沙门氏菌噬菌体STP4-a重组内溶素抑菌特性分析

林洪,李萌,王静雪*

(中国海洋大学食品科学与工程学院,山东青岛266003)

摘要:为研究内溶素重组蛋白LysSTP4对沙门氏菌的抑菌性能,采用扩散法和浊度法探讨不同pH值、温度、离子强度等条件对其裂解稳定性的影响。结果表明,LysSTP4在pH 5~10和温度30~50 ℃的条件下均能保持较高的活性,在-80 ℃条件下保存6 个月仍有85%的残留酶活力,与膜通透剂乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)协同作用能够有效抑制高浓度沙门氏菌的生长。

关键词:沙门氏菌;烈性噬菌体;内溶素

沙门氏菌为革兰氏阴性直杆菌,是一种重要的人畜共患病原菌。在国内外,由沙门氏菌引起的食源性疾病发生率一直位于前列 [1]。随着抗生素的大量和长期使用,越来越多的沙门氏菌产生了耐药性 [2-3]。Pan Zhiming等 [4]对我国境内1962—2007年中分离得到的Salmonella Pullorum进行耐药性检测,发现39%~95%的细菌对氯霉素、甲氧苄啶、氨苄青霉素等常用来治疗沙门氏菌感染的首选药物具有耐药性,超过56%的细菌具有多重耐药性,而且在1970—1979年和2000—2007年中有明显的耐药性增长趋势。因此,研究能够用于替代化学抗生素进行有效沙门氏菌防治的生物绿色抑菌剂具有非常重大的意义。

噬菌体内溶素是一类能够裂解细菌细胞壁的裂解酶 [5]。尽管在1957年噬菌体内溶素裂解细菌的能力就被首次报道,但直到2001年Nelson等 [6]才证实纯化的重组内溶素可以作为抗菌剂有效控制大鼠感染A族链球菌(group A streptococci)。到目前为止,内溶素已被用来防控和检测食品中的食源性致病菌如金黄色葡萄球菌、李斯特菌和梭状芽孢杆菌 [7-9]。另有研究指出与使用小分子抗生素或噬菌体颗粒用于抗菌治疗或预防相比,专一性的噬菌体内溶素不易导致抗性菌株的快速出现 [10]。随着克隆表达技术的成熟,国内外关于重组内溶素的报道越来越多,这些研究结果表明内溶素重组蛋白易于生产、易于工程改造并且仍具有一定的裂解专一性 [11-16]。因此,内溶素作为新型抗菌剂具有一定的优势。

在前期的工作中,本实验室分离得到一株新型广谱的T4型沙门氏菌噬菌体STP4-a,通过对STP4-a全基因组测序和分析得知gp193编码的蛋白为糖苷酶类型的内溶素,通过克隆表达纯化,获得内溶素重组蛋白。在本实验中将分析该内溶素的裂解性能,为沙门氏菌噬菌体内溶素及其他革兰氏阴性噬菌体内溶素的研究提供有效数据,并在利用内溶素抑菌研究方面提供有效信息。

1 材料与方法

1.1 菌株与噬菌体

宿主细菌为本实验室购买保存的鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028,噬菌体为本实验室分离保存的烈性沙门氏菌噬菌体STP4-a,保藏号为CCTCC M 2014145,含有内溶素基因的重组大肠细菌BL21(LysSTP4)由本实验室构建。

1.2 培养基

LB肉汤、LB琼脂、营养肉汤、营养琼脂均购于北京陆桥技术有限责任公司。液体、固体培养基均由成品制剂与蒸馏水按规定比例配制而成。

1.3 仪器与设备

HZQ-F100型振荡培养箱哈尔滨市东联电子技术开发有限公司;Sigma 3K15型高速冷冻离心机曦玛离心机(上海)有限公司;MLS-3750型高压蒸汽灭菌锅 日本Sanyo公司;Power Wave XS型酶标仪美国Biotek公司。

