黄曲霉毒素的生物合成、代谢和毒性研究进展

罗自生 1,秦 雨 1,徐艳群 1,徐庭巧 2,魏云潇 2,何良兴 2

(1.浙江大学食品科学与营养系,浙江 杭州 310058;2.杭州市余杭区农产品监测中心,浙江 杭州 311199)

摘 要:食品中黄曲霉毒素污染是最近关注的热点,这些毒素侵染农产品会带来很大经济损失。黄曲霉毒素有非常高的肝毒性、肝致肿瘤性、致畸和致突变性,可在采前、采中和采后的各种环境下侵染多种重要农产品,例如花生、玉米、水稻和棉籽。自然界中黄曲霉毒素的产生取决于多种因素,例如碳、氮、温度、水分活度、pH值、发育阶段、氧化胁迫、植物代谢产物。黄曲霉毒素可引起多种疾病,但是可以通过阻断和干扰吸收及干扰代谢酶来调节体内的黄曲霉毒素。本文概述黄曲霉毒素的生物合成、侵染、运输、代谢和毒性。研究它的生物合成、毒性机制、结构与功能关系和代谢运输途径,为制定有效控制黄曲霉毒素的措施提供更加深入的见解。

关键词:黄曲霉毒素;生物合成;侵染;毒性;突变

黄曲霉毒素(aflatoxin,AFT)包括大约20 种真菌代谢产物,可侵染多种食品,包括香料、谷物、无花果、坚果和干果。尽管侵染大多发生在热带地区的粮食作物中,但与之相关的重要食品的国际贸易决定了黄曲霉毒素不仅是生产国家,也是进口国家的难题。黄曲霉毒素主要是由黄曲霉(A. flavus)和寄生曲霉(A. parasiticus)产生的高毒性次生代谢产物。这些真菌在适宜的温度和湿度条件下可以在多种食品和饲料中生长,而且污染可以发生在从田间、采收、处理、输送到贮藏的食品链的任何环节。黄曲霉毒素是一类二呋喃香豆素衍生物,其基本结构中都有二呋喃环和氧杂萘邻酮(香豆素),在紫外光照射下可产生荧光。B族黄曲霉毒素连接戊酮,G族黄曲霉毒素连接的是六元内酯,结晶的黄曲霉毒素B 1(aflatoxin B 1,AFB 1)有较高的热稳定性 [1]。AFB 1对哺乳动物毒性最大,会引起突变、致畸和肝损伤 [2]

黄曲霉毒素具有高毒性和致癌性,通过食物的直接消费或者进食黄曲霉毒素污染的饲料的动物的间接消费对人体起毒害作用。遗传因素、生物和非生物因素影响黄曲霉毒素的形成,研究已经揭示了参与黄曲霉毒素合成的每步反应的酶的功能、编码酶的基因及黄曲霉毒素形成代谢的调控机制。更好地了解调控黄曲霉毒素生物合成的基因将会帮助明确抑制真菌生长和黄曲霉毒素产生的天然因素。遗传和基因组资源将会显著增强我们对黄曲霉毒素生物合成、霉菌的致病性以及霉菌作物的相互作用的理解。关于黄曲霉毒素生物合成基因的功能、基因调控和吸收代谢信号转导的新信息和其与环境介质的相互作用已经在深入研究。本文对黄曲霉毒素的合成、代谢、毒性以及干预方法作一综述。

1 生物合成

黄曲霉毒素的生物合成是一个错综复杂的过程,包含很多酶反应。生物合成的起始阶段类似于脂肪酸的生物合成,即乙酰CoA作为起始单位,丙二酸单酰CoA作为延长单位,在聚酮化合物合成酶(polyketide synthase,PKSA)的催化下形成聚酮骨架 [3]。黄曲霉毒素的生物合成途径的认知最初起源于对毒素结构的检测。而在分子水平上,主要的生物化学步骤以及随后的黄曲霉毒素生物合成的基因组分仅在过去10年才被揭示。黄曲霉和寄生曲霉的黄曲霉毒素合成基因显著同源,簇上的基因排列是相同的 [4]。Minto等 [5]确定了黄曲霉毒素是由丙二酰辅酶A经过两步反应合成的,第一步先产生己酰基辅酶A,第二步再形成一个蒽醌,整个过程至少需要18 个反应步骤 [6]。编码酶的基因和转录因子位于黄曲霉和寄生曲霉基因组的一个大约70 kb大小的基因簇内。其中每个基因的转录方向是唯一的 [7],同时黄曲霉和寄生曲霉的基因组结构大体相同。Yabe等 [8-9]提出了当前被普遍接受的黄曲霉毒素生物合成模式:己酰辅酶A前体→诺素罗瑞尼克酸(NOR)→奥佛兰提素(AVN)→奥佛路凡素(HAVN)→奥佛尼红素(AVF)→羟基杂色酮(HVN)→杂色半缩醛乙酸(VHA)→杂色曲霉B(VER B)→杂色曲霉A(VER A)→柄曲霉素(DMST)→O-甲基柄曲霉素(ST)→黄曲霉毒素B 1(AFB 1)、黄曲霉毒素G 1(AFG 1)。

一般在真菌快速生长停止以后,会产生由一种非核糖体肽合成酶催化合成的β-内酰胺抗生素青霉素以及由聚酮途径合成的聚酮黄曲霉毒素和杂色曲霉素,这些毒素是研究最透彻的几种次生代谢产物 [10]。次生代谢调控基因可以通过基因组计算机模拟分析很容易地进行检测 [11],次生代谢的调控基因是成簇的,这一发现对于研究黄曲霉毒素基因调控和进化具有重要意义。

