马兰中酚类的分离纯化及其抑制蛋白糖基化的研究

（1.南京师范大学金陵女子学院，江苏南京210097；2.浙江省丽水市林业科学研究所，浙江丽水323000）

摘要：采用大孔吸附树脂对马兰粗提物进行分离，得到4组含有多酚的洗脱组分（F1、F2、F3、F4）。用Sephadex LH-20色谱柱对F2进一步纯化，得到3,5-二咖啡酰奎宁酸和3,4,5-三咖啡酰奎宁酸。通过建立牛血清白蛋白-甲基乙二醛（bovine serum albumin-methylglyoxal，BSA-MGO）和牛血清白蛋白-乙二醛（bovine serum albuminglyoxal，BSA-GO）的蛋白质糖基化反应模型，分析各所得组分抑制蛋白质糖基化的能力。结果表明：多酚含量依次为F2＞F1＞F3＞F4，马兰各组分对两种模型引起的蛋白质糖基化均具有良好的抑制效果。在BSA-GO的反应模型中，抑制蛋白质糖基化效果为3,5-二咖啡酰奎宁酸＞F2＞F3＞F1＞马兰粗提取物＞F4，BSA-MGO的反应模型中，抑制蛋白质糖基化效果为3,5-二咖啡酰奎宁酸＞F2＞马兰粗提取物＞F1＞F4＞F3，此结果与F2组分中分离得到的3,5-二咖啡酰奎宁酸具有良好的抑制效果一致。结论：马兰中分离得到的多酚类物质——3,5-二咖啡酰奎宁酸具有很强的抑制MGO/GO引发的蛋白糖基化功能。

关键词：马兰；多酚；3,5-二咖啡酰奎宁酸；蛋白质非酶糖基化

马兰（Kalimeris）属菊科，为多年生草本植物，我国南方各省均有分布，在江浙一带作为蔬菜食用，含多种维生素、矿物质和氨基酸，营养丰富 [1]。《本草拾遗》中记载其具有清热利湿、解毒消肿、凉血止血功效。现代药理实验研究证明其具有抗菌 [2]、抗炎 [3]、提高子宫活力及促血凝 [4]、治疗肝炎 [5]、降血脂 [6]作用，是集食用和药用价值于一身、备受青睐的时令野菜。目前发现马兰中含有黄酮类 [7]、三萜类 [8]、甾体类化合物 [9]。季鹏等 [10]首次从马兰全草80%乙醇提取物中分离并鉴定了5 个酚类化合物：汉黄芩素、千层纸素A、4-羟基苯乙酮、7,4-二羟基异黄酮、芹菜素。

蛋白质非酶糖基化又称美拉德反应，是由还原糖与氨基酸和蛋白质的游离氨基通过非酶促反应形成的结构多样的聚合物。1984年Brownlee等 [11]将体内类似于美拉德反应途径形成的一类稳定的聚合物定义为晚期糖基化终产物（advance glycation end products，AGEs）。现代研究表明蛋白质非酶糖基化与糖尿病并发症 [12]、白内障 [13]、阿茨海默病 [14]等慢性病密切相关。

活性二羰基化合物乙二醛（glyoxal，GO）和甲基乙二醛（methylglyoxal，MGO）为蛋白质非酶糖基化中间体，极易与游离氨基酸和蛋白质的游离氨基发生反应，生成晚期糖基化终产物 [15]。在糖基化反应中，MGO和GO的活性是葡萄糖的20 000　倍 [16]。研究发现MGO可以引起体内多种蛋白发生非酶糖基化反应，如牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） [17]、胶原蛋白 [18]等。另外，糖尿病患者血浆中GO和MGO的含量较高，MGO含量为16～27 μg/100 mL，而正常人体内发现量为3.0～7.0 μg/100 mL [19]。目前在多种食品中也发现MGO和GO的存在，如蜂蜜、面包、葡萄酒、啤酒和沙丁鱼油 [20-24]。因此对于抑制MGO与GO引起的蛋白质非酶糖基化的研究具有重大意义。