1.4 方法

1.4.1 重组蛋白LysSTP4的制备

取工程菌BL21(LysSTP4)单菌落加入到10 mL LB培养基(含50 μg/mL卡那霉素)中,37 ℃、150 r/min条件下振荡培养过夜,次日,按照1∶100的比例将菌液加入到新鲜的900 mL LB培养基(含50 μg/mL卡那霉素)中,37 ℃培养3 h,加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)(至终浓度为1 mmol/L),在37 ℃条件下进行诱导表达,150 r/min振荡培养4 h后,于4 ℃、3 381×g条件下离心15 min获得细胞。每300 mL菌液所得的细胞沉淀悬于30 mL结合缓冲液(20 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl,含300 mmol/L NaCl),充分混匀后,用超声波破碎仪进行破碎,条件为300 W、工作5 s、间隙15 s,工作次数99 次。于4 ℃、7 607×g条件下离心30 min,去除不溶性细胞碎片,上清过0.45 μm无菌滤膜,获得粗酶液,保存在4 ℃条件下。将4 mL Ni Sepharose TM6 Fast Flow填料装入空柱内,先后以1 mL/min的流速用纯水和结合缓冲液平衡柱子,然后加入25 mL的粗酶液,用低咪唑浓度结合缓冲液(含20 mmol/L咪唑的结合缓冲液)冲洗柱子洗脱杂蛋白,6 倍柱体积的高咪唑浓度洗脱缓冲液(含100 mmol/L咪唑的结合缓冲液)洗脱目的蛋白,并按照一个柱体积每管收集流出液,收集6 管,收集其中OD 280 nm值较高的4 管溶液,利用3 kD超滤离心管进行脱盐处理获得纯度较高的重组蛋白,并利用考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量。将重组蛋白置于-80 ℃条件下保存,使用前置于4 ℃条件下复溶。

1.4.2 LysSTP4对细菌的裂解活性测定

在前期工作中,经克隆表达纯化获得的重组蛋白LysSTP4纯度高,质量浓度为400 μg/mL,利用pH 8.0 Tris-HCl缓冲液稀释至100 μg/mL进行裂解活性的测定。参考Turner等 [17]的方法稍作修改,采用平板扩散法鉴定LysSTP4是否对细菌有裂解活性。取10 mL含1.5%琼脂的培养基平铺在平板中作为底层琼脂,待琼脂凝固后,在其上放置直径为9 mm的牛津杯,另取 10 mL含1.5%琼脂的培养基,加以400 μL的经高压灭菌致死的对数期沙门氏菌细菌,倒入平板中,待琼脂凝固后,取出牛津杯,小孔中加入12.5 μL 100 μg/mL的LysSTP4,将平板放置于4 ℃扩散1 h后于37 ℃过夜温育,观察小孔周围裂解圈。等量的pH 8.0 Tris-HCl缓冲液和100 μg/mL溶菌酶分别作为阴性和阳性对照组,以相同的条件测定对死亡沙门氏菌细胞壁的裂解效果。

1.4.3 浊度法测定LysSTP4裂解稳定性

参考Mikoulinskaia等 [18]的方法,挑取沙门氏菌单菌落至300 mL营养肉汤中,过夜培养,菌液中加入终质量浓度为5 g/100 mL的氯仿,室温静置15 min,7 607×g、4 ℃条件下离心10 min,沉淀用无菌纯水洗涤、复溶、再次离心,重复两次后获得细菌沉淀,置于-80 ℃保存。

裂解活性通过OD 450 nm降低幅度间接表示 [19]。在96 孔板中加入150 μL待测溶液,在37 ℃条件下测定OD 450 nm值。以不含内溶素的溶液作为空白对照,每组3 组平行。在37 ℃条件下10 min内OD 450 nm下降0.01的酶量定义为一个酶活力单位(U)。

1.4.3.1 重组蛋白LysSTP4的pH值稳定性测定

将细菌沉淀分别用20 mmol/L的三氟乙酸(pH 2.0),20 mmol/L的柠檬酸钠(pH 3.0、pH 4.0),20 mmol/L的丙二酸钠(pH 5.0、pH 6.0),20 mmol/L的Bris-Tris(pH 7.0),20 mmol/L的Tris-HCl(pH 8.0),20 mmol/L的甘氨酸(pH 9.0、pH 10.0)复溶,获得不同pH值的细菌悬浮液,将100 μL重组蛋白LysSTP4溶液加入到900 μL 细菌复溶液中,利用浊度法测定不同pH值条件下的OD 450 nm值并按照公式(1)计算相对酶活力。

1.4.3.2 重组蛋白LysSTP4温度稳定性测定

LysSTP4蛋白溶液分装至EP管中,分别放入30、37、45、50、55、65、75 ℃水浴锅中恒温处理,在0、15、30 min时,分别取100 μL与利用50 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl(含0.1% Triton X-100)复溶的900 μL细菌沉淀复溶液混合均匀,测定不同温度条件下的酶活力,并按照公式(2)计算相对酶活力。

1.4.3.3 重组蛋白LysSTP4离子强度稳定性测定

将细菌沉淀用50 mmol/L pH 8.0含0.1% Triton X-100的Tris-HCl复溶后分装至EP管中,将100 mmol/L ZnCl 2、CaCl 2、MgCl 2和FeSO 4溶液分别加入到细菌溶液中,使其终浓度分别为0、0.1、1、10 mmol/L,混匀。100 μL重组蛋白LysSTP4溶液加入到含不同离子浓度的900 μL细菌复溶液中,测定酶活力,并按照公式(3)计算相对酶活力。