2 侵 染

很多农产品易感染产黄曲霉毒素的霉菌。据联合国粮食及农业组织(Food and Agriculture Organization of the United Nations,FAO)算全世界25%谷物因受真菌毒素污染而不能食用,其中受黄曲霉毒素污染最为严重 [12]。主要农作物如玉米、水稻和棉籽都被发现污染黄曲霉菌。热带和亚热带地区的食品和饲料中黄曲霉毒素的污染率相对来说最高,湿热的气候为真菌的生长提供了适宜的条件 [13]。农作物中黄曲霉的生长和黄曲霉毒素的产生受农作物种类、真菌种类、作物中的水分含量、湿度、温度和作物的物理伤害影响。黄曲霉毒素污染随着作物受的胁迫和伤害程度增大而加重,包括采收前的干旱、昆虫活动、收获时间、采收和采后大雨和农作物贮藏前未充分干燥。干燥和贮存过程中的湿度、温度和通风是其中最重要的影响因素。其中花生黄曲霉毒素侵染的主要途径包括:1)花生栽培过程的农业过程、害虫的危害、收获前期的干旱胁迫以及不能适时采收;2)花生的收获方式与晾晒干燥过程;3)荚果入贮时病、残、破损和秕果数量越多,黄曲霉菌基数越大,贮藏过程中的荚果回潮、贮藏场所温度、贮藏害虫的危害以及贮藏时间过长,均会导致花生自身对黄曲霉菌的抵抗力下降 [14]

很多生物和非生物环境因素都会影响黄曲霉毒素的生物合成,包括例如碳源和氮源的营养因素;例如水分活度和温度的环境影响;例如pH值的生理条件和生物反应剂 [15]。许艳丽 [16]研究证实通过改变贮藏环境条件来控制产毒菌的产毒是一个高效易行的方法;贮藏环境中的通风条件、贮藏环境温度和贮藏物的pH值对菌株的产毒影响巨大,较低的温度和良好的通风再加上弱碱性的pH值可很好地降低毒素的产量。Price等 [17]研究了4 种因素对黄曲霉毒素通路特定基因转录的影响,发现温度对其影响最大,其次是pH值、氮源、碳源。

2.1 碳源

碳源、氮源、氨基酸、脂类、微量元素和其他营养因素早已被发现影响黄曲霉毒素的产生,其中最广为人知的是碳源和氮源。碳源和黄曲霉毒素形成的关系已经明确,单糖,如葡萄糖、蔗糖、果糖和麦芽糖有利于黄曲霉毒素的形成,而蛋白胨、山梨糖和乳糖则起到抑制作用。Woloshuk等 [18]报道了α-淀粉酶的活性与黄曲霉黄曲霉毒素的产生之间的联系。李红波等 [19]研究了香菇多糖、海带多糖、石耳素等10余种多糖对黄曲霉生长和产毒的抑制作用,发现海带多糖、香菇纤维素、马铃薯直链淀粉、A型大豆多糖能够明显降低黄曲霉菌丝产量;同时海带多糖、香菇纤维素、马铃薯纤维素、香菇多糖、绿豆多糖抑制了黄曲霉产毒。

Yu等 [20]确定了寄生曲霉菌中比邻黄曲霉毒素基因簇的一 个和糖利用有关的基因簇。这两个基因簇之间紧密的物理联系可以证明在碳水化合物诱导黄曲霉毒素合成过程中两个基因簇的关系。脂质底物是有利于黄曲霉毒素产生的良好碳源。脂肪酶基因(LipA)在黄曲霉和寄生曲霉中克隆表达。脂质底物可以诱发LipA的表达和随后黄曲霉毒素的产生。向不利于黄曲霉毒素生长的蛋白胨培养基中添加0.5%的豆油可诱导酶基因的表达,进而导致黄曲霉毒素的形成。然而,碳源参与黄曲霉毒素的代谢通路基因表达的分子机制还有待进一步研究。

2.2 氮源

真菌可以利用各种氮源,氮和黄曲霉毒素的产生紧密相连。还原态氮源促进黄曲霉毒素的合成,氧化态氮源抑制。天冬酰胺、天冬氨酸、丙氨酸、硝酸铵、亚硝酸铵、硫酸铵、谷氨酸、谷氨酰胺和脯氨酸都有利于黄曲霉毒素产生;而硝酸钠和亚硝酸钠不利于黄曲霉毒素形成。硝酸盐对黄曲霉毒素的产生有抑制作用,而由aflR额外副本造成的aflR基因的过度表达抑制了对黄曲霉毒素通路基因转录的负调节作用。不同氨基酸对黄曲霉毒素的产生有不同的影响。最近的研究表明色氨酸阻止黄曲霉毒素的产生,而酪氨酸增加黄曲霉中黄曲霉毒素的产生 [21]

2.3 温度

黄曲霉毒素的形成受温度的直接影响,寄生曲霉生长的最小温度范围是6~8 ℃,最大是44~46 ℃,最佳温度是25~35 ℃。黄曲霉毒素在12~34 ℃的温度范围产生,在36 ℃时产毒停止,最适产毒温度为28~30 ℃。黄曲霉毒素的产生由温度调控,因为当温度由34 ℃提高到37 ℃时,黄曲霉毒素大量减少。实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)测定aflR、反义aflR、aflS和aflP的表达,发现所有这些基因的水平相对测试温度而变化。由非生物因素施加的轻度胁迫引发黄曲霉毒素的产生;但低于强度胁迫条件(水分活度0.9,温度大于37 ℃),尽管诱导了整个黄曲霉毒素生物合成基因簇,黄曲霉毒素合成却受到抑制。使用基因芯片和反转录PCR全基因组基因表达谱表明高温和黄曲霉毒素通路基因表达减少有关。反转录PCR检测出控制基因aflR和aflS(aflJ)丰富数量的副本 [22],其中aflR对黄曲霉毒素的生物合成在转录水平上起调节作用,结构基因的转录依赖于aflR基因的转录,aflR基因的过度表达,使黄曲霉毒素合成的量增多。有人推测,温度影响afl R的活性或者其他未知的调控因素。

2.4 水分活度

李瑞芳等 [23]研究发现,水分活度是影响黄曲霉生长的重要因素,水分活度低于0.90就不能生长,水分活度越高越有利于霉菌生长和毒素合成。研究记录显示,玉米中严重的黄曲霉毒素的爆发多发生在炎热和干旱条件下 [24]。此状况下玉米污染黄曲霉毒素的机理还不是很清楚,可能的原因包括这些:1)在水分胁迫条件下,植物的防御机制减弱;2)昆虫侵食和相关的植物组织受伤为真菌入侵提供了机会;3)干燥气候下,更多的真菌孢子散布到空气中 [25-26]

