海参体壁中α-1,4淀粉酶的分离纯化及性质

张杰,张永勤*,罗彩华,刘征东,程袁芬,卢菲菲,张童

(青岛科技大学化工学院,山东青岛266042)

摘要:通过采用匀浆、硫酸铵盐析、透析、DEAE-52阴离子交换层析、Sephacryl S-300凝胶层析等方法从海参体壁中分离纯化并得到了α-1,4淀粉酶。结果表明,该酶具有3条亚基链,分子质量约为420kD;最适pH值为9.0,最适温度为80℃,90℃条件下保温30min后仍有38%以上的相对酶活性,因此,该酶是一种具有较高热稳定性的碱性高温淀粉酶。K +、Fe 3+和Mn 2+对其有较强的抑制作用,Cu 2+和Ca 2+对其有较强的激活作用。

关键词:海参;自溶;淀粉酶;分离;纯化;热稳定性

α-1,4淀粉酶(1,4-α-D-葡萄糖苷水解酶,EC3.2.1.1)是以淀粉为底物,从淀粉糖链内部水解1,4-α-D-葡萄糖苷键的一类酶。该酶广泛存在于微生物 [1-2]、植物 [3]及动物的消化体系 [4-6]中。

海参是一种具有重要经济价值的水产品,随着消费者对其营养价值的逐步认识以及产业化规模的日益扩大,70多个国家投入到海参产业 [7]。迄今为止海参产品主要仍是以干制海参为主,即食产品的保藏问题始终是困扰业界的技术难题。因海参在贮存及加工过程中,会发生自溶现象 [8],甚至在经过高温热力处理之后仍难避免。所以,对海参体壁热稳定性酶的探寻及其与自溶相关性的研究一直是近几年来的热点问题。

目前所发现并研究的与海参相关的酶大部分集中在海参内脏,特别是消化道 [9-12]中,而针对海参体壁的酶系研究较少,仅报道了海参体内几种蛋白酶 [13-14]及酸性磷酸酶 [15]等,关于海参体壁中α-1,4淀粉酶的研究在国内外尚未见报道。本实验分离纯化了海参体壁中的α-1,4淀粉酶,并对酶学性质进行了探讨,以期对海参生理生化特性研究以及防止海参自溶提供相关理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

海参青岛台东水产品批发市场。

可溶性淀粉国药集团化学试剂有限公司;3-甲基-2-苯并噻唑酮腙(3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone hydrochloride hydrate,MBTH)、二硫苏糖醇(DL-dithiothreitol,DTT)美国Sigma公司;蛋白质分子质量Marker日本TaKaRa公司。

1.2 仪器与设备

SHZ-82恒温水浴振荡器国华电器有限公司;UNICO-2100紫外-可见分光光度计尤尼柯(上海)仪器有限公司;层析设备上海沪西分析仪器厂有限公司;电泳仪北京六一仪器厂;pH计梅特勒-托利多(上海)仪器有限公司;移液枪赛默飞世尔(上海)仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 粗酶液制备

取新鲜海参,除内脏,将体壁用蒸馏水清洗,按照质量体积比1∶3(m/V)与醋酸-醋酸钠缓冲液(0.05mol/L,pH5.0)混合并匀浆后,静置过夜,6640×g离心15min,取上清液加入硫酸铵至80%饱和度,静置4h,离心后将沉淀溶于0.02mol/L,NaH 2PO 4-Na 2HPO 4缓冲液(pH7.4),并用该缓冲液透析后即得粗酶液。以上操作均在4℃条件下完成。

1.3.2 酶活力测定

根据文献[16]的方法,稍加修改。具体操作如下:取0.25mL酶液与0.25mL底物(质量浓度为1mg/mL淀粉溶液)预热后混合,在设定温度条件下酶解一段时间后,加入0.5mL0.5mol/L NaOH溶液终止反应,再加入0.5mL MBTH试剂(3mg/mL MBTH溶液和1mg/mL DTT溶液等量混合,现用现配),充分混合,于80℃条件下水浴加热15min后,立即加入1mL硫酸铁铵试剂(0.5g/100mL FeNH 4(SO 42·12H 2O、0.5g/100mL氨基磺酸、0.5mol/L盐酸),室温下放置1h,然后于630nm波长处测定吸光度。空白对照组为0.25mL酶液与0.25mL底物溶液分别加热,与反应组加热相同时间后,按照酶、NaOH、底物的顺序与0.5mL0.5mol/L NaOH溶液混合,测定同上。每组作3个平行样。

