赵 丹 1，2，杜仁鹏 1，2，刘鹏飞 1，2，潘 超 1，2，葛菁萍 1，2，*
（1.黑龙江大学生命科学学院，微生物黑龙江省高校重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150080；2.农业微生物技术教育部工程研究中心，黑龙江 哈尔滨 150500）
摘 要：代谢组学以生物系统中的细胞在特定条件下所有小分子代谢物为研究对象，定性并定量描述生物内源性代谢物及其对内因和外因变化的应答规律。近年来代谢组学技术成为食品科学研究中不可或缺的工具，尤其是在以植物为原材料进行加工或直接食用的植物源性食品中，代谢组学技术广泛用于检测不易挥发性化合物。本文简要介绍代谢组学主要技术平台、研究流程和统计方法，着重论述代谢组学在植物源性食品的品质鉴定、安全性及防伪评估、原料动态监控以及食品分类中的应用现状及发展趋势。
关键词：代谢组学；植物源性食品；核磁共振；质谱
20世纪70年代，Devaux等 ［1］基于代谢轮廓分析（metabolic profiling）第一次提出代谢组学（metabolomics）概念。之后Nicholson等 ［2］于1999年重新定义了代谢组学，并利用核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）技术分析大鼠的尿液，对生物体内随时间改变的代谢物进行动态检测、定量、分类，从而寻找相关的生物标志物。代谢组学技术可同步实时定量分析细胞、器官、生物体内维持其正常生长和功能的小分子代谢物或化学分子（＜1 500 u） ［3］。
植物源性食品（plant-derived food）指以植物为原材料进行加工或直接食用的健康安全食品，其质量保证和生产过程需要有高度规范、统一的标准 ［4］。代谢组学允许同时表征大量化学分子和生物材料，为植物源性食品提供详细、准确的代谢物构成分析 ［5］。通过大量研究发现，在食品研究中，充分利用代谢组学这个研究工具，可建立灵敏可靠特异的快速检测方法，使得食品中小分子化学物质的分离鉴别相对快速简易，并已经成功用于食品原材料和最终产品的质量鉴定 ［6］。代谢组学能够分析所有代谢物的集合，系统研究代谢物的变化规律，被认为是具有潜在应用价值的工具，为食品科学相关研究提供了新思路和技术。本文主要介绍代谢组学技术作为一种工具，在植物源性食品的品质鉴定、安全把控、加工贮藏、产品分类中的应用，以及如何运用代谢组学技术分析和鉴定植物源性食品进行简要的概述和展望。
完整的代谢组学分析的流程是指对代谢物进行分离、检测、数据处理及分析的过程。经研究发现，并不是每一个步骤都是必需的，分离和检测被认为是代谢组学技术的核心部分，样品处理之后，选择一种能分析出所有代谢物的技术手段至关重要 ［7］。其中分离技术包括：气相色谱（gas chromatogram，GC）、毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）和液相色谱（liquid chromatogram，LC）。由于这些技术具有技术成熟、易掌握、检测灵敏度高、分离效能高、选择性高、检出限低、样品用量少、方便快捷等特点，已被广泛应用于食品工业的安全评估中 ［8］。代谢组学检测平台中最常用的是质谱（mass spectrometry，MS）和NMR技术，MS技术具有灵敏度高、样品用量少、分析速度快、可鉴定待测物结构等优点，广泛应用于食品科学研究中，特别是其快速定性功能使其在植物挥发性代谢产物分析中得到广泛应用 ［9］。NMR图谱可以使NMR波信号在样品中定位，为进行食品内部结构的直观透视研究提供强有力的技术手段，对植物源性食品加工和贮藏过程中的生化反应以及化学变化进行跟踪研究 ［10］。数据处理及分析主要包括化学物质定性定量和统计学分析，分离的化学物质通过色谱数据库检索并和标准品的保留时间进行对比来定性鉴别，代谢组学数据分析以多维数据分析（multivariate data analysis，MVDA）为主 ［11］。由于数据量非常大，采用常规统计分析方法既难以发现样品之间或各组之间的异同，也难以发现样品中的哪些变量（分子）造成上述差异。因此代谢组学数据需要特殊方法加以分析，其中应用最广泛的是主成分分析（principal components analysis，PCA），它可以用来归类区分不同处理样品之间的不同。除此之外，还有非线形映射（nonlinear mapping，NLM）、聚类分析（hierarchical cluster analysis，HCA）等非监督学习方法和软独立建模分类法（soft independent modeling of class analogy，SIMCA）、偏最小二乘法显著分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）和神经网络分析（artificial neural network，ANN）等有监督学习方法 ［12］。常用的代谢组学分析软件有MATLAB、SAS、SPSS、SIMCA等 ［13］，可根据研究需要选择合适的方法。
