤小鼠由于肿瘤的生长速率快,加速了小鼠的死亡,使C组小鼠的平均体质量没有下降,反而有所增加,比A组体质量提高了21.90%。 D组化疗小鼠体质量增加与C组荷瘤小鼠相比较为缓慢,体质量平均增加15.39%。E组和F组经杏鲍菇多糖处理,使得荷瘤小鼠和化疗小鼠的体质量分别下降11.25%和12.92%,其主要原因是显著抑制了肿瘤的发展,实体瘤质量显著降低,对荷瘤小鼠和化疗小鼠的抑瘤率分别达到69.43%和72.43%,显著高于D组顺铂化疗的抑瘤率(29.72%)。

2.4 杏鲍菇多糖对S180荷瘤小鼠白细胞数量的影响

图1 杏鲍菇多糖对荷瘤小鼠血液中白细胞数量的影响
Fig.1 Effects of Pleurotus eryngii polysaccharides on the number of blood leucocytes in S180-bearing mice

接种S180细胞20 d时测定小鼠白细胞数量,各处理组的白细胞浓度见图1。A~F组小鼠血液中的白细胞数量分别为(12.17±0.50)×10 9、(15.54±0.49)×10 9、(9.16±0.68)×10 9、(8.36±0.67)×10 9、(14.03±0.91)×10 9、(14.89±1.04)×10 9个/L,与A组小鼠相比,C组荷瘤小鼠血液中的白细胞数量下降了24.7%,形状不规则。D组小鼠化疗后白细胞数量比A组正常小鼠下降了31.3%,比C组荷瘤小鼠下降了8.7%。杏鲍菇多糖处理后,B组正常小鼠、E组荷瘤小鼠和F组化疗小鼠的白细胞数量都显著增加,增加幅度分别达到27.67%(以A组为对照)、53.17%(以C组为对照)和78.11%(以D组为对照),并且细胞形态正常、规则。

2.5 杏鲍菇多糖对S180荷瘤小鼠腹水酶活性及丙二醛含量的影响

接种S180细胞20 d时测定小鼠腹水酶SOD和CAT活性、丙二醛含量,由表3可知,与A组正常小鼠相比,C组荷瘤小鼠腹水酶SOD和CAT的活力分别下降26.77%和26.33%,MDA含量上升36.89%;D组化疗小鼠腹水酶SOD和CAT的活力分别下降26.52%和26.53%,MDA含量上升29.92%。注射杏鲍菇多糖后,B组正常小鼠、E组荷瘤小鼠和F组化疗小鼠腹水酶SOD和CAT的活性均显著增强,MDA含量显著降低,其中SOD活力分别增加41.33%(以A组为对照)、63.28%和5 3.86%(以C组为对照),CAT活力分别增加131.54%(以A组为对照)、145.00%和159.18%(以C组为对照),MDA含量分别降低3.58%(以A组为对照)、26.61%和20.14%(以C组为对照)。杏鲍菇多糖对CAT的酶活性具有非常显著的刺激作用,可提高S180荷瘤小鼠CAT酶活力1.5 倍左右。

表3 杏鲍菇多糖对S180荷瘤小鼠腹水酶活性及丙二醛浓度的影响
Table3 Effects of Pleurotus eryngii polysaccharides on the activities of SOD and CAT and MDA content in the ascites of S180-bearing mice

组别A组B组C组D组E组F组SOD活力/(U/mL)203.06±25.14 c*286.98±43.33 a148.69±24.94 d149.21±28.48 d242.79±20.93 b236.21±33.78 bcCAT活力/(U/g)805.76±118.71 c1 865.67±274.86 a625.84±92.20 d591.94±112.98 d1 545.82±133.24 b1 622.07±231.99 bMDA浓度/(nmol/mL)4.60±0.31 c4.43±0.30 c6.29±0.47 a5.97±0.40 ab4.62±0.32 bc5.02±0.34 b

3 讨 论

Shamtsyan等 [16]研究表明,菌丝体多糖具有比子实体多糖更强的生物学活性,作用的活性氧形式更多,外周血中性粒细胞数量的增加程度更大,促进细胞有丝分裂的浓度范围更宽,更易刺激外周血细胞中白细胞介素(interleukine)的产生,对移植小鼠黑色素瘤B16的抑瘤率和存活率更高。另外,子实体多糖的产量和质量极易受到食用菌生产周期和子实体质量的影响,难以标准化和规模化生产。而采用液体发酵技术生产菌丝体,周期短、成本低、产量大,多糖制备容易实现标准化,多糖质量容易得到控制,因此非常适于工业化大规模生产 [17]。本实验采用杏鲍菇菌丝多糖进行抑瘤实验更有利于杏鲍菇多糖的开发和利用。