酶活力单位(U)定义:在上述反应条件下,以每分钟水解底物释放出相当于1μg葡萄糖所需的酶量为1个酶活力单位。

1.3.3 蛋白质含量测定

采用Lowry法 [17],以牛血清白蛋白作标准蛋白,测定酶液中蛋白质的含量。层析时所测蛋白质含量采用紫外分光光度法 [18]

1.3.4 海参体壁中α-1,4淀粉酶的纯化

用0.02mol/L,NaH 2PO 4-Na 2HPO 4缓冲液(pH7.4)平衡DEAE-52柱(Φ2.0cm×15cm),取粗酶液上样,用分别含0.3、0.4、0.6、2mol/L NaCl的平衡缓冲液进行阶段式洗脱。洗脱流速为1.5mL/min,用自动部分收集器收集,每管6mL,于280nm波长处测定吸光度,绘制洗脱曲线,将活性高的样品合并,用聚乙二醇-20000浓缩,得样品A;用0.02mol/L,NaH 2PO 4-Na 2HPO 4缓冲液(pH7.4)平衡Sephacryl S-300HR柱(Φ1.0cm×76cm),将A样品上柱,洗脱流速为0.25mL/min,分步收集,每管2mL,于280nm波长处测定吸光度,绘制洗脱曲线,将活性部分收集,4℃保存备用。

1.4 酶学性质研究

1.4.1 pH值对酶活力的影响

分别用0.2mol/L不同pH值的缓冲溶液来配制1mg/mL淀粉溶液。其中,pH3.0~8.0的缓冲溶液用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲体系,pH8.5~10.0用Gly-NaOH缓冲体系。取0.25mL经纯化后的酶液与0.25mL按上述条件配制的淀粉溶液充分混合,按照1.3.2节测定酶活力,其中温度为50℃,时间为1h。

1.4.2 温度对酶活力的影响

取0.25mL经纯化后的酶液与0.25mL1mg/mL淀粉溶液(用0.2mol/L,pH9.0Gly-NaOH缓冲溶液配制)充分混合,按照1.3.2节测定酶活力。其中温度分别为30、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90℃,时间为30min。

1.4.3 热稳定性测定

用0.2mol/L,pH9.0Gly-NaOH缓冲溶液配制1mg/mL淀粉溶液,将纯酶液分别在30、40、50、60、70、80、90℃条件下加热30min以后,取出并放在冰浴中迅速冷却。取0.25mL经加热后的纯酶液与0.25mL底物溶液充分混合,按照1.3.2节测定酶活力,其中温度为50℃,时间为1h。

1.4.4 金属离子对酶活力的影响

用0.2mol/L、pH9.0Gly-NaOH缓冲溶液配制1mg/mL淀粉溶液,分别加入终浓度为10mmol/L的CaCl 2、MgCl 2、KCl、FeCl 3、BaCl 2、CaCl 2、ZnCl 2、CuSO 4、MgCl 2和MnCl 2,终浓度为5mmol/L的乙二胺四乙酸二钠(ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt,EDTA-2Na)。取0.25mL经纯化的酶液与0.25mL底物溶液充分混合,按照1.3.2节测定酶活力,其中温度为50℃,时间为1h。

1.5 酶的分子质量测定

根据Laemmli的方法 [19],采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)。电泳中使用6%的分离胶,3%的浓缩胶,90V恒压电泳。分子质量标准的范围为44.3~200kD。样品的分子质量可以根据公式来计算。

式中:M r为分子质量/kD;K和K 1为常数;Rf是相对迁移率。

2 结果与分析

2.1 海参体壁中α-1,4淀粉酶的分离纯化

DEAE-52阴离子交换层析结果见图1,用分别含0.3、0.4、0.6、2mol/L NaCl的NaH 2PO 4-Na 2HPO 4缓冲液进行洗脱。发现4个蛋白质洗脱峰,其中峰1具有明显的α-1,4淀粉酶活性,其余3个蛋白质峰同样具有α-1,4淀粉酶活性,但是总蛋白质质量不高。凝胶层析结果见图2,将阴离子交换层析洗脱峰1收集,经浓缩后,进行Sephacryl S-300柱层析,得到3个蛋白质峰,其中峰1具有明显的α-1,4淀粉酶活性。收集此组分,做纯度检验和酶学性质研究。整个纯化过程及结果见表1。