代谢组学详细而全面的分子图像对在评估食品质量、分析不同食品中的挥发性化合物，以及鉴别不同物种之间的差异和相近特征的准确性上起着决定性的作用 ［14］。在植物源性食品研究中，一个样品中通常含有多种代谢产物，特别是一些高分子质量不易挥发的极性代谢产物，研究这些物质需要进行化学衍生化或者高温处理，方法和步骤比较复杂，要求较高。目前，气相色谱-质谱联用（GC-MS）、液相色谱-质谱联用（LC-MS）、NMR技术为不同品种作物的生物活性化合物提供一个快速可行的检测手段。有报道称NMR技术可以定性分析西红柿中的特异性糖类、黄酮苷、氨基酸和有机酸化合物，这些物质与西红柿的口味、香味、成熟阶段和颜色微妙变化密切相关 ［10］。Choi等 ［15］利用NMR对韩国豆酱的生产过程进行了实时检测，并通过PCA发现豆酱发酵过程中糖的质量分数下降，乙酸、酪氨酸、苯丙氨酸等质量分数显著增加。Ali等 ［16］利用NMR耦合MVDA，通过研究葡萄酒的性状来评定葡萄酒的感官品质，结果发现葡萄在成熟期间果浆化学成分的变化影响酒的质量，对其感官品质有重要的影响。其后，Lee等 ［17］用GC-MS和 1H-NMR与PLS-DA模型联用技术构建葡萄酒的代谢图谱，来预测葡萄酒的口感黏度分数，结果显示脯氨酸、乳酸、醋酸、酒石酸、苹果酸和甘油对葡萄酒口感起着至关重要的作用。研究者采用流动注射电喷雾电离质谱（flow injection electrospray ionization mass spectrometry，FIE-MS）和GC-MS评估马铃薯的化学组成，不同品种的马铃薯块茎中代谢物组分与马铃薯品质特征联系密切，其中某些品种的氨基酸（异亮氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸）含量较高。GC-MS结果显示极性代谢物（氨基酸、有机酸、糖和糖醇）和非极性代谢物（包括脂肪酸、脂肪醇和甾醇）差异显著 ［18］。Tarachiwin ［19］和Pongsuwan ［20］等把GC-MS、 1H-NMR、傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared chromatography，FTIR）和超高效液相色谱-串联质谱（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）技术结合起来，用于鉴别绿茶质量等级，并且分析出影响茶叶质量的特征性化合物。
代谢组学技术在植物转基因食品的测定中具有灵敏、准确的优势。Roessnner等 ［21］利用GC-MS对马铃薯块茎中150 种化合物进行了定量和定性分析，确定了过表达葡萄糖激酶和葡萄糖磷酸酶基因转基因植株的生物化学表现型。Catchpole等 ［22］用FTIR和NMR对转基因马铃薯和非转基因马铃薯做了比较分析，多维数据分析结果显示二者之间并无显著区别。这表明代谢组学能快速而简便地评估转基因产品成分组成差异。
原料掺假是假冒伪劣食品生产中的惯用手段，很难通过味道或颜色检测出来。Vardin等 ［23］在FTIR光谱信息的基础上开发出一种快速敏感、高通量且重现性好的分析手段，用于检测果汁真伪。Ogrinc等 ［24］利用同位素比质谱法（isotope ratio mass spectrometry，IRMS）选取掺假的果汁、葡萄酒和橄榄油样品，同时以合格产品为对照，通过PCA或ANN分析结果来区分掺假产品和合格产品。Christy等 ［25］利用色谱技术结合其他化学计量学技术鉴别掺入豆油、玉米油、核桃油的伪劣橄榄油，结果表明：偏最小二乘法的应用可以预测橄榄油中掺入豆油、玉米油、核桃油的误差，结合PCA分析结果可以100%地区分出橄榄油中是否掺假。这些研究表明，代谢组学技术不但可以快速，低成本地识别掺假饮料和油，还可以准确的监测转基因食品的质量问题。
