单环刺螠内脏多糖结构的分析及其对脂质过氧化物的清除作用

朱森君,陈米娜,牛庆凤,李涛,曲有乐,陈荫*

(浙江海洋学院食品与医药学院,浙江舟山316022)

摘要:为开发单环刺螠内脏中活性多糖成分,利用两步酶解法提取单环刺螠多糖,对其单糖组成、分子质量和连接方式等理化性质和结构特征进行研究,并通过体外清除脂质过氧化物实验对其活性进行初步评价。结果表明:采用木瓜蛋白酶和胰蛋白酶两步酶解后,单环刺螠内脏多糖得率为6.2%。单环刺螠内脏多糖(viscera polysaccharide,VP)分子质量约为4.1×10 3u,从单糖组成可以看出,VP为组成复杂的类糖胺聚糖,主要含有葡萄糖(Glc),其次还含有氨基葡萄糖(GlcN)、甘露糖(Man)、半乳糖(Gal)和岩藻糖(Fuc),还含有少量的木糖(Xyl)、鼠李糖(Rha)、葡萄糖醛酸(GlcUA)和氨基半乳糖(GalN)。其单糖组成物质的量比为n(Man)∶n(GlcN)∶n(Rha)∶n(GlcUA)∶n(GalN)∶n(Glc)∶n(Gal)∶n(Xyl)∶n(Fuc)= 1∶1.38∶0.87∶0.53∶0.52∶5.37∶1.38∶1.05∶2.40。VP还含有少量的硫酸基,含量为8.9%。葡萄糖作为VP中最主要的单糖,其连接方式主要为Glcp(1→、→4)-Glcp(1→、→4,6)-Glcp(1→和→3,6)-Glcp(1→。甘露糖主要含有Manp(1→、→2)-Manp(1→和→6)-Manp(1→连接方式。半乳糖含有Galp(1→和→4)-Galp(1→连接方式。而岩藻糖主要含有→4)-Fucp(1→,另外还有Fucp(1→、→3)-Fucp(1→和→3,4)-Fucp(1→连接方式。类糖胺聚糖具有丰富的生物活性,对VP进行初步体外抗氧化活性研究表明,其具有显著的脂质过氧化物清除活性,半数清除质量浓度为2.47mg/mL。

关键词:单环刺螠;内脏多糖;结构;理化性质;脂质过氧化

单环刺螠(Urechis unicinctus)俗名海肠、海肠子,属于螠虫动物门(Echiurioidea)、螠纲(Echiurida)、无管螠目(Xenopneusta)、刺螠科(Urchidae),分布于俄罗斯、日本、朝鲜和我国黄渤海沿岸,是我国北方沿海泥沙岸潮间带下区及潮下带浅水区底栖生物的常见种。单环刺螠在山东境内主要分布在烟台、青岛等地沿海的泥滩或岩石缝中。山东胶东地区是我国单环刺螠的最大产地。单环刺螠个体肥大,肉味鲜美,体壁肌富含蛋白质和多种人体必需氨基酸。自古以来,在我国、日本和朝鲜沿海均作为名贵的海鲜食品,有较高的经济价值 [1-2]。人们的传统做法只食用单环刺螠的体壁,而占其身体质量2/3的内脏却遭废弃。但有研究发现,单环刺螠废弃内脏蛋白质含量为18.25%,脂肪含量为0.12%,总糖含量为4.09%,且含有丰富的Ca、Mg、Fe、Zn等元素;同时也含有丰富的二十碳五烯酸(eicosapntemacnioc acid,EPA)、二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)和二十二碳五烯酸(docosapentaenoic acid,DPA)。因此,单环刺螠废弃内脏也极具开发利用价值 [3]

随着对海洋生物资源的开发和糖类药物研究的日益重视,海洋动物活性多糖的研究也越来越受到人们广泛的关注。如海参黏多糖具有提高免疫力、抗肿瘤、抗凝血等多种活性,是海参中主要的活性物质 [4-5]。海参内脏中也含有丰富的多糖活性物质,对海参废弃内脏多糖的研究不仅可以避免资源的浪费,还能提高海参加工的附加产值 [6]。本实验以对海参内脏多糖的研究为指导,对单环刺螠内脏多糖进行深入研究,以期筛选出活性多糖成分,为单环刺螠内脏的废物再利用,提高单环刺螠的经济产值提供重要参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