2.5 pH值

黄曲霉毒素的生物合成发生在酸性介质中,在碱性介质中被抑制。黄曲霉毒素合成的最佳酸碱度为pH值在3.4~5.5范围内。PacC基因是pH值平衡的一个主要的转录调控因子。在aflR启动子区域,至少确定了一个PacC结合位点。PacC在碱性条件下特定水解以后功能活跃。PacC蛋白转运到细胞核,与启动子DNA结合,导致碱性pH值表达基因的诱导和酸性pH值表达基因的抑制。在不利于黄曲霉毒素的蛋白胨培养基中,表明此位点抑制黄曲霉毒素的形成。此控制机理或许是在碱性条件下PacC结合位点抑制酸表达基因aflR,进而抑制黄曲霉毒素的形成 [27]

2.6 发育阶段

产孢和菌核的形成与次生代谢有关 [28]。孢子形成和次生代谢产物的形成发生在大约相同的时间。一些缺乏孢子的突变体不能产生黄曲霉毒素,抑制寄生曲霉产孢的一些化合物也可以抑制黄曲霉毒素产生。经过一系列传代培养产黄曲霉毒素能力逐渐下降。黄曲霉毒素生成变化伴随着显著的形态学变化 [29]

此外,抑制寄生曲霉和构巢曲霉中多胺生物合成的化学品抑制孢子和黄曲霉毒素或甲基柄曲霉素(sterigmatocystine,ST)的生物合成。更近的研究表明孢子和甲基柄曲霉素产生的控制是通过构巢曲霉信号通路介导的一个共享的G-蛋白进行的 [26]。黄曲霉毒素产生调控中涉及FadA的G-蛋白信号通路也存在于黄曲霉和寄生曲霉中。

2.7 氧化胁迫

寄生曲霉中氧化胁迫和黄曲霉毒素生物合成是相关的 [30]。氧化胁迫诱导寄生曲霉中黄曲霉毒素的形成。对黄曲霉用叔丁基过氧化氢或者没食子酸处理,黄曲霉毒素显著增加 [31]。对寄生曲霉同样处理也会诱导黄曲霉毒素产生 [30]。水解单宁显著抑制黄曲霉毒素生物合成,其中主要的抗黄曲霉毒素成分主要是没食子酸。没食子酸减少黄曲霉毒素生物合成基因簇中结构基因的表达,但不是黄曲霉毒素通路基因调控者afl R,没食子酸扰乱了黄曲霉毒素的信号转导途径。某些酚类或者抗氧化 剂,例如抗坏血酸,加到氧化胁迫的黄曲霉中,黄曲霉毒素的产生显著下降 [31]。咖啡酸是另一种抑制黄曲霉毒素的抗氧化剂。用咖啡酸处理的黄曲霉微阵列分析发现了一种基因叫ahpC2,表达为一种潜在参与平息黄曲霉毒素合成信号的烷基过氧化氢还原酶。

2.8 植物代谢产物

植物代谢产物对黄曲霉毒素的形成起到一定作用。Wright等 [32]报道称,在一定条件下与对照组相比,正癸醛不仅抑制寄生真菌生长,也减少超过95%的黄曲霉毒素产生。辛醛抑制60%的真菌生长,而黄曲霉毒素的产生增加500%。脂氧合酶的反应产物13(S)-过氧化氢的衍生物亚油酸会减少黄曲霉毒素的产生 [33]。研究证实叶绿素的半合成水溶性衍生物——叶绿酸能通过阻断致癌物的生物活性而有效抑制黄曲霉毒素诱导动物肝癌的发生。例如来自棉叶和玉米叶的挥发性醛类和其他植物化学物能影响黄曲霉生长和黄曲霉毒素的合成,五倍子酸抑制其生物合成 [34]。因此,除了常规检测和筛查,黄曲霉毒素污染管理必须采取包括采前和采后控制措施。

3 黄曲霉毒素的运输与代谢

3.1 囊泡理论与黄曲霉毒素的合成运输

囊泡和液泡中存在大量合成次生代谢产物的酶,但其在次生代谢产物黄曲霉毒素代谢过程中的作用并不清楚。直到Chanda等 [35]提出了黄曲霉区域化、毒素基因表达、碳源途径的调控模型(图1),其分为两部分,1)区域化:Nor-1、Ver-1和OmtA在细胞质游离核糖体合成,包装成运输小泡,通过细胞质到液泡的靶向(CvT)路径运送到液泡。2)基因控制:感测到葡萄糖浓度和葡萄糖代谢启动FadA/cAMP/PKA信号通路。线粒体和过氧化物酶体提供乙酰CoA合成聚酮化合物。过氧化物酶体中黄曲霉毒素合成中的早期步骤的发生(乙酰CoA到诺素罗瑞尼克酸)已由其他人提出。目前研究指出了在黄曲霉毒素囊泡中后期途径酶的作用,囊泡也参与黄曲霉毒素释放。至少两种单独的信号(碳源和光照)触发VeA的活性,协调控制参与黄曲霉毒素合成运输的两部分。一部分通过激活一般或特定转录因子提高基因转录。另一部分降低限制复合物(Tc)活性,导致运输小泡的积聚。当两部分运行时,黄曲霉毒素酶在囊泡积聚,进行黄曲霉毒素合成和转运毒素到细胞外。

图1 黄曲霉区域化、毒素基因表达、碳源途径的调控 [3355]
Fig.1 Regulation of subcellular compartmentalization, aflatoxin gene expression and carbon flow [3355]

Chanda等 [36]随后又提出了囊泡化合成释放激素的理论模型(图2)。由于VeA介导的限制复合物(Tc)活性下调黄曲霉毒素囊泡出现。在黄曲霉毒素囊泡合成的黄曲霉毒素理论上可以通过一种或更多的机制被释放到细胞外:穿梭(黄曲霉毒素囊泡转运产物穿过细胞质膜),泵(当囊泡黏附到细胞质膜的内表面时跨膜转运[Tp]蛋白介导次生代谢产物的释放)和破裂释放机制(囊泡伸出细胞表面,将毒素释放到介质中)。研究证实囊泡数量增加与AFB 1的累积或输出正相关,AFB 1在囊泡中完成催化合成,转运出细胞外,当囊泡与液泡融合时,合成明显减少。