众多学者对各种抑制或改变糖基化进程的物质进行研究，发现了一系列天然或者合成的化合物可抑制蛋白质非酶糖基化，如大蒜提取物 [25]、黄酮类化合物 [26]、氨基胍 [27]。本课题组前期研究发现 [28]，马兰粗提物具有良好的抑制蛋白糖基化的效果，抑制率达到49%～71%，其抑制作用与马兰中的多酚含量存在一定的线性关系。本实验旨在对马兰多酚提取物进行分离纯化，鉴定其主要组成，并分析马兰粗提物中抑制蛋白糖基化主要组分，为马兰抑制蛋白糖基化从而减少糖尿病并发症发生提供理论依据。

1　材料与方法

优质马兰（取可食部分，即叶子及地下嫩茎）浙江省丽水市林业科学研究院马兰种质资源圃。

AB-8型大孔吸附树脂南开大学化工厂；Sephadex LH-20葡聚糖凝胶树脂美国GE Healthcare公司；3,5-咖啡酰奎宁酸标准品成都普瑞法生物制剂公司；牛血清白蛋白、青霉素链霉素混合液生工生物工程（上海）股份有限公司；MGO、GO美国Sigma公司；其他均为分析纯，购自南京化学试剂有限公司。

AUY220分析天平日本岛津公司；722型可见分光光度计上海精密科学仪器有限公司；RE-52A旋转蒸发器上海亚荣生化仪器厂；KQ-300B超声波清洗器　昆山市超声仪器有限公司；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵　郑州长城仪器厂；LD5-10低速离心机北京医用离心机厂；XW-80A微型旋涡混合仪、DBS-100电脑全自动部分收集器、DHL-A恒流泵、HD-3型紫外检测仪上海沪西分析仪器有限公司；GF254薄层层析硅胶板烟台江友硅胶开发有限公司；WFH-201B紫外投射反射仪上海精科实业有限公司；1290型高效液相色谱仪、9460型四极杆串联质谱美国安捷伦公司；AVANCE400型核磁共振波谱仪瑞士Bruker公司；GL-22M超高速离心机赛特湘仪离心机仪器有限公司；Infinite 200Pro TECAN奥地利Tecan有限公司；150E光照培养箱金坛市吉特实验仪器厂。

马兰→干燥→粉碎→80%乙醇溶液提取（料液比1∶10（m/V）），60 ℃水浴60 min→磁力搅拌→离心（1 800×g，20 min）→残渣以同样的方法重复提取2 次→减压浓缩→冷冻干燥→4 ℃冷藏备分析用

将AB-8树脂装柱（Ф6 cm×60 cm），将马兰粗提物用超声处理溶解进行湿法上样，先用水洗脱至洗脱液无色，再依次用20%、40%、60%、80%不同体积分数的乙醇洗脱，各洗脱5 个柱体积，洗脱速率为1 BV/h收集各组分流出液，用薄层色谱（thin layer chromatography，TLC），展开体系为：V（乙酸乙酯）∶V（正丁醇）∶V（甲醇）∶V（水）=5∶3∶1∶1，检测洗脱液，将Rf值相同的洗脱组分合并，减压浓缩，冷冻干燥。分别得到F1（20%洗脱组分）、F2（40%洗脱组分）、F3（60%洗脱组分）、F4（80%洗脱组分）。

将洗脱组分用少量80%乙醇溶解，14 000×g离心5 min，取上清液过Sephadex LH-20柱，用80%乙醇等梯度洗脱。恒流泵控制流速为1 mL/min，部分收集器收集洗脱液，5 mL/管，用TLC跟踪分析每管洗脱液，将Rf值相同的洗脱组分合并。得到新的洗脱物。将新洗脱物用40%～50%的乙醇过Sephadex LH-20柱，相同条件下过两次，得到化合物Ⅰ。

经AB-8大孔吸附树脂纯化后，各组分经真空冷冻干燥至恒质量。分别精密称取一定质量的样品溶于80%乙醇中，采用Folin-Ciocalteus法测定，以没食子酸为对照品 [29]，测定总多酚含量，并按式（1）计算，并按公式（2）计算其得率。

式中：m 1为样品中总多酚的质量/mg；m 3为纯化前样品中总多酚的质量/mg。

1.3.4　高效液相色谱-质谱（high perfor mance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）分析条件