单环刺螠购于青岛齐东路水产市场。

单糖标准品(色谱纯)、标准牛血清白蛋白(色谱纯)、95%乙醇、甲醇、丙酮、浓硫酸、咔唑、四硼酸钠、对二甲氨基苯甲醛(p-dimethylaminobenzaldehyde,DMAB)、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone,PMP)美国Sigma公司;不同分子质量葡聚糖标准品(色谱纯)美国Fluka公司;Folin-酚乙液、重蒸苯酚(分析纯)北京鼎国生物工程公司;木瓜蛋白酶(50万U/g)亚太恒信生物技术有限公司;胰蛋白酶(250U/mg)科博赛尔科技发展有限公司;酒石酸钾钠、碳酸钠、硫酸铜、硫酸钾、硫酸钠、三氟乙酸、溴化钾、硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)、乙酰丙酮等均为分析纯国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

TD5K低速大容量离心机长沙东旺实验仪器有限公司;HH-1型恒温水浴锅国华电器有限公司;UV-1100型紫外-可见分光光度计上海美谱达仪器有限公司;AKTA FPLC快速蛋白质液相色谱仪瑞典Pharmacia Biotech公司;Nicolet5700傅里叶红外光谱仪美国Thermo Nicolet公司;FD-1000EYELA真空冷冻干燥机、EYELA旋转蒸发仪上海爱朗仪器有限公司;Agilent1260高效液相色谱仪、Agilent XDB-C 18色谱柱美国Agilent公司;FD-1C-50冷冻干燥机北京博医康实验仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 单环刺螠内脏多糖提取

新鲜单环刺螠,剪去一端,挤出内脏,绞碎匀浆,加3倍体积丙酮脱脂,磁力搅拌过夜,抽滤后取沉淀,烘干,粉碎得内脏干粉,按1∶20(m/V)加入蒸馏水,80℃水浴提取4h,调节pH7.0,加入1%木瓜蛋白酶在60℃水浴中消化4h,调节pH10.0,胰蛋白酶水解3h,提取温度60℃,加酶量0.5%。提取完后调pH值至中性,100℃水浴加热15min灭酶,离心取上清液,浓缩至原体积的1/15,80%乙醇沉淀,静置过夜,离心取沉淀,溶解后透析(截留相对分子质量3500透析袋),浓缩后冷冻干燥,得到内脏多糖(viscera polysaccharide,VP) [7-8]

1.3.2 内脏多糖的单糖组成测定

采用完全酸水解后PMP柱前衍生高效液相色谱法分析其单糖组成。采用PMP衍生化方法,对等物质的量配制的单糖标准品和各多糖全水解后产物进行PMP衍生,然后进行液相色谱分析。色谱条件为:色谱柱:Agilent XDB-C 18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm);柱温:35℃;流动相:磷酸盐缓冲液(pH6.7)-CH 3CN(83∶17,V/V);流速:1.0mL/min;检测器:DAD检测器(245nm) [9]

1.3.3 内脏多糖的分子质量测定

采用高效凝胶渗透色谱法分析单环刺螠多糖的纯度及分子质量范围,色谱条件:色谱柱:Shodex Ohpak SB-806HQ凝胶色谱柱(300mm×8.0mm,13μm);柱温:35℃;流动相:0.1mol/L的Na 2SO 4;流速:0.5mL/min;检测器:示差检测器 [10]

标准曲线的绘制:已知分子质量的系列标准葡聚糖(2.5×10 3、6.1×10 3、9.6×10 3、21×10 3、22.8×10 3、47.1×10 3u),加流动相溶解,制成5mg/mL的标准溶液。运用GPC分析软件以标准多糖分子质量的对数(lgM w)对保留时间(t R)作图,绘制标准曲线。