图2 囊泡化合成释放激素的理论模型 [3366]
Fig.2 Theoretical model of vesicle synthesis and hormone release [3366]

总之,丝状真菌寄生曲霉进化出高度保守的囊泡运输机制来转运蛋白质到达液泡,同时此机制还可以完成新的细胞功能,即黄曲霉毒素的合成、区域化和转运。黄曲霉毒素在特定的囊泡合成即黄曲霉毒素诱导条件下囊泡-空泡部位将杂色曲霉毒素,在黄曲霉毒素合成的后中间体,转化为AFB 1。这些亚细胞器在区域化和转运过程中也起重要作用。囊泡和胞浆膜融合发生胞吐作用来促进黄曲霉毒素释放到生长介质中。

3.2 黄曲霉毒素的代谢

摄入AFB 1后,经P450氧化酶CYP450家族成员代谢转化为AFM 1、AFP 1、AFQ 1和黄曲霉毒素醇等,前三者均无活性,经尿液直接排出或与葡萄糖醛酸基转移酶结合经粪便排出;黄曲霉毒素醇又可被氧化成AFB 1 [37]。肝微粒体细胞色素P450将黄曲霉毒素代谢为亲电的活性环氧化物,然后结合到DNA和其他关键的细胞大分子上。黄曲霉毒素是“致癌原”,酶法生物活化是其致癌作用的前提条件。其毒性很可能是由肝脏中由细胞色素P450在AFB 1代谢过程中通过在细胞内产生活性氧而产生的,即超氧阴离子、羟自由基和过氧化氢。这类物质可攻击可溶性细胞物质和膜,最终导致细胞功能的损害和细胞溶解。小肠吸收以后,AFB 1容易结合血浆白蛋白,在血液中充当黄曲霉毒素的主要输送者 [38]。在肝脏中,AFB 1被微粒体多功能氧化酶(细胞色素P450)氧化成一些水溶性代谢产物。

活性代谢物AFB 1-8,9环氧化合物的形成及其随后与DNA、RNA和蛋白质的共价结合,在急性和慢性中毒中起关键作用 [39]。此环氧化合物并不一定产生遗传毒性和细胞毒性损害,因为它可以由环氧化物水解酶(EPHx)催化形成AFB 1二氢二醇失去和DNA结合的位点而失活 [40],或者在谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione-S-transferase,GST)的作用下最终以AFB 1-硫醇尿酸(AFB 1-mercaptutic acid,AFB 1-NAC)经尿液排出。谷胱甘肽-S-转移酶是最重要的AFB 1去毒酶,有些动物对AFB 1极其敏感,例如火鸡,或许是由于它细胞色素P450高效活动以及肝脏缺乏AFB 1特定的谷胱甘肽-S-转移酶而去毒不足综合造成的 [41]

另有一部分AFB 1-8,9-环氧化物与血清白蛋白结合形成AFB 1-白蛋白加合物而残留于血液中,其主要形式为AFB 1-赖氨酸加合物,即与蛋白质赖氨酸的ε-氨基共价结合。还有一部分AFB 1的环氧化物与DNA中的鸟嘌呤反应,即AFB 1-8,9-环氧化物的第8位碳原子与鸟嘌呤的第7位氮原子共价结合形成AFB 1-N 7-鸟嘌呤加合物,肝内形成的大部分此加合物经DNA修复可较快清除,另有一部分转变为开环的AFB 1-甲酰氨基嘧啶加合物进入血液并经尿液排泄 [42]。AFB 1的环氧化物可以与鸟嘌呤残基反应,AFB 1-N 7-鸟嘌呤加合物量多、生物学效应强,它带正电荷的咪唑环能引起后续脱嘌呤,形成无嘌呤嘧啶位点,或者形成咪唑环形成更加稳定的AFB 1-甲酰胺加合物,其可能是AFB 1发挥毒性作用的主要形式之一 [43]

4 黄曲霉毒素的毒性

应用于人类接触黄曲霉毒素和生物效应的生物标志物的发展是理解代谢、DNA加合物感应、致突变性和致癌的基础 [44]。黄曲霉毒素是霉菌毒素中研究最深入的一类,原因是其对家畜和脆弱的实验动物致癌性和毒理作用及对人类的急慢性肝肿瘤和毒理作用。黄曲霉毒素的LD 50(半数动物致死量)为0.249 mg/kg,其毒性是氰化钾的10 倍,砒霜的68 倍,能引起急性中毒死亡 [45]

AFB 1的致癌和致突变效应或许是亲电、高活性AFBO对像DNA的细胞亲核试剂亲和。因此,环氧化被普遍认为代谢物激活,而羟基化、水合和去甲基化被认为是代谢去毒 [46]。小鼠肝脏中参与AFB 1激活的CYP1A1、CYP2B1/2和CYP2C11已经被研究。一些CYP被奥替普拉(OPZ)[5-(2-吡嗪)-4-甲基-1,2-二硫杂环-3-硫酮]诱导致癌物解毒酶。谷胱甘肽-S-转移酶、环氧化物酶、NADP(H)醌还原酶和尿嘧啶核苷5’-二磷酸(UDP)-葡萄糖醛酸转移酶参与对一些致癌物解毒。OPZ既是CYP的抑制剂又是诱导剂,CYP参与老鼠中AFB 1激活。来自不同CYP的蛋白代谢AFB 1成为致突变产物和致癌物AFBO。AFB 1诱导活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的形成,导致DNA碱基的氧化,诱导脂质过氧化反应。

4.1 黄曲霉毒素与癌症和肝炎

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的诱发因素包括慢性B型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染、C型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染、抽烟、长期饮酒、饮用水藻类毒素污染和膳食接触AFB 1