色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C 18（4.6 mm× 250 mm，5 μm）色谱柱，DAD检测器。流速：0.5 mL/min，柱温：25 ℃，检测波长：280 nm。流动相A：乙腈，流动相B：体积分数0.05%甲酸水溶液。流动相梯度：0 min（20% A），0～20 min（20%～30% A），20～40 min（30%～60% A）；进样量：3 μL。

质谱条件：电喷雾离子化（ESI）源，负离子模式检测，喷雾电压为10 kV，毛细管温度为300 ℃，氮气流速为1 L/min。

采用0.2 mol/L、pH 7.4的磷酸缓冲液配制质量浓度为30 mg/mL BSA和浓度为20 mmol/L的GO/MGO，分别加入不同马兰组分F1、F2、F3、F4、3,5-二咖啡酰奎宁酸及马兰粗提物，质量浓度均为30 mg/mL。青霉素链霉素混合液体积分数为0.5%。将所有试剂和材料加入反应管后，密封管口，于37 ℃恒温培养箱中反应168 h。期间每24 h取样500 μL，立即放入─80 ℃冰箱冷冻结束反应.，作为阳性对照组。以0.2 mol/L、pH 7.4的磷酸缓冲液代替不同马兰组分做如上操作，作为阴性对照。稀释10 倍后利用酶标仪在E x/E m340nm/465nm测定荧光值。读465 nm荧光强度得出样品管吸光度（A）值。应用以下公式计算化含物对BSA糖基化反应的抑制作用，用抑制率表示。

2　结果与分析

表1　乙醇洗脱组分总多酚质量分数
Table1Total polyphenol contents of elution fractions by aqueous ethanol

指标F1F2F3F4乙醇体积分数%20406080总多酚质量分数/%13.2310.050.860.62总多酚得率/%43.0248.971.40.2

由表1可知，F2组分总多酚得率最高，达到48.97%，多酚组成种类相对较为单一。虽然F1总多酚含量略高于F2，故对F1进行进一步分析，发现其组成复杂，种类多，单一含量低，难以得到主要成分。本研究对F2做进一步分析。

Fr2的高效液相色谱图如图1A所示，图中显示有两个主要峰，分别对应成分Ⅰ和成分Ⅱ。经Sephadex LH-20柱反复　分离，得到成分Ⅰ，纯度为96%。对成分Ⅰ进行了HPLC-MS和核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）分析。

成分Ⅰ的一、二级质谱图如图1B和图1C，出现m/z 515[M-H] -的准分子离子峰，表明该化合物的相对分子质量为516；另有m/z 353[M-H-162] -的碎片离子峰。在ESI-MS 2图中，出现m/z 191[M-H-162-162] -的碎片离子峰。推测该化合物中存在高度对称结构，分子式为C 25H 24O 12，结合文献[30-31]和该物质的紫外吸收光谱（图1D），初步推测成分Ⅰ是二咖啡酰奎宁酸。

图1　Fr2的高效液相色谱图（A）及成分Ⅰ的一级（B）、二级（C）C质谱和紫外吸收光谱图（D）D
Fig.1HPLC of Fr2（A）and ESI-MS（B），ESI-MS 2（C），ultra-violent spectrum（D）of compoundⅠ

成分ⅠESI-MS m/z 515[M-H] -（分子式为C 25H 24O 12）。 1H-NMR（400 MHz，MeOD）：δ 2.26（2H，m），5.40（1H，m），4.00（1H，d，J=4.4Hz），5.45（1H，m），2.35（1H，brd），2.30（1H，m），7.08（2H，brs，H-2'和H-2''），6.80（2H，d，J=8.4 Hz，H-5'和H-5”），6.98（2H，brd，J=8.4 Hz，H-6'和H-2''），7.65（1H，d，J=16.0 Hz），6.39（1H，d，J=16.0 Hz），7.08（2H，brs，H-2'和H-2''），6.80（2H，d，J=8.4 Hz，H-5'和H-5''），6.98（2H，brd，J=8.4 Hz，H-6'和H-2''），7.57（1H，d，J=16.0 Hz），6.30（1H，d，J=16.0 Hz）。