本研究结果表明,杏鲍菇菌株PL7的菌丝多糖能够显著提高荷瘤小鼠的生存率,抑制肿瘤的发展,抑瘤效果与黑木耳多糖 [18]、香菇多糖 [18-20]、榆黄菇多糖 [21]、灵芝多糖 [22]相似。杏鲍菇PL7多糖还可以增加血液中的白细胞数量,增强腹水酶SOD和CAT的活性,降低MDA含量,尤其在增强CAT酶活性方面表现更突出,可提高荷瘤小鼠CAT酶活性1.5 倍。这与前期研究中发现杏鲍菇多糖具有较强的清除自由基和抗氧化能力的实验结果是一致的 [5-7]

顺铂是临床应用比较广泛的一种抗癌药物,主要作用机制是通过损伤DNA,使细胞进入G 1期生长受到抑制,并诱导损伤严重的细胞进入凋亡状态 [23]。顺铂的副作用较大,在杀死肿瘤细胞的同时也会伤害正常细胞,尤其是免疫细胞。添加食用菌多糖是降低顺铂化疗的副作用和增强化疗效果的有效途径之一。香菇多糖辅助顺铂化学治疗肺癌 [24]、卵巢癌 [25]、晚期胃癌 [26],灵芝多糖辅助顺铂化学治疗膀胱癌 [27],灰树花多糖联合顺铂治疗肝癌 [28]等均有相关报道。本实验的研究结果表明,杏鲍菇PL7多糖能够显著增加化疗小鼠的白细胞数目,增强化疗小鼠的腹水酶SOD和CAT活性,从而降低化疗过程中产生的副作用,化疗小鼠的生存率和抑瘤率得到显著提高。通过本实验发现,采用杏鲍菇多糖辅助化疗方法比单独化疗和单独多糖处理时,血液中白细胞增加的数目更多,荷瘤小鼠的生存延长率和抑瘤率更高,抑瘤效果更显著,具有一定的临床应用前景。

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Protective Effects of Pleurotus eryngii Polysaccharides on S180 Tumor-Bearing Mice

LIU Haiying 1, FAN Liushibo 2
(1. Agricultural Institute of Tangshan, Tangshan 063000, China; 2. Tianjin Baodi No.4 High School, Tianjin 301800, China)

Abstract:Objective: This study aimed to examine the protective effects of Pleurotus eryngii polysaccharides (PePs) on mice bearing sarcoma 180 (S180) cells and the efficacy of PePs in reducing the side-effects of chemotherapy with cisplatin. Methods: Healthy male mice were randomly divided into blank control group (A), PePs treatment group (B), model blank group (C), chemotherapy group (D), Peps treatment group (E) and Pep treatment plus chemotherapy group (F). PePs were intraperitoneally injected at a dose of 100 mg/(kg・d) body weight (bw) daily for 40 days. A single dose of ascites fluid(3 mL/kg bw) from mice inoculated with S180 was subcutaneously injected on the first day of experiment. Chemotherapy was achieved by five repeated intraperitoneal injections of 5.0 mg/kg bw of cisplatin every other day from 10 days after administration of S180 cells. During 20-40 days after inoculation of S180 cells, the death rate, body weight, blood leucocyte number, superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) activities, malondialdehyde (MDA) concentration in the ascites fluid of mice were measured. Results: The fungal polysaccharides significantly reduced the mortality rate of S180-bearingmice, prolonged the survival time, increased the number of blood leucocytes, enhanced the activities of ascites SOD and CAT enzymes, decreased the ascites MDA concentration, and reduced the adverse effects of chemotherapy on mouse immunity (P < 0.05). Conclusion: PePs possess strong protective effects on S180-bearing mice and reduce the side effects of cisplatin chemotherapy.

Key words:Pleurotus eryngii polysaccharides; sarcoma 180 (S180) cells; chemotherapy; protective effect

中图分类号:R151.3

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2015)03-0198-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201503038

收稿日期:2014-05-08

基金项目:河北省自然科学基金项目(10220126)

作者简介:刘海英(1968—),女,副研究员,本科,研究方向为食用菌。E-mail:lhy688@126.com