[47]。慢性乙肝病毒感染和接触浓度高的膳食黄曲霉毒素对肝癌来说是两个主要的诱发因素。环境接触黄曲霉毒素的致癌作用增加了乙肝病毒表面抗原(HBsAg)携带者患肝癌的危险。但还需要大规模的研究来评价接触黄曲霉毒素对乙肝病毒表面抗原携带者的影响。由霉菌产生的致癌性毒素(黄曲霉毒素)与乙肝病毒协同互动增大了人类患HCC的风险 [48]

AFB 1是一种很强的肝毒素和肝致癌剂,肝脏被认为是黄曲霉毒素首要的目标 [49]。黄曲霉毒素有毒代谢产物与对细胞活力至关重要的核酸、核蛋白结合,最终导致肝脂质过度积聚、肝脏肿大、胆管上皮增生、坏疽和肝癌。AFB 1必须由细胞色素P450酶转化成反应中间体AFB 1-8,9环氧化合物来发挥它的致肝肿瘤作用 [50]

黄曲霉毒素和HBV协同致癌,HBV本身不会引起DNA损伤和肝细胞癌变,DNA修复系统可使AFB 1-DNA加合物引起的DNA损伤获得及时修复,降低黄曲霉毒素引起的致癌效应。HBV蛋白影响宿主DNA修复系统和药物代谢酶系统,抑制受损DNA的修复。病毒造成潜在缺陷使AFB 1及其代谢产物一旦攻击DNA,受损DNA累积造成肝癌发生率增加。另外,AFB 1的攻击还降低了细胞色素P450代谢酶基因的表达,增加AFB 1及其代谢产物的致癌效应 [51]。AFB 1及其代谢产物致癌的分子机制主要是癌基因的激活和抑癌基因的失活。有研究表明AFB 1及其代谢产物引起了癌基因(如ras、c-fos)及抑癌基因(如p53)表达的改变。

4.2 黄曲霉毒素与变异

黄曲霉毒素引起变异,能使人成纤维细胞发生程序外DNA合成,动物实验可见染色体畸变、染色体断裂及某些染色体缺失。黄曲霉毒素诱发DNA损伤和基因突变。小孩通常比成年人更容易受毒性物质影响,包括对遗传毒性致癌物的敏感性增加。已经证实,成年老鼠比起新生老鼠不容易受直接烷化剂N-乙基-N-亚硝胺和芳香胺4-氨基联苯的诱变效应影响。黄曲霉毒素致 突变的作用主要是通过与DNA、RNA和蛋白质形成加合物而实现,同时它也会引起脂质过氧化作用和DNA氧化损伤 [52]。黄曲霉毒素被摄入后主要经过肝脏的细胞色素P450组酶代谢,转换成很多代谢产物,其中有一种就是AFT-8,9环氧化合物。AFB 1-8,9环氧化合物可以与DNA共价结合形成加合物,这种加合物是黄曲霉毒素产生生物效应的原因,即导致细胞生长和分裂的失控 [53]。AFBO极易与DNA链上鸟苷残基上的N 7共价结合,它 们之间的电子云因原子核的吸电子作用而漂移,自发形成其他DNA损伤形式,包括DNA加合物引起的碱基修饰、形成无嘌呤/无嘧啶位点、DNA单链和双链损伤、DNA氧化性损伤、DNA碱基错配损伤及能引起姐妹染色体交换(sister-chromatid exchange,SCE)频率增加,增加基因的不稳定性 [51]

4.3 黄曲霉毒素与生殖

黄曲霉毒素对健康有很多不利影响,但对于它如何影响生殖系统及它对生殖健康的危害还没有统一的结论 [54]。不孕不育的原因有很多,例如性病、虫疾、生理与遗传缺陷。其中了解最少的是有毒物质的影响,包括霉菌毒素 [55]。黄曲霉毒素通过影响性成熟、卵泡的生长和成熟、激素水平、妊娠和胎儿的发育影响生殖 [56]。精液带有高浓度黄曲霉毒素的不育男性中有50%的人的精子异常(精子密度、形态学、蠕动)。黄曲霉毒素降低生殖能力,提高胚胎死亡率。血激素水平和性器官受黄曲霉毒素严重影响,AFB 1扰乱了受感染动物体的荷尔蒙平衡。

5 黄曲霉毒素吸收和代谢的干预

一旦摄入黄曲霉毒素,可以通过两种途径降低体内黄曲霉毒素的毒性和致癌性。

5.1 阻断和减少黄曲霉毒素的吸收

益生菌可以吸附黄曲霉毒素,形成菌体-AFT复合体,使得黄曲霉毒素在肠道的吸收减少,微生物和黄曲霉毒素一起排出。腐殖酸是一种有机高分子化合物,对重金属、芳香族化合物、矿物质等吸附作用强,有研究表明,从烟煤中提取的腐殖酸对AFB 1有较强吸附作用。叶绿酸与AFB 1结合成牢固的分子化合物,影响AFB 1的吸收,降低摄入的致癌物的生物活性 [57]。研究表明,葡甘聚糖及其与无机吸附剂组成的复合物在常温下对黄曲霉毒素的吸附效果均比较好,其机制是甘露低聚糖可通过氢键、离子键和疏水作用力对黄曲霉毒素产生吸附力,其以物理作用为主 [58]