1.4.3.4 重组蛋白LysSTP4保存稳定性测定

将LysSTP4保存在-80 ℃条件下,测定保存0、3、6 个月的酶活力。按照公式(4)计算残留酶活力。

1.4.4 膜通透剂乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)对重组蛋白LysSTP4裂解效果的影响

挑取沙门氏菌单菌落至营养肉汤中,过夜培养,菌液离心后,菌体沉淀用pH 8.0 Tris-HCl缓冲液复溶至细菌数量在10 7CFU/mL左右,将100 μL重组蛋白LysSTP4和100 μL 0.01 mol/L的EDTA溶液加入到800 μL 细菌复溶液中,37 ℃振荡培养,0、30、60、120 min时刻,取混合液经无菌生理盐水适当稀释后,平板涂布法测定菌落数。同时,为测定单独EDTA或内溶素对细菌的裂解效果,将100 μL EDTA溶液和LysSTP4分别同等体积的Tris-HCl缓冲液混合,加入到800 μL细菌复溶液中,相同培养条件下,测定菌落数目变化。

1.5 数据处理

统计学分析应用SPSS 12.0软件,用 的形式表示数据结果,利用标准方差分析数据,P<0.05为显著性差异,利用OriginPro 8.5软件进行作图。

2 结果与分析

2.1 重组蛋白LysSTP4对细菌的裂解活性

图1 LysSTP4裂解活性
Fig.1Lysis activity of LysSTP4

将沙门氏菌经过高压灭菌处理后,利用LysSTP4作用于细菌,平板扩散法结果如图1所示,同等质量浓度的重组蛋白和溶菌酶都能够形成透明裂解圈,而阴性对照的Tris-HCl缓冲液无透明圆圈形成。表明重组的融合蛋白具有裂解活性,但与同等质量浓度的溶菌酶相比,活力要低。

2.2 重组蛋白LysSTP4的pH值稳定性

图2pH值对LysSTP4裂解沙门氏菌活力的影响
Fig.2Effect of pH on the lytic activity of LysSTP4

pH 10条件下酶活力达到最高值,约为590 U/mL,因此将该条件下的酶活力作为基准比较其他pH值条件下的相对酶活力。由图2可知,在pH 6~8条件下,各组之间的酶活力没有显著的差异(P>0.05),约为最高酶活力的80%;而LysSTP4在pH<5的酸性条件下,相对酶活力仅为最高酶活力的20%左右。从裂解活力上可以得知LysSTP4为一种嗜碱性裂解酶,与蜡样芽孢杆菌噬菌体B4的内溶素重组蛋白LysB4(pH 8.0~10.0条件下有较高的酶活力)和蜡样芽孢杆菌噬菌体BPS13内溶素

LysBPS13(pH 7.5~10.5范围均有较高的酶活力)较为

一致[11,20]。

2.3 重组蛋白LysSTP4的温度稳定性

图3温度对LysSTP4裂解沙门氏菌活力的影响
Fig.3Effect of temperature on the lytic activity of LysSTP4

重组蛋白LysSTP4在4 ℃条件复溶且未经温水浴处理时,酶活力最高,约为360 U/mL。由图3可知,经30、37 ℃处理30 min内酶活力没有显著变化;而在45、50 ℃条件下处理30 min后,酶活力显著降低,相对酶活力约为60%;在55 ℃条件下,相对酶活力仅约为30%;随着温度的升高,相对酶活力显著性下降,在65、75 ℃条件下处理30 min后,几乎无裂解效果。这说明该内溶素高温耐受力较弱,这也与沙门氏菌噬菌体SPN1S内溶素重组蛋白(温度范围25~45 ℃)较为相似 [14]

2.4 重组蛋白LysSTP4的金属离子稳定性

图4离子强度对LysSTP4裂解沙门氏菌活力的影响
Fig.4Effect of iron concentration on the lytic activity of LysSTP4

由图4可知,Zn 2+对LysSTP4的裂解活性有显著的抑制效果(P<0.05);低浓度的Fe 2+能够提高裂解活性,但随着浓度的升高,反而对酶活性产生了抑制效果;低浓度的Ca 2+对酶没有显著的激活或抑制作用,但高浓度的

Ca 2+对内溶素具有显著的抑制效果(P<0.05);低浓度的Mg 2+能够显著提高酶的活性,但是随着Mg 2+浓度的升高,酶活力没有显著的变化。

2.5 重组蛋白LysSTP4的保存稳定性

图5LysSTP4在-80℃保存条件下的残留酶活力
Fig.5Effect of preservation duration on the lytic activity of LysSTP4

将制备的重组蛋白放置于-80℃条件下保存,保存稳定性如图5所示,在低温冷冻保存条件下,虽然LysSTP4的酶活力有显著降低(P<0.05),但在6 个月后仍有高于85%的残留酶活力,说明该内溶素在低温条件下保存不易失活,能够长期保存,这也利于后续的实验研究和应用。