1.3.4 内脏多糖的理化性质测定

以葡萄糖为标准品,采用硫酸-苯酚法测定总糖含量;以牛血清白蛋白为标准品,采用Folin-酚法测定蛋白质含量;以葡萄糖醛酸作为标准品,采用咔唑-硫酸法测定糖醛酸含量;以硫酸钾为标准品,采用氯化钡-明胶比浊法测定硫酸根含量;采用Elson-Morgan法,以氨基葡萄糖为标准品测定氨基糖含量 [11-15]

1.3.5 内脏多糖的红外光谱扫描

采用KBr压片法,将约为0.1mg多糖样品与适量干燥KBr粉末研磨混合均匀后,研制成透明薄片在Nicolet Nexus470型红外光谱仪上进行测定。红外光谱仪测定参数如下:背景扫描次数:32次;扫描范围为4000~400cm -1;分辨率:4.0cm -1;检测器:DTGS检测器。

1.3.6 内脏多糖的甲基化

采用改良的Hakomori法对单环刺螠内脏多糖进行甲基化分析 [16]。用2mol/L三氟乙酸将甲基化的样品完全酸水解,经硼氢化钠还原,用吡啶和乙酸酐反应生成乙酰化衍生物,进行气相色谱-质谱联用(gas chromatographymass spectrometry,GC-MS)分析。分析条件:色谱柱:Agilent122-2932DB225(0.25mm×30m,0.25μm);程序升温:从100℃开始以5℃/min升温至220℃;进样口温度:250℃;质谱真空度:14.5psi;载气:氦气;离子源:EI70eV;检测器:MSD检测器;流速:1.0mL/min;进样量为0.2μL。

1.3.7 内脏多糖抗脂质过氧化活性测定

以TBA法检测多糖样品的脂质过氧化清除能力,样品配制成不同质量浓度梯度(0、2、4、6、8、10mg/mL)的VP溶液,以2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(butylated hydroxytoluene,BHT)和VC作为阳性对照,样品抗氧化活性用对卵黄脂蛋白脂质过氧化的清除率表示。分别加入1.0mL不同质量浓度的VP溶液,吸取0.4mL卵黄悬液(卵黄与磷酸缓冲溶液(phosphate buffered solution,PBS)体积比1∶25),再加入0.4mL25mmol/L的FeSO 4·7H 2O,用PBS补充至4mL,振荡15min,取出后加入1.0mL20%的三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)静置,3500r/min离心10min,吸取4mL上清液加入2mL0.8%TBA,加塞放入沸水浴中反应15min,在分光光度计532nm波长处比色测定吸光度,以空白管(6mL PBS)归零,未加样品管的吸光度为A 0,样品管的吸光度为A,样品抗氧化活性用对卵黄脂蛋白脂质过氧化的清除率表示,按照下式计算 [17]

2 结果与分析

2.1 单环刺螠内脏多糖的提取

表1 不同提取方法的多糖得率及糖含量比较
Table1Polysaccharide yields and chemical composition of extracts by different extraction methodsthods

指标热水提取TCA法Sevag法TCA法+Sevag法热水提取+酶解多糖得率/%11.97.85.34.96.2糖含量/%30.351.263.670.469.2蛋白质含量/%53.119.27.85.22.7

如表1所示,脱脂单环刺螠内脏粉末经热水提取后再经两步酶解,多糖得率为6.2%,呈棕色絮状。单环刺螠内脏富含蛋白质,热水提取后粗多糖中混有大量蛋白质,需要进行蛋白质的去除。对比Sevag法或TCA法等去除蛋白质效果来看,通过热水提取后两步酶解,不仅可以使多糖充分溶解,而且能够使蛋白质变性酶解,释放与之结合的多糖,同时也起到了去除蛋白质的效果。所以与单纯的热水提取后Sevag法或TCA法去除蛋白质相比,热水提取后再酶解能够提高多糖粗品的得率和纯度,并且减少了多糖的降解或损失,更适合海洋动物多糖的提取。