5.2 干预药物代谢酶调节黄曲霉毒素在体内的代谢

研究发现许多中药及其有效成分可作用于药物代谢酶系统,进而影响黄曲霉毒素的代谢活化及解毒,例如黄岑、丹参、姜黄素、黄酮、多酚等。吡噻硫酮抗黄曲霉毒素的机制是不但减少AFB 1-8,9-环氧化合物,而且提高GST的活性,促进谷胱甘肽与AFB 1-8,9-环氧化合物结合,增加AFB 1-硫醇尿酸加合物经尿液排出。曹骥等 [59]研究发现茶多酚对AFB 1和HBV诱发的树鼩肝癌有保护作用,其机制可能是诱导体内GST促进致癌物的解毒,抗氧化作用、提高免疫功能、诱导肿瘤细胞凋亡。例如水果蔬菜中的香豆素、苄基异硫氰酸酯和3-羟甲基吲哚的植物性化合物,可抑制AFB 1诱导的肝癌。Lee等 [60]研究发现葱白的提取物能有效减轻肝癌细胞中AFB 1所致的过氧化损伤,从而减轻AFB 1所致的细胞毒性和DNA损伤,其作用机制主要是降低细胞色素氧化酶CYP450家族成员CYP3A4的活性,提高GST的活性,预防癌症。另外还有一些抗氧化剂、β-胡萝卜素、芜菁汁等也可干预黄曲霉毒素在体内的代谢。有研究表明,硒对动物AFB 1中毒有缓解作用,其机制是通过影响AFB 1在体内代谢的关键酶,如细胞色素P450和GST等的活性,缓解动物的中毒现象 [61]。梁雅婷 [62]发现亚麻酸氧化衍生物抑制黄曲霉毒素的产生和黄曲霉毒素合成途径中的第一个代谢中间产物降盘散衣酸(norsolorinic acid,NOR)的产生,基因表达分析结果也显示所有被检测的黄曲霉毒素合成途径相关基因的表达均被抑制。

6 结 语

黄曲霉毒素是在易受霉菌侵染的农产品中主要由黄曲霉和寄生曲霉产生的有毒次生代谢产物。它们的产生取决于田间及贮藏过程中的环境条件。由于其不可避免和不可预测的特性,黄曲霉毒素污染对食品安全是一个很大挑战,控制其摄入量和进行体内解毒是降低其对机体损害的有效方法。相当多的证据表明黄曲霉毒素和某些动物综合症有关。全世界的科学家集中研究黄曲霉毒素的生物合成已经超过50 年。关于黄曲霉毒素合成的机理了解的越多,就越需要研究它的调控机理。黄曲霉毒素基因表达的调控发生在多个层次,由多个调控组分控制。普遍接受的AFB 1作用机理是AFBO生物活化结合到DNA形成AFB 1-N 7-鸟嘌呤。DNA损伤的另外一个可能原因是AFB 1介导形成活性氧的刺激,导致DNA碱基的氧化。AFB 1致癌机制的研究已经取得了较大的进展,AFB 1及其代谢产物可能通过影响ras、c-fos癌基因及p53、Survivin抑癌基因的表达等多种途径引起肝癌发生。但由于缺乏直接的相关证据,AFB 1致癌机制仍未能明确阐明,进一步阐明黄曲霉毒素致癌机制,进一步明确其致癌机制对有效干预减少其对人类和动物的毒性有重要意义。

关于黄曲霉毒素生物合成基因调控和运输代谢更好的了解将会帮助确定真菌生长和黄曲霉毒素形成的天然抑制剂。黄曲霉毒素生物合成和调控机理的基本知识有利于防控黄曲霉毒素的新型生物技术的发展。黄曲霉毒素的侵染可以通过采取适当的作物管理、合适的贮藏来控制,同时可以采用物理、化学和生物方法来对毒素灭活及干预。最终目的是能够设计有效新颖的策略来消除黄曲霉毒素污染,干预黄曲霉毒素的侵染代谢,从而保障更安全、营养和可持续的食品和饲料供应。

参考文献:

[1] 李金. 有害物质及其检测[M]. 北京: 中国石化出版社, 2001: 94-100.

[2] NAKAI V K, ROCHA L O, GONCALEZ E, et al. Distribution of fungi and aflatoxins in a stored peanut variety[J]. Food Chemistry,2008, 106(1): 285-290.

[3] 徐进, 罗雪云. 黄曲霉毒素生物合成的分子生物学[J]. 卫生研究,2003, 32(6): 628-631.

[4] YU J, CHANG P K, CARY J W, et al. Comparative mapping of aflatoxin pathway gene clusters in Aspergillus parasiticus and Aspergillus flavus[J]. Appllied and Environmental Microbiology, 1995,61(6): 2365-2371.

[5] MINTO R E, TOWNSEND C A. Enzymology and molecular biology of aflatoxin biosynthesis[J]. Chemical Reviews, 1997, 97(7): 2537-2555.[6] ROZE L V, ARTHUR A E, HONG S J, et al. The initiation and pattern of spread of histone H4 acetylation parallel the order of transcriptional activation of genes in the aflatoxin cluster[J]. Molecular Microbiology,2007, 66(3): 713-726.

[7] SCHMIDT-HEYDT M, GEISEN R. A microarray for monitoring the production of mycotoxins in food[J]. Food Microbiology, 2007,117(2): 131-140.

[8] YABE K, NAKAMURA M, HAMASAKI T. Enzymatic formation of G-group aflatoxins and biosynthetic relationship between G- and B-group aflatoxins[J]. Appllied and Environmental Microbiology,1999, 65(9): 3867-3872.

[9] YABE K, NAKAJIMA H. Enzyme reactions and genes in aflatoxin biosynthesis[J]. Appllied Microbiology and Biotechnology, 2004,64(6): 745-755.

[10] LOTLIKAR P D, RAJ H G, BOHM L S, et al. A mechanism of inhibition of aflatoxin B 1DNA binding in the liver by phenobarbital pretreatment of rats[J]. Cancer Research, 2003, 49(4): 951-957.

[11] KELLER N P, TURNER G, BENNETT J W. Fungal secondary metabolism-from biochemistry to genomics[J]. Nature Reviews Microbiology, 2005, 3(12): 937-947.

[12] 计成. 霉菌毒素与饲料食品安全[M]. 北京: 化学工业出版社, 2007.

[13] LUTTFULLAH G, HUSSAIN A. Studies on contamination level of aflatoxins in some dried fruits and nuts of Pakistan[J]. Food Control,2010, 22(3): 1-4.

[14] 王守经, 祝清俊, 胡鹏. 花生及其制品的黄曲霉毒素污染与防控措施[J]. 中国食物与营养, 2010(3): 14-16.

[15] GUO B Z, HOLBROOK C C, YU J, et al. Application of differential display RT-PCR and EST/microarray technologies to the analysis of gene expression in response to drought stress and elimination of aflatoxin contamination in corn and peanut[J]. Journal of Toxicology-Toxin Reviews, 2003, 22(2/3): 287-312.