水果在生长成熟过程中，其内部的水分含量与状态、可溶性碳水化合物及油脂含量等都会相应变化。通过对这些成分的测定，即可预知水果的成熟度 ［26］。Carrari等 ［27］用液相色谱串联四极杆飞行时间质谱（liquid chromatography-quadrupole-time of flightmass spectrometry，LC-Q-TOF-MS）和高效液相色谱-二极管阵列检测-荧光检测技术（high performance liquid chromatography-diode array detector-fluorescence detection，HPLC-DAD-FD），对不同成熟阶段番茄果实组织中代谢物的图谱进行比较，区分不同发育阶段并检测各阶段的标志性代谢产物。le Gall等 ［28］研究了番茄成熟过程中茄红素等一系列代谢产物的动态变化，对番茄的成熟机制有了进一步的了解，为加快番茄成熟速度打好了基础。Ku等 ［29］利用 1H-NMR耦合GC-MS技术研究绿茶发酵特征，结果表明绿茶发酵过程中表儿茶素、表儿茶素-3-没食子酸酯、奎尼酸、咖啡因和蔗糖的质量分数不断下降，而没食子酸和葡萄糖的质量分数不断增加。此外，代谢组学技术也可作为采摘后水果生理生化状况的评估工具，为水果的贮存方式选择和营销策略提供依据。Kushalappa等 ［30］利用GC-MS检测水果采摘初期顶部空间的挥发性代谢物来诊断水果疾病，从而帮助人们寻找提高水果保质期的方法。Bianchi等 ［31］基于挥发性代谢产物的代谢轮廓构建了一种新的GC-MS技术，能够尽早检测到橙汁的腐败情况，结果发现被污染的样品中萜醇和酮等挥发性物质的含量增加，而α-里哪醇、萜烃类和线性醛等物质含量下降。
Hong-Seok等 ［32］运用 1H-NMR检测了不同品种（Campbell，Early，Cabernet Sauvignon and Shiraz）和来自不同国家和地区（澳大利亚、法国、美国加州和韩国）的葡萄所生产葡萄酒的差异。Son等 ［33］将NMR和GC-MS结合起来，检测2，3-丁二醇、乳酸、乙酸、脯氨酸、琥珀酸盐、苹果酸盐、甘油、酒石酸盐、葡萄糖和酚类代谢物，然后运用PCA和PLS分析实现了对葡萄酒的分类。Vaclavik等 ［34］的研究利用LC-Q-TOF-MS对来自欧洲和美国的不同地理环境的不同种类葡萄酒进行分类，结果表明矢车菊素-3-O-葡萄糖苷是葡萄酒分类的主要指标。此外，代谢组学技术在植物油的来源及品质鉴定中应用广泛。Ruiz-Samblás等 ［35］运用 GC-MS指纹图谱获得了三酰甘油图谱，1-棕榈酸-2-硬脂酸-3-油酸甘油酯和1，2-油酸甘油酯-3-硬脂酸是区别特级初榨油、初榨橄榄油、橄榄油和果渣油这4 种橄榄油样品的主要代谢产物。Mata-Espinosa等 ［36］利用高效液相色谱-电雾式检测器（high performance liquid chromatography-charged aerosol detection，HPLC-CAD）区分不同类别和品种的橄榄油、食用油（玉米、向日葵、花生大豆、油菜籽、芝麻、葡萄籽）和一些混合油，其中三油酸甘油酯、1，2-油酸-3-棕榈酸和1，2-油酸-3-甘油三亚油酸酯作为区分橄榄油和植物油的鉴别性代谢物。研究表明，NMR与GC-MS联用极大促进了植物源性食品的分类，不仅可以准确地鉴定不易挥发性代谢产物，还可以同时构建多种代谢产物的代谢图谱，为饮料、酒、油的分类提供现实可行的保障手段。
代谢组学是后基因组时代新兴的一种生物表型研究手段，旨在通过一系列的最新科技成果整合代谢产物信息，是系统生物学研究的重要部分。代谢组学技术已经广泛应用到微生物学、植物学、食品学、毒理学和药物学研究中，正朝着整合化、自动化和高通量的方向发展 ［37］。然而，多方面因素又制约着代谢组学技术在食品科学中的广泛使用。首先，代谢组学发展的时间较短，分析对象是无偏向性的样品中所有小分子物质，对分析手段的要求比较高，并且各种技术都各有所长，怎样进行优势互补，使得各种分析技术的数据能统一、交叉验证是一个亟待解决的问题。其次，代谢组学仍属于一种技术潜力尚待开发的新兴学科领域，目前仅有一部分代谢产物已得到识别，仍有相当大的一部分代谢产物未被鉴定，这也成了代谢组学在食品科学中发展的障碍 ［38］。
对于植物源性食品原料，代谢物组成复杂、含量不一，样品在制备过程中流程不统一，以及植物挥发性代谢产物的分析技术尚不完善，许多分析方法仅停留在对植物源性食品组分的定性和初步定量上。植物源性食品研究缺乏系统的研究模式，其中采样、分析技术和数据处理是研究难点，这主要是由于植物挥发性代谢产物浓度低、物质种类多、从极性到非极性跨度大、理化指标各异且常伴随复杂基体，而采样和分析过程中又要求保持其生物活性，导致检测的难度较大 ［39］。因此，植物源性食品及其原料代谢物的分析检测，尤其是现场快速检测是当前该领域的热点和难点。代谢组学技术在植物源性食品研究中的应用，将呈现以下两个趋势：一是将代谢组学技术及数据方法有机结合，有针对性的建立快速、分辨率高、灵敏度强的检测平台和规范统一的检测流程，将有助于促进植物源性食品的发展；二是将代谢组学技术与其他系统生物学技术和高通量数据分析方法结合，有助于我们深入了解植物源性食品代谢物与其所处生态环境中的生物和非生物因素的响应关系，进而帮助我们深入了解并监控植物源性食品产业链的各个环节。