2.2 单环刺螠内脏多糖的单糖组成

图1 PMP柱前衍生高效液相色谱图
Fig.1HPLC chromatogram of the PMP pre-column derivative

如图1A所示,和单糖标准品的色谱图(图1B)比对可知,VP单糖组成非常复杂,是既含有中性糖,又含有酸性糖和碱性糖的杂多糖。另外,中性糖还包括了六碳糖、五碳糖和六碳甲基糖。单糖组成中葡萄糖(Glc)是最主要成分,其次还含有氨基葡萄糖(GlcN)、甘露糖(Man)、半乳糖(Gal)和岩藻糖(Fuc),还含有少量的木糖(Xyl)、鼠李糖(Rha)、葡萄糖醛酸(GlcUA)和氨基半乳糖(GalN)。所含单糖物质的量比为n(Man)∶n(GlcN)∶n(Rha)∶n(GlcUA)∶n(GalN)∶n(Glc)∶n(Gal)∶n(Xyl)∶n(Fuc)= 1∶1.38∶0.87∶0.53∶0.52∶5.37∶1.38∶1.05∶2.40。2.3单环刺螠内脏多糖的分子质量

图2VP高效凝胶渗透色谱图
Fig.2HPGPC chromatogram of VP

如图2所示,单环刺螠内脏多糖VP的高效凝胶渗透色谱图呈现单一和较对称的峰,表明单环刺螠内脏多糖的分子质量分布比较集中。通过分子质量标准曲线方程:y=-0.7919x+21.601(R 2=0.997)计算得到VP分子质量主要集中在4.1×10 3u左右。由此可知,单环刺螠内脏多糖VP为分子质量分布较为单一的低聚糖。

2.4 单环刺螠内脏多糖的理化性质分析

对单环刺螠内脏多糖VP进行理化性质分析,其总糖含量为69.2%,蛋白质含量2.7%,表明通过酶解已经去除绝大部分蛋白质,糖醛酸含量为5.1%,氨基己糖含量为13.6%,结果与单糖组成一致。另外,和很多海洋动物来源的类糖胺聚糖一样,VP含有硫酸取代基,含量为8.9%。VP总糖含量测定以含量最多的葡萄糖Glc为标准对照品,但是由于氨基己糖苯酚硫酸法不显色,另外由于硫酸取代基的影响,造成糖含量偏低。因此对于富含氨基糖的多糖总糖含量测定更接近于中性糖测定 [18]。综合以上结果可知,单环刺螠内脏多糖为硫酸酯化的低聚类糖胺聚糖。

2.5 单环刺螠内脏多糖的红外光谱分析

图33单环刺螠内脏多糖的红外光谱
Fig.3IR spectrum of VP

如图3所示,3387cm -1处的强吸收峰是多糖O—H或者N—H的吸收峰;2930cm -1处弱吸收为甲基或者亚甲基C—H的伸缩振动;1652cm -1处的吸收峰归属为羧基或酰胺基团C=O的伸缩振动;1245cm -1处的弱的吸收峰是S=O的伸缩振动引起的,同样印证了多糖含有少量硫酸基;1038cm -1处的强吸收峰为多糖环醚C—O—C的伸缩振动峰,是多糖的特征吸收峰。818cm -1处的吸收峰表明VP存在b构型连接方式 [19-20]

2.6 单环刺螠内脏多糖的甲基化分析

表22单环刺螠内脏多糖甲基化后GC--MMSS分析
Table2Analysis results by GC-MS for methylated polysaccharide