图1 1α-1,4淀粉酶离子交换层析及其各组分的酶活力
Fig.1Ion exchange chromatography and activity assay ofα-1,4-amylase

图2Sephacryl S-300凝胶层析及其各组分的酶活力
Fig.2Sephacryl S-300gel filtration chromatography and activity assay ofα-1,4-amylase

表1 1α-1,4淀粉酶纯化过程及结果
Table1Purification process of sofα-1,4-amylase

酶活力回收率/%粗酶472.043012.706.381100硫酸铵沉淀159.872673.1416.722.6288.73 EDAE-5253.411512.7128.324.4450.21 Sephacryl S-3002.96348.01117.5518.4211.55纯化步骤总蛋白质质量/mg总酶活力/U酶比活力/(U/mg)纯化倍数

2.2 pH值对α-1,4淀粉酶酶活力的影响

图3pH值对pHα-1,4淀粉酶酶活力的影响
Fig.3Effect of pH onα-1,4-amylase activity

由图3可知,该淀粉酶在pH3.0~5.5之间,基本不显示活力;在pH6.0~8.0之间,保持平稳的较低酶活力;其最适pH值为9.0,在高于或者低于pH9.0时,该淀粉酶活力明显下降。通过了解该淀粉酶的最适pH值,对于控制该酶活性具有一定的指导作用,进而为海参自溶机理的研究提供了理论依据。

图4温度对α-1,4淀粉酶活性的影响
Fig.4Effect of temperature onα-1,4-amylase activity

2.3 温度对α-1,4淀粉酶酶活力的影响由图4可知,该淀粉酶的最适温度为80℃,当温度低于80℃时,α-1,4淀粉酶活力随着温度的升高逐渐升高;当温度在80~90℃之间时,酶仍然保持一个较高的活力。由此,可认为该淀粉酶属于高温淀粉酶。

2.4 α-1,4淀粉酶的热稳定性

图55α-1,4淀粉酶的热稳定性
Fig.5Thermal stability ofα-1,4-amylase

将该淀粉酶液分别在不同温度下保温30min后,在50℃和80℃条件下分别测酶活力,结果如图5所示。在80℃条件下测定酶活力时,随着保温温度的升高,酶活力下降比较迅速,在80~90℃时,相对酶活力比较稳定,约为44%;在50℃条件下测定酶活力时,随着保温温度的升高,酶活力下降平缓,当达到90℃时,其相对酶活力为38%。在50℃和最适温度80℃条件下测定α-1,4淀粉酶的热稳定性实验结果相差不大,其相对酶活力下降趋势基本保持一致,说明高温条件下的酶解过程对酶的热稳定性影响不大。

朱蓓薇等 [13-15]报道的海参体壁中发现的磷酸激酶、组织蛋白酶、类半胱氨酸蛋白酶均具有一定的热稳定性,其中后者的热稳定性最高,80℃保温后约有25%左右的残留酶活性。而本实验所述的在海参体壁中发现的α-1,4淀粉酶在90℃加热灭活30min后仍然有38%以上的相对酶活力,说明该酶具有较高的热稳定性。

高温处理海参体壁的原理之一在于高温使酶蛋白变性而丧失催化活性,从而达到即食海参的保藏目的。然而,在90℃加热30min以后,该淀粉酶仍然具有很高的残留酶活力。这一较强的热稳定性内源酶很可能是导致海参在加工过程中自溶的重要原因之一,但是若在海参加工过程中只是加大热力程度达到灭酶的目的又会导致海参体壁过分失水而影响其商业价值,因此,有必要考察其他因子对该酶活力的影响。

2.5 金属离子对α-1,4淀粉酶酶活力的影响由表2可知,Ba 2+、K +、Fe 3+、Mn 2+对该淀粉酶具有抑制作用,其中Mn 2+抑制效果最强,能够抑制60%的酶活性,与对照组相比Ba 2+、K +、Fe 3+组的相对酶活力分别为90%、65%和73%,在海参加工过程中适当的加入一些