13C-NMR（150 MHz，MeOD）：δ 73.3（C-1），36.2（C-2），70.7（C-3），69.2（C-4），71.7（C-5），34.6（C-6a），175.9（C-7），126.5（C-1'），113.9（C-2'），145.6（C-3′），148.2（C-4'），115.1（C-5'），121.6（C-6'），145.9（C-7'），114.2（C-8'），167.5（C-9'），126.4（C-1''），113.7（C-2''），145.6（C-3''），148.1（C-4”），115.1（C-5''），121.6（C-6''），145.4（C-7''），113.7（C-8''），166.9（C-9''）。

1H-NMR给出了两组咖啡酰基质子的特征信号δ 7.08（2H，brs），6.98（2H，brd，J=8.4 Hz），6.80（2H，d，J=8.4 Hz）和两组AB型的反式烯质子信号δ 7.65（1H，d，J=16.0 Hz），7.57（1H，d，J= 16.0 Hz），6.39（1H，d，J=16.0 Hz），6.30（1H，d，J=16.0 Hz）。同时显示了奎尼酸基团的存在，包括4 个亚甲基质子：δ 2.26（2H，m，H-2），2.35（1H，brd，H-6a），2.30（1H，m，H-6b）。此外也显示了3 个连氧氢的存在：δ 4.00（1H，d，J=4.4 Hz，H-4），5.40（1H，m，H-3），5.45（1H，m，H-5）。

13C-NMR数据显示了该化合物中存在2 个亚甲基碳（δ 34.6，36.2），3 个连氧次甲基碳（δ 69.2，70.7，71.1）、1个季碳（δ 73.3）和1 个羰基碳信号（δ 175.9）。

化合物Ⅰ的 1H-NMR图中显示了H-3和H-5存在低场位移，同时 13C-NMR图中也显示了C-3和C-5存在低场位移，证明了两个咖啡酰基连在奎尼酸的3号位和5号位上，以上NMR数据与文献报道 [32-33]3,5-二咖啡酰奎宁酸一致，确认成分Ⅰ为3,5-二咖啡酰奎宁酸。

成分Ⅱ的液相色谱图如图1A，在成分Ⅱ旁边存在两个尖峰，说明成分Ⅱ未达到完全分离，存在同分异构体。一级质谱和紫外吸收光谱图见图2A和图2B。在ESI-MS图中，出现m/z 677[M-H] -的准分子离子峰，表明该化合物的分子质量为678 g/mol；另有m/z 515[MH-162] -和m/z 161的碎片离子峰。据文献[34-35]报道，3,4,5-三咖啡酰奎宁酸的一级质谱结构为677[M-H] -的准分子离子峰，二级质谱结构中有515[M-H-162] -和m/z 191的碎片离子峰。而该物质的紫外吸收光谱与化合物Ⅰ相似，推测该物质与化合物Ⅰ相似，为3,4,5-三咖啡酰奎宁酸。

图2成分Ⅱ的二级质谱图（A）及紫外吸收光谱图（B）B
Fig.2ESI-MS（A）and ultra-violent spectrum（B）of compoundⅡ

马兰不同组分（F1、F2、F3、F4、3,5-二咖啡酰奎宁酸、马兰粗提物）抑制GO引起的蛋白质糖基化效果如图3A、3B所示。马兰不同组分的抑制效果排序如下：F4＜马兰粗提物＜F1＜F3＜F2＜3,5-二咖啡酰奎宁酸。其中，F2 组分的抑制效果明显高于马兰粗提物的抑制作用，说明经过大孔吸附树脂的富集和纯化，40%乙醇洗脱的组分中含有较多能够抑制蛋白质非酶糖基化的活性物质；F2组分分离得到的3,5-二咖啡酰奎宁酸具有非常好的抑制作用，抑制率达到92%；F1与F3的抑制效率相似，略高于马兰粗提物的抑制作用，且与马兰粗提液的抑制作用存在显著性差异，说明F1与F3中含有能够抑制蛋白质非酶糖基化的活性物质，但是活性物质成分没有F2组分多；而F4的抑制作用较弱，因此F4组分中含有的活性成分较少。

图3马兰组分对BSA-GO模型中AGEs的抑制作用
Fig.3The AGEs inhibitory effect of Kalineris in BSA-GO assay

图4马兰组分对BSA-MGO模型中AGEs的抑制作用
Fig.4The AGEs inhibitory effect of Kalineris in BSA-MGO assay