甲基化单糖碎片离子峰m/z连接方式比率1,5-Ac 2-2,3,4-Me 2-L-Fuc101、117、131、161、175Fucp(1→1.0 1,3,5-Ac 3-2,4-Me 2-L-Fuc117、131、233、247→3)-Fucp(1→0.75 1,5-Ac 2-2,3,4,6-Me 4-D-Man87、101、117、145、161、205Manp(1→0.5 1,5-Ac 2-2,3,4,6-Me 4-D-Glc87、101、117、145、161、205Glcp(1→2.0 1,5-Ac 2-2,3,4,6-Me 4-D-Gal87、101、117、145、161、205Galp(1→0.78 1,4,5-Ac 3-2,3-Me 2-L-Fuc101、117、143、203→4)-Fucp(1→2.5 1,3,4,5-Ac 4-2-Me-L-Fuc117、129、173、275→3,4)-Fucp(1→0.42 1,2,5-Ac 3-3,4,6-Me 3-D-Man129、161、189→2)-Manp(1→1.2 1,4,5-Ac 3-2,3,6-Me 3-D-Glc87、101、113、117、131、161、173、233→4)-Glcp(1→6.4 1,4,5-Ac 3-2,3,6-Me 3-D-Gal87、101、113、117、131、161、173、233→4)-Galp(1→1.9 1,5,6-Ac 3-2,3,4-Me 3-D-Man87、101、117、129、161、189、233→6)-Manp(1→0.6 1,4,5,6-Ac 4-2,3-Me 2-D-Glc129、189→4,6)-Glcp(1→1.4 1,3,5,6-Ac 4-2,4-Me 2-D-Glc117、129、189、233→3,6)-Glcp(1→1.05

VP单糖组成非常复杂,特别是碱性糖和酸性糖由于极性较大,很难通过GC-MS对其连接方式进行准确的测定。本实验只确定了大部分中性糖的连接方式。如表2所示,葡萄糖是VP最主要的单糖组成,其连接方式主要为Glcp(1→、→4)-Glcp(1→、→4,6)-Glcp(1→和→3,6)-Glcp(1→。甘露糖主要含有Manp(1→、→2)-Manp(1→和→6)-Manp(1→连接方式。半乳糖含有Galp(1→和→4)-Galp(1→连接方式。而岩藻糖主要含有→4)-Fucp(1→连接方式,另外还含有Fucp(1→、→3)-Fucp(1→和→3,4)-Fucp(1→。从这些多糖的连接方式可以看出,单环刺螠内脏多糖富含分支结构,推测分支可能发生在→4)-Fucp(1→的3位,→4)-Glcp(1→的6位或→3)-Glcp(1→的6位,这些位点也可能是硫酸基的取代位点。GC-MS未给出更多单糖的连接方式相关信息,因此不能判断多糖的构象,进一步确定糖醛酸和氨基糖的连接方式、多糖的构象及主链、支链的连接顺序还需要进行深入的结构研究。

2.7 单环刺螠内脏多糖的抗脂质过氧化活性

糖胺聚糖是很多海洋生物如海参、扇贝的重要活性成分 [21-22],具有广泛的生物活性,而调节血脂是其重要活性之一。研究表明海洋糖胺聚糖能够有效地降低脂质过氧化物的产生,通过自由基的清除达到调节心血管并延缓衰老的作用 [23]。单环刺螠内脏多糖作为低分子质量的硫酸酯化类糖胺聚糖,通过对比分析,内脏多糖中的类糖胺聚糖体现出良好的体外抗脂质过氧化活性(图4),在10mg/mL时对自由基的清除率接近90%,其半数清除质量浓度为2.47mg/mL,表明单环刺螠内脏多糖存在较好的脂质过氧化物清除作用,推测单环刺螠内脏类糖胺聚糖是单环刺螠内脏中的活性成分,其生物活性有待进一步深入开发。

图44单环刺螠内脏多糖的脂质过氧化物清除曲线
Fig.4Scavenging curve of VP against lipid peroxide

3 结论

本实验通过两步酶解法提取单环刺螠内脏多糖,得率为6.2%,和单纯热水提取相比,酶解法大大降低了内脏多糖的蛋白质含量,相应地提高了多糖的纯度。单环刺螠内脏多糖的分子质量分布较为均一,约为4.1×10 3u。理化性质和单糖组成分析结果表明,单环刺螠内脏为硫酸酯化的类糖胺聚糖,硫酸根含量为8.9%,单糖组成以葡萄糖(Glc)为主,其次还含有氨基葡萄糖(Glc)、甘露糖(Man)、半乳糖(Gal)和岩藻糖(Fuc),还含有少量的木糖(Xyl)、鼠李糖(Rha)、葡萄糖醛酸(GlcUA)和氨基半乳糖(GalN)。海洋动物中很多都含有硫酸酯化的杂多糖,单糖组成各异,单环刺螠内脏多糖的单糖组成和栉孔扇贝、方格星虫等单糖组成较为相似,只是单环刺螠内脏多糖葡萄糖的比例更高,而方格星虫多糖不含有硫酸基 [24-25]