[16] 许艳丽. 产黄曲霉毒素菌株的检测方法及产毒条件的研究[D]. 青岛: 中国海洋大学, 2008.

[17] PRICE M S, CONNERS S B, TACHDJIAN S, et al. Aflatoxin conducive and non-conducive growth conditions reveal new gene associations with aflatoxin production[J]. Fungal Genetics and Biology, 2005, 42(6): 506-518.

[18] WOLOSHUK C P, PRIETO R. Genetic organization and function of the aflatoxin B 1biosynthetic genes[J]. FEMS Microbiology Letters,1998, 160(2): 169-176.

[19] 李红波, 胡梁斌, 王淼焱. 几种多糖对黄曲霉菌生长及产毒的抑制作用[J]. 江西农业学报, 2011, 23(5): 82-84.

[20] YU J, MOHAWED S M, BHATNAGAR D, et al. Substrate-induced lipase gene expression and aflatoxin production in Aspergillus parasiticus and Aspergillus fl avus[J]. Appllied Microbiology, 2003,95(6): 1334-1342.

[21] WILKINSON J R, YU J, BLAND J M, et al. Amino acid supplementation reveals differential regulation of aflatoxin biosynthesis in Aspergillus flavus NRRL 3357 and Aspergillus parasiticus SRRC 143[J]. Appllied Microbiology and Biotechnology,2007, 74(6): 1308-1319.

[22] OBRIAN G R, GEORGIANNA D R, WILKINSON J R, et al. The effect of elevated temperature on gene transcription and aflatoxin biosynthesis[J]. Mycologia, 2007, 99(2): 232-239.

[23] 李瑞芳, 韩北忠, 陈晶瑜, 等. 黄曲霉生长预测模型的建立及其在玉米储藏中的应用[J]. 中国粮油学报, 2008, 23(3): 144-147.

[24] COTTY P J, JAIME-GARCIA R. Influences of climate on aflatoxin producing fungi and aflatoxin contamination[J]. Food Microbiology,2007, 119(1): 109-115.

[25] GUZM☒N-de-PE☒A D, AGUIRRE J, RUIZ-HERRERA J. Correlation between the regulation of sterigmatocystin biosynthesis and asexual and sexual sporulation in Emericella nidulans[J]. Antonie van Leeuwenhoek, 1998, 73(2): 199-205.

[26] YU J H, KELLER N. Regulation of secondary metabolism in Filamentous fungi[J]. Annual Reviews of Phytopathology, 2005, 43: 437-458.

[27] ESPESO E A, ARST H N. On the mechanism by which alkaline pH prevents expression of an acid-expressed gene[J]. Molecular and Cellular Biology, 2000, 20(10): 3355-3363.

[28] CALVO A M, WILSON R A, BOK J W, et al. Relationship between secondary metabolism and fungal development[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2002, 66(3): 447-459.

[29] TORRES J, GUARRO J, SUAREZ G, et al. Morphological changes in strains of Aspergillus fl avus link ex Fries and Aspergillus parasiticus speare related with aflatoxin production[J]. Mycopathologia, 1980,72(3): 171-180.

[30] REVERBERI M, ZJALIC S, RACELLI A, et al. Oxidant/antioxidant balance in Aspergillus parasiticus affects aflatoxin biosynthesis[J]. Mycotoxin Research, 2006, 22(1): 39-47.

[31] KIM J H, CAMPBELL B C, MOLYNEUX R, et al. Gene targets for fungal and mycotoxin control[J]. Mycotoxin Research, 2006, 22(1): 3-8.

[32] WRIGHT M S, GREENE-MCDOWELLE D M, ZERINGUE H J, et al. Effects of volatile aldehydes from Aspergillus-resistant varieties of corn on Aspergillus parasiticus growth and aflatoxin biosynthesis[J]. Toxicon, 2000, 38(9): 1215-1223.

[33] WILSON R A, GARDNER H W, KELLER N P. Differentiation of aflatoxin-producing and non-producing strains of Aspergillus fl avus group[J]. Letters in Appllied Microbiology, 2001, 33(4): 291-295.

[34] 路子显, 伍松陵, 孙长坡. 黄曲霉素合成相关基因表达与环境因素的关系[J]. 生物技术通报, 2010(11): 56-61.

[35] CHANDA A, ROZE L V, KANG S, et al. A key role for vesicles in fungal secondary metabolism[J]. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2009, 106(46): 19533-19538.

[36] CHANDA A, ROZE L V, LINZ J E. A possible role for exocytosis inaflatoxin export in Aspergillus parasiticus[J]. Eukaryotic Cell, 2010,9(11): 1724-1727.

[37] 林怡. 黄曲霉毒素B 1代谢及致肝癌机制的研究进展[J]. 中国现代医药杂志, 2007, 9(12): 131-133.

[38] TESSARI E N C, KOBASHIGAWA E, CARDOSO A L S P, et al. Effects of aflatoxin B 1and fumonisin B 1on blood biochemical parameters in broilers[J]. Toxins, 2010, 2(4): 453-460.

[39] JOSSE R, ANINAT C, GLAISE D, et al. Long-term functional stability of human HepaRG hepatocytes and use for chronic toxicity and genotoxicity studies[J]. Drug Metabolism and Disposition, 2008,36(6): 1111-1118.

[40] 沈靖, 王润田, 邢厚恂, 等. Ⅰ、Ⅱ相代谢解基因多态性与胃癌遗传易感性的病例对照研究[J]. 肿瘤, 2002, 22(1): 9-13.

[41] KLEIN P J, BUCKNER R, KELLY J, et al. Biochemical basis for the extreme sensitivity of turkeys to aflatoxin B 1[J]. Toxicology and Appliled Pharmacology, 2000, 165(1): 45-52.

[42] POIRIER M C, SANTELLA R M, WESTON A. Carcinogen macromolecular adducts and their measurement[J]. Carcinogenesis,2000, 21(3): 353-359.