表2金属离子对α-1,4淀粉酶酶活力的影响
Table2Effects of metal ions on sonα-1,4-amylase activity vity

金属离子浓度/(mmol/L)相对酶活力/%对照100 Ba 2+1090 K +1065 Ca 2+10164 Mn 2+1040 Fe 3+1073 Mg 2+10120 Cu 2+10189 EDTA586

Mn 2+、Fe 3+可能有利于防止海参自溶。Mg 2+、Ca 2+和Cu 2+

对该淀粉酶具有一定的激活作用,与对照组相比,其测得的相对酶活力分别为120%、164%和189%。而EDTA组与对照组相比,其相对酶活力为86%,因此可以初步判定该酶为一种金属酶。

2.6 SDS-PAGE电泳分析

图6SDS-PAGE凝胶层析电泳结果
Fig.6SDS-PAGE of the purifiedα-1,4-amylase

由图6可知,通过样品缓冲液中添加β-巯基乙醇和未添加β-巯基乙醇组的对照,推断该α-1,4淀粉酶可能由3个亚基组成,亚基之间通过二硫键相连;而经凝胶层析纯化后酶的电泳结果为一个条带,达到了电泳纯。根据Laemmli的理论计算3条亚基分子质量分别为99.3、122.5、198.2kD,因此,推定该淀粉酶分子质量约为420kD。

大多数蛋白质在50℃或更高温度下,会发生变形而导致失活。但是蛋白质中的肽链之间的结合因二硫键的存在而更加紧密,有研究认为二硫键能够稳定蛋白质空间构象,对于蛋白质(或酶)的热稳定性具有重要意义 [20]。因为纯化得到的淀粉酶是一种多亚基蛋白,亚基之间存在二硫键,因此,可以推断该酶具有的良好热稳定性,这与分子中的二硫键有很大关系。

3 结论

将粗酶中的淀粉酶经过DEAE-52阴离子交换层析和Sephacryl S-300凝胶层析后得到了纯化了18.42倍的α-1,4淀粉酶,通过SDS-PAGE电泳发现该酶具有3个亚基链,分子质量分别为99.3、122.5kD和198.2kD。对该淀粉酶进行部分特性研究发现,该酶的最适pH值为9.0,最适温度为80℃,是一种高温淀粉酶,并且具有较强的热稳定性。K +、Fe 3+和Mn 2+对酶活力有较强的抑制作用,而Cu 2+和Ca 2+对其有较强的激活作用。该酶具有高热稳定性的特点与即食海参体壁自溶相关性的研究,尚有待进一步实验证实。

参考文献:

[1]SIVARAMAKRISHNAN S,GANGADHARAN D,NAMPOOTHIRI K M,et al. α-Amylases from microbial sources-an overview on recent developments[J].Food Technology Biotechnology,2006,44(2):173-184.

[2]PANDEY A,NIGAM P,SOCCOL C R,et al.Advances in microbial amylases[J].Biotechnology and Applied Biochemistry,2000,31(2):135-152.

[3]ZEEMAN S C,KOSSMANN J,SMITH A M.Starch:its metabolism,evolution,and biotechnological modification in plants[J].Annual Review of Plant Biology,2010,61:209-234.

[4]TESTER R F,KARKALAS J,QI X.Starch structure and digestibility enzyme-substrate relationship[J].World’s Poultry Science Journal,2004,60(2):186-195.

[5]唐黎,姜海波,陈骏驰,等.水产动物消化酶的研究概况[J/OL].中国科技论文在线,http://www.paper.edu.cn/html/releasepaper/2005/11/520/,2005.

[6]姚雪梅,王珺,贝荣丙,等.不同pH对糙海参消化酶活性的影响[J].海南大学学报:自然科学版,2006,24(4):389-394.

[7]PURCELL S W,MERCIER A,CONAND C,et al.Sea cucumber fisheries:global analysis of stocks,management measures and drivers of overfishing[J].Fish and Fisheries,2013,14(1):34-59.