结构研究表明单环刺螠内脏多糖为富含β构型的多分支结构,主要由Glcp(1→、→4)-Glcp(1→、→4,6)-Glcp(1→和→3,6)-Glcp(1→组成,还存在Manp(1→、→2)-Manp(1→和→6)-Manp(1→连接方式。半乳糖含有Galp(1→和→4)-Galp(1→连接方式。而岩藻糖主要含有→4)-Fucp(1→,另外还有Fucp(1→、→3)-Fucp(1→和→3,4)-Fucp(1→连接方式。

海洋糖胺聚糖具有丰富的生物活性,在调节免疫力、调节心血管疾病和抗肿瘤等方面都具有良好的生物活性。而对单环刺螠内脏类糖胺聚糖体外活性的初步研究表明,其也呈现出良好的体外脂质过氧化物清除活性,提示其可能具有调节血脂、预防动脉粥样硬化等相关活性,具有深入研究的价值,其具体结构和生物活性还有待进一步研究。

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Physico-chemical Properties and Structure Analysis of Viscera Polysaccharide of Urechis unicinctus and Its Lipid Peroxidation Inhibition Activity

ZHU Senjun,CHEN Mina,NIU Qingfeng,LI Tao,QU Youle,CHEN Yin*
(College of Food and Pharmacy,Zhejiang Ocean University,Zhoushan316022,China)

Abstract:A polysaccharide was extracted from Urechis unicinctus viscera through digestion by papain and trypsin successively.The physico-chemical properties and structure information of the polysaccharide such as monosaccharide composition,molecular weight and monosaccharide linkages were investigated by chemical and modern spectroscopic analysis.The antioxidant activity in vitro of the polysaccharide was evaluated as well.The results showed that the yield of the viscera polysaccharide(VP)from Urechis unicinctus was6.2%.VP was a heteropolysaccharide with molecular weight of about4.1×10 3u,and consisted of mannose,glucosamine,rhamnose,glucuronic acid,galactosamine,glucose,galactose,xylose and fucose at a molar ratio of1:1.38:0.87:0.53:0.52:5.37:1.38:1.05:2.40.VP contained8.9%sulfate ester.As the most dominant monosaccharide found in VP,glucose had the linkages of Glcp(1→,→4)-Glcp(1→,→4,6)-Glcp(1→and→3,6)-Glcp(1→.And mannose had Manp(1→,→2)-Manp(1→and→6)-Manp(1→linkage styles.Galactose had the linkages of Galp(1→and→4)-Galp(1→.The linkages of fucose were composed of→4)-Fucp(1→,Fucp(1→,→3)-Fucp(1→and→3,4)-Fucp(1→.VP as a glycosaminoglycan-like polysaccharide had rich bioactivities.VP possessed good lipid peroxidation inhibition ability as evidenced by its EC 50value at2.47mg/mL.At10mg/mL,the inhibition rate of lipid peroxidation by VP was near90%.

Key words:Urechis unicinctus;viscera polysaccharide;structure;physico-chemical property;lipid peroxidation

中图分类号:R151.2

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2015)05-0067-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201505013

收稿日期:2014-04-28

基金项目:浙江省自然科学基金项目(LQ14H300001);海洋药物教育部重点实验室基金项目(KLMD(OUC)201402)

作者简介:朱森君(1992—),女,硕士研究生,研究方向为海洋天然药物。E-mail:abc973262556@163.com

*通信作者:陈荫(1984—),男,副教授,博士,研究方向为海洋药用资源开发与利用。E-mail:mojojo1984@163.com