[43] SMELA M E, CURRIER S S, BAILEY E A, et al. The chemistry and biology of aflatoxin B 1: from mutational spectrometry to carcinogenesis [J]. Carcinogenesis, 2001, 22(4): 535-545.

[44] WILD C P, TURNER P C. The toxicology of aflatoxins as a basis for public health decisions[J]. Mutagenesis, 2002, 17(6): 471-481.

[45] 裘维蕃. 菌物学大全[M]. 北京: 科学出版社, 1998: 723-7 35.

[46] DO J H, CH OI D K. Aflatoxins: detection, toxicity, and biosynthesis[J]. Biotechnology and Bioprocess Engineering, 2007,12(6): 585-593.

[47] 杜艳平. 黄曲霉毒素B 1致癌机制及植物性化学物防治的研究进展[J].现代食品与药品杂志, 2006, 16(1): 3-8.

[48] SU Jianjia, BAN Kechen, LI Yuan, et al. Alteration of p53 and p21 during hepatocarc inogenesis in tree shrews[J]. World Jounal of Gastroenterology, 2004, 10(24): 3559-3563.

[49] SHYAMAL S, LATHA P G, SUJA S R, et al. Hepatoprotective effect of three herbal extracts on aflatoxin B 1-intoxicated rat liver[J]. Singapore Medical Journal, 2010, 51(4): 326-331.

[50] RAWAL S, YIP S S M, COULOMBE R A J. Cloning, expression and functional characterization of cytochrome P450 3A37 from Turkey liver with high aflatoxin B 1epoxidation activity[J]. Chemical Research of Toxicology, 2010, 23(8): 1322-1329.

[51] 庄振宏, 张峰, 李燕云, 等. 黄曲霉毒素致癌机理的研究进展[J]. 湖北农业科学, 2011, 50(8): 1524-1525.

[52] SZYMANSKA K, CHEN J G, CUI Y, et al. TP53 R249S mutations,exposure to aflatoxin, and occurrence of hepatocellular carcinoma in a cohort of chronic hepatitis B virus carriers from Qidong, China[J]. Cancer Epidemiology Biomarkers & Prevention, 2009, 18(5): 1638-1643.

[53] WILD C P, HALL A J. Primary prevention of hepatocellular carcinoma in developing countries[J]. Mutation Research-Reviews in Mutation Research, 2000, 462(2/3): 381-393.

[54] SHUAIB F M, EHIRI J, ABDULLAHI A, et al. Reproductive health effects of aflatoxins: a review of the literature[J]. Reproductive Toxicology, 2010, 29(3): 262-270.

[55] EL-AZAB S M, ABDELHAMID A M, SHALABY H A, et al. Study of aflatoxin B 1as a risk factor that impair the reproductive performance in females-Egypt[J]. The Internet Journal of Toxicology, 2008, 6: 383-386.

[56] KOUROUSEKOS G D, LYMBEROPOULOS A G. Occurrence of aflatoxins in milk and their effects on reproduction[J]. Journal of the Hellenic Veterinary Medical Society, 2007, 58(4): 306-312.

[57] 王清兰, 陶艳艳, 刘成海. 黄曲霉毒素体内吸收与代谢的干预措施研究进展[J]. 肿瘤, 2007, 27(5): 416-417.

[58] 张妮娅, 姜梦付, 齐德生. 葡甘聚糖对黄曲霉毒素的吸附作用[J]. 养殖与饲料, 2007(4): 56-59.

[59] 曹骥, 李瑗, 张丽生, 等. 茶多酚在树鼬肝癌形成中的化学预防作用[J].肿瘤, 2005, 25(2): 118-121.

[60] LEE J K, CHO I E H, LEE K G, et al. Alleviation of aflatoxin B 1-induced oxidative stress in HepG2 cells by volatile extract from Allii Fistulosi Bulbus[J]. Life Sciences, 2005, 77(23): 2896-2910.

[61] 符晨星, 贺建华, 侯德兴. 硒对动物黄曲霉毒素B 1中毒的缓解作用[J].湖南饲料, 2011(6): 27-33.

[62] 梁雅婷. 亚麻酸抑制黄曲霉毒素合成的代谢调控研究[D]. 苏州: 苏州大学, 2013.

Recent Progress in the Biosynthesis, Metabolism and Toxicity of Aflatoxins

LUO Zisheng 1, QIN Yu 1, XU Yanqun 1, XU Tingqiao 2, WEI Yunxiao 2, HE Liangxing 2
(1. Department of Food Science and Nutrition, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China;2. Hangzhou Yuhang District Agricultural Monitoring Centre, Hangzhou 311199, China)

Abstract:Food contamination with aflatoxins is the focus of current concern. The i ntermittent incidence of these toxins in agricultural commodities has negative effects on the economy of the affected regions where harvest and postharvest techniques for the prevention of mold growth are seldom practiced. Aflatoxins are highly hepatotoxic, hepatocarcinogenic,teratogenic, and mutagenic in nature and they contaminate a wide variety of important agricultural commodities, such as peanuts, maize, rice and cottonseed, before, during and after harvest in various environmental conditions/settings. The biosynthesis of aflatoxins in nature depends upon the various factors such as carbon, nitrogen, temperature, water activity,pH, developmental stages, oxidative stress, and plant metabolites. These toxins can cause several ailments and can be controlled by blocking and interfering with the absorption and disturbing the metabolic enzymes. The present article overviews the biosynthesis, infection, transport, metabolism and toxicity of aflatoxins. Detailed studies on their biosynthesis,mechanism of toxicity, structure-function relationship, metabolism and transport will provide deep insight into the technology involved in the development of an effective control measures for aflatoxins.

Key words:aflatoxins; biosynthesis; infection; toxicity; mutation

中图分类号:TS201.6

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2015)03-0250-08

doi:10.7506/spkx1002-6630-201503048

收稿日期:2014-02-25

基金项目:杭州市社会发展科研专项(20140533B61);浙江省科技计划项目(2014C32089)

作者简介:罗自生(1972—),男,教授,博士,研究方向为食品保鲜生物学。E-mail:luozisheng@zju.edu.cn