马兰不同组分（F1、F2、F3、F4、3,5-二咖啡酰奎宁酸）抑制MGO引起的蛋白质糖基化效果如图4A、4B所示。马兰不同组分的抑制效果排序如下：F3＜F4＜F1＜马兰粗提物＜F2＜3,5-二　咖啡酰奎宁酸。其中，3,5-二咖啡酰奎宁酸组分的抑制效果最佳，抑制率达到95%，与2.3节结果一致；F2组分的抑制效果较粗提取液好，F1组分的抑制作用略低于粗提液，而F3、F4组分的抑制效果远低于粗提物，说明经过大孔吸附树脂的富集和纯化，功能成分大部分被20%乙醇和40%乙醇洗脱下来，而60%乙醇和80%乙醇洗脱液中的功能成分含量很少。

3　结论

对马兰进行分离纯化，选取40%乙醇洗脱物经过AB-8型大孔吸附树脂和Sephadex LH-20多次纯化后，得到两个组分，其中一个经质谱（mass spectrometry，MS）、NMR等技术方法鉴定为3,5-二咖啡酰奎宁酸；另一个通过MS推断为3,4,5-三咖啡酰奎宁酸。

研究大孔吸附树脂纯化所得组分和3,5-二咖啡酰奎宁酸抑制蛋白质非酶糖基化效果时发现，40%乙醇洗脱组分F2较粗提物具有更好的抑制效果，抑制率达到70%以上，因此经过大孔吸附树脂的富集和纯化，40%乙醇洗脱组分中含有较多抑制蛋白质糖基化的成分。3,5-二咖啡酰奎宁酸的抑制效果最佳，达到90%以上。对马兰抑制蛋白糖基化进行研究，进一步了解其药用价值，可为抑制AGEs新药研发提供新的思路，开发出药食同源、绿色、安全、副作用小的降血糖产品。

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Separation，Purification and Inhibitory Effect on Protein Glycosylation of Phenols in Kalimeris

ZHU Xiaolin 1，LIU Yuejun 2，LU Min 1，L☒Lishuang 1，*
（1.Ginling College，Nanjing Normal University，Nanjing210097，China；2.Lishui Forestry Research Institute of Zhejiang Province，Lishui323000，China）

Abstract：Macroporous resin was used to separate the crude extract of Kalimeris and four polyphenol-rich fractions （F1, F2, F3, and F4） were obtained. F2 was further purif ed by Sephadex LH-20 column chromatography and 3,5-dicaf eoylquinic acid and 3,4,5-tricaf eoylquinic acid were obtained. Using the protein glycosylation reaction models of bovine serum albumin-methylglyoxal （BSA-MGO） and bovine serum albumin-glyoxal （BSA-GO）, we analyzed the inhibitory activity of each component on protein glycosylation. The results showed that the content of polyphenols was in the order of F2 > F1 > F3 > F4, and all the four fractions had good inhibitory ef ects on protein glycosylation in both models. In BSA-GO reaction model, the inhibitory capacity against protein glycosylation was in the order of 3,5-dicaf eoylquinic acid > F2 > F3 > F1 > crude extract of Kalimeris > F4. In BSA-MGO reaction model, the inhibitory capacity against protein gly cosylation was in the order of 3,5-dicaf eoylquinic acid > F2 > crude extract of Kalimeris > F1 > F4 > F3. These results are consistent with the inhibitory ef ect of 3,5-dicaf eoylquinic acid separated from F2. The 3,5-dicaf eoylquinic acid as a phenolic compound from Kalimeris had a potent inhibitory ef ect on protein glycosylation induced by MGO or GO.

Key words：Kalimeris； polyphenols； 3,5-dicaf eoylquinic acid； protein non-enzymatic glycosylation

基金项目：浙江省自然科学基金项目（LY12C15001）；江苏省基础研究（自然科学）基金项目（BK2012850）；江苏省普通高校自然科学研究资助项目（12KJB550005）

作者简介：朱晓琳（1988—），女，硕士研究生，研究方向为食品化学。E-mail：marynutralong@gmail.com

*通信作者：吕丽爽（1969—），女，副教授，博士，研究方向为食品化学、功能性食品的分离及活性。E-mail：lishuanglv@126.com

马兰中酚类的分离纯化及其抑制蛋白糖基化的研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结论

1　材料与方法

2　结果与分析

3　结论