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A Review of Applications of Metabolomics Techniques in Plant-Derived Food Research
ZHAO Dan
1，2， DU Renpeng
1，2， LIU Pengfei
1，2， PAN Chao
1，2， GE Jingping
1，2，*
（1. Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Microbiology， College of Life Science， Heilongjiang University， Harbin 150080， China；2. Engineering Research Center of Agricultural Microbiology Technology， Ministry of Education， Harbin 150500， China）
Abstract：Metabolomics is defined as the quantitative and qualitative measurement of all the endogenous small-molecule metabolites within a biological system as well as its dynamic response to external and internal factors. In recent years，metabolomics techniques have become important research tools in food science and have been widely applied in the detection of nonvolatile compounds present in plant-derived materials used for processing or direct consumption. This paper summarizes the major technical platforms， research procedures and statistical methods involved in metabolomics. The current applications and future trends of metabolomics techniques in authentication and classification of plant-derived foods，assessment of their quality and safety， and dynamic monitoring of the raw materials.
Key words：metabolomics； plant-derived food； nuclear magnetic resonance （NMR）； mass spectrometry （MS）
中图分类号：TS201；C39
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2015）03-0212-05
doi：10.7506/spkx1002-6630-201503041
收稿日期：2014-05-08
基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目（31300355）；国家自然科学基 金面上项目（31270534）；哈尔滨市科技局青年后备人才项目（2014RFQXJ101）；黑龙江大学杰出青年基金项目（JCL201305）；黑龙江省高等学校科技创新团队项目（2012td009）
作者简介：赵丹（1980—），女，副教授，博士，研究方向为微生物生态学。E-mail：zhaodan4u@163.com
*通信作者：葛菁萍（1972—），女，教授，博士 ，研究方向为微生物学。E-mail：gejingping@126.com