2.6 膜通透剂EDTA与重组蛋白LysSTP4联用裂解活细菌

由图6可知,内溶素LysSTP4单独作用于沙门氏菌时,在初始60 min内有显著性的抑菌效果(P<0.05),但继续培育,沙门氏菌的数量呈现增长的趋势,没有明显的抑菌效果(P>0.05);单独使用EDTA对沙门氏菌有抑菌效果,120 min后,细菌数量由3.4×10 7CFU/mL降低了38.8%;EDTA和内溶素联用对沙门氏菌有显著性的抑菌作用,并随时间的增加,抑菌效果更加显著,120 min后,能将3.6×10 7CFU/mL的细菌有效降低约65.2%,比EDTA单独作用时裂解效果提高了约1倍。研究结果表明,在EDTA的协同作用下,内溶素LysSTP4能够有效地杀灭沙门氏菌。后续研究中可以通过提高LysSTP4的蛋白质含量或改变膜通透剂用量来改善内溶素的抑菌效果。

图6LysSTP4与EDTA联用对细菌的裂解活性影响
Fig.6Lysis activity of LysSTP4for the cells treated by EDTA

由于革兰氏阴性细菌的细胞壁外侧有一层较厚的外膜,阻碍了内溶素作用于细胞壁肽聚糖层。因此,重组内溶素单独作用革兰氏阴性细菌时经常无效 [21]。国内外研究内溶素对革兰氏阴性细菌的作用效果时,通常采用外膜通透剂与内溶素联用策略 [22-23]。外膜通透剂按照它们的化学结构可分为两类,一类为多肽类抗生素,如多黏菌素和其衍生物、聚赖氨酸和氨基糖苷类抗生素,该类物质具有表面活性,含有带阳电荷的游离氨基,能与磷脂中带阴电荷的磷酸根结合,使细菌外膜通透性增加。第二类膜通透剂是以最为常用的EDTA为代表的螯合剂,EDTA能够螯合吸附二价离子,破坏外膜稳定性 [24]。Briers等 [25]将10 mmol/L EDTA与250 μg/mL绿脓假单胞菌噬菌体内溶素协同作用,结果表明,两者能够将10 6CFU/mL绿脓假单胞菌降低4(lg(CFU/mL))。Lim等 [14]将10 mmol/L EDTA与300 μg/mL内溶素联用在2 h内将沙门氏菌的菌落数目由10 6CFU/mL有效降低至10 3CFU/mL。

3 结3 论

目前为止,内溶素的应用主要集中在革兰氏阳性细菌的防治和检测中,革兰氏阴性细菌相关的内溶素研究报道较少,尤其沙门氏菌噬菌体内溶素的研究在国内是空白状态。通过测定LysSTP4对沙门氏菌的裂解效果,得知该沙门氏菌噬菌体内溶素LysSTP4具有生物活性,这也是国内外首例T4型沙门氏菌噬菌体内溶素克隆表达成功。LysSTP4是一种嗜碱性蛋白,在50 ℃条件下30 min仍能保持约60%的活力,并且能够在-80 ℃长期保存,与膜通透剂EDTA协同作用能够有效杀灭沙门氏菌。这些特性表明,LysSTP4内溶素具有成为新型抗菌物质的潜力。这些研究结果也为利用内溶素防控耐药性沙门氏菌提供了理论基础和技术指导。

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Characterization of Recombinant Endolysin from a Salmonella-Infecting Bacteriophage STP4-a

LIN Hong,LI Meng,WANG Jingxue*
(College of Food Science and Engineering,Ocean University of China,Qingdao266003,China)

Abstract:In the present study, the recombinant endolysin from Salmonella-infecting bacteriophase STP4-a was characterized for its biochemical properties such as pH, temperature and iron concentration by the plate diffusion a n d turbidity methods. The results showed that the endolysin was stable over broad pH and temperature ranges and was active from pH 5.0 to 10 and from 30 to 50 ℃. After 6 months of storage at - 80 ℃, the activity of endolysin retained 85% of the original level. Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) was used to increase outer membrane permeability, and it greatly enhanced the lytic activity of STP4-a endolysin.

Key words:Salmonella; lytic bacteriophage; endolysin

中图分类号:TS254.5

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2015)05-0104-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201505020

收稿日期:2014-05-07

基金项目:“十二五”国家科技支撑计划项目(2012BAD28B05)

作者简介:林洪(1962—),男,教授,博士,研究方向为食品安全与质量控制技术。E-mail:linhong@ouc.edu.cn

*通信作者:王静雪(1976—),女,副教授,博士,研究方向为食品安全。E-mail:snow@ouc.eud.cn