[8]ZHU Beiwei,ZHENG Jie,ZHANG Zongshen,et al.Autophagy plays a potential role in the process of sea cucumber body wall“melting”induced by UV irradiation[J].Wuhan University Journal of Natural Sciences,2008,13(2):232-238.

[9]FU Xueyan,XUE Changhu,MIAO Benchun,et al.Characterization of proteases from the digestive tract of sea cucumber(Stichopus japonicus):high alkaline protease activity[J].Aquaculture,2005,246(1/4):321-329.

[10]SUN Liming,ZHU Beiwei,WU Haitao,et al.Purification and characterization of cathepsin B from the gut of the sea cucumber(Stichopus japonicas)[J].Fish Physiology and Biochemistry,2011,20(4):919-925.

[11]ZHU Beiwei,ZHAO Jungang,YANG Jingfeng,et al.Purification and partial characterization of a novelβ-1,3-glucanase from the gut of sea cucumber Stichopus japonicus[J].Process Biochemistry,2008,43(10):1102-1106.

[12]WU Haitao,LI Dongmei,ZHU Beiwei,et al.Purification and characterization of alkaline phosphatase from the gut of sea cucumber Stichopus japonicus[J].Fisheries Science,2013,79(3):477-485.

[13]ZHU Beiwei,ZHAO Lulu,SUN Liming,et al.Purification and characterization of a cathepsin L-like enzyme from the body wall of the sea cucumber Stichopus japonicus[J].Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry,2008,72(6):1430-1437.

[14]QI H,DONG Xiuping,CONG Lina,et al.Purification and characterization of a cysteine-like protease from the body wall of the sea cucumber Stichopus japonicus[J].Fish Physiology and Biochemistry,2007,33(2):181-188.

[15]ZHU Beiwei,YU Jianwei,ZHANG Zongshen,et al.Purification and partial characterization of an acid phosphatase from the body wall of sea cucumber Stichopus japonicus[J].Process Biochemistry,2009,44(8):875-879.

[16]张永勤,王斐,曾凡伟,等.微量测定木聚糖酶活力的方法:MBTH法[J].食品科学,2012,33(3):43-47.

[17]LOWRY O H,ROSEBROUGH N J,FARR A L,et al.Protein measurement with the Folin phenol reagent[J].Journal of Biological Chemistry,1951,193(1):265-275.

[18]MURPHY J B,KIES M W.Note on spectrophotometric determination of proteins in dilute solutions[J].Biochimica et Biophysica Acta,1960,45:382-384.

[19]LAEMMLI K U.Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4[J].Nature,1970,227:680-685.[20]BEEBY M,O’CONNOR B D,RYTTERSGAARD C,et al.The genomics of disulfide bonding and protein stabilization in thermophiles[J].PLoS Biology,2005,3(9):1549-1558.

Purification and Characterization ofα-1,4-Amylase in Body Wall of Sea Cucumber

ZHANG Jie,ZHANG Yongqin *,LUO Caihua,LIU Zhengdong,CHENG Yuanfen,LU Feifei,ZHANG Tong
(College of Chemical Engineering,Qingdao University of Science and Technology,Qingdao266042,China)

Abstract:α-1,4-Amylase was extracted and isolated from the body wall of sea cucumber by homogenization,salting out with ammonium sulfate,dialysis,DEAE-52anion exchange chromatography and Sephacryl S-300gel chromatography sequentially.The results showed that the purified enzyme had three subunit chains according to the SDS-PAGE,with molecular weight of420kD;the optimum pH and temperature were9.0and80℃;and the residual activity remained at least38%after inactivation at90℃for30min.Therefore,this enzyme is a thermostable alkaline amylase.This amylase could be strongly activated by K +,Fe 3+or Mn 2+and inhibited by Cu 2+or Ca 2+.

Key words:sea cucum ber;autolysis;amylase;isolation;purification;thermostability

中图分类号:TS254.9

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2015)05-0137-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201505026

收稿日期:2014-03-14

基金项目:山东省自然科学基金项目(ZR2013CM027)

作者简介:张杰(1987—),男,硕士,研究方向为酶工程、生化分析。E-mail:piccolo-3127@163.com

*通信作者:张永勤(1965—),女,教授,博士,研究方向为酶工程、生化分析。E-mail:zyq0205@qust.edu.cn