荧光纳米材料应用于蛋白质分析的研究进展

王琪,王蓓蓓,马美湖,蔡朝霞*

(国家蛋品加工技术研发分中心,华中农业大学食品科学技术学院,湖北武汉430070)

摘要:蛋白质与人体新陈代谢、免疫应答和疾病发生等密切相关,因此对蛋白质研究是当今世界共同关注的热点,目前已经渗透到生物、医学、食品等各个领域。纳米技术的发展极大地促进了蛋白质技术的研究,发展光学特性优良、生物相容性好的功能化荧光纳米材料对深入研究蛋白质的标记、分析以及分离具有非常重要的意义。本文主要介绍了半导体量子点、嵌入式核壳荧光纳米颗粒、碳点、碳纳米管、贵金属元素纳米簇和磁性荧光纳米颗粒等荧光纳米材料的基本性质,以及各种荧光纳米材料在蛋白质标记成像、蛋白质相互作用、蛋白质固定与分离以及蛋白质分析检测方面的应用。

关键词:荧光;纳米材料;蛋白质;应用

蛋白质是构成生命体的基础物质,在生物体内起着重要作用,参与几乎所有的生命活动,如催化生命 体内各种反应进行、调节代谢、抵御外来物质入侵及控制遗传信息等 [1]。蛋白质与人体的新陈代谢、免疫应答反应和疾病的发生等都有密切的关系。因此,蛋白质研究在食品检验、临床检验和疾病诊断等方面都具有重要意义。

目前,多种方法已被用于蛋白质研究方面。随着纳米科学技术的发展,纳米材料也越来越多被用在蛋白质的研究领域。荧光纳米材料由于其独特的结构,具有一些不同于常规材料和单个分子的特殊性质,尤其是特殊的荧光性质,使其在光学、生物和医药等诸多方面有重要的应用价值 [2]。本文重点对多种荧光纳米材料在蛋白质研究方面的进展进行综述,总结了目前用于蛋白质研究的主要纳米材料的特点及其在蛋白质标记成像、相互作用、固定与分离以及痕量分析检测方面的基本应用。

1 用于蛋白质研究的常见荧光纳米材料

1.1 荧光纳米材料的基本性质

纳米材料,是指在三维空间中至少有一维处于纳米尺度范围(<100nm)或由该尺度范围的物质作为基本单元构成的材料。纳米材料的特殊结构,使其具有不同于常规材料和单个分子的一些特性,主要包括比表面积大、高化学活性、特殊的光、电、磁性质等 [3]。而荧光纳米材料,由于其特殊的结构与光学特性,为化学、物理、医学和生物领域的发展带来了新的机遇。

传统的荧光材料激发光谱较窄,荧光特征谱较宽且分布不对称,光解产物可能对生物体产生杀伤作用。并且由于其本身性质,存在光稳定性差,容易被光漂白等缺陷。另外,作为荧光探针,传统荧光材料存在分析灵敏度低、亲水性差等缺陷 [4],限制了其在生物、医学等许多方面的应用。而荧光纳米材料不仅具有较高的荧光强度和优越的光稳定性,而且可以通过控制合成条件,使一些结构特殊的荧光纳米材料具有尺寸依赖的光学特征,有利于蛋白质的同步分析 [5];当纳米材料的发光达到近红外光谱范围时,应用于生物样品分析时,检测背景干扰小 [6];另外,利用具有特殊磁性的纳米材料,可以实现复杂背景的分离工作等。

1.2 用于蛋白质研究的荧光纳米材料

1.2.1 半导体量子点

量子点是主要由Ⅱ~Ⅵ族及Ⅲ~Ⅴ族元素构成的半导体纳米颗粒。量子点在研究蛋白质方面具有许多优势。首先,可以用同一激发波长的光源同时激发多种不同荧光的量子点,并且由于其发射谱带窄而对称,多种颜色的发射峰不易出现重叠与红移拖尾,荧光光谱易于区分和识别 [7]。另外,量子点的斯托克斯位移较大,可以有效避免激发峰与发射峰的重叠,减少干扰。此外,量子点的光学特征可以通过控制反应条件有效控制 [8]。图1即显示了同一激发波长下的多色CdSe量子点。量子点荧光可调的光学特征为蛋白质多色标记及同步检测奠定了基础。近年来,金属掺杂型量子点成为了人们广泛研究的新课题。在量子点中掺杂微量金属元素可以改变或者增加其发射中心的数量。其中,锰掺杂型量子点被研究最多,因为锰具有独特的磁性能和光学性能从而能够提供很好的掺杂系统 [9]。金属掺杂型量子点基本上保留了量子点的所有优点,另外,还可以避免由于斯托克斯位移引起的荧光自猝灭问题,荧光寿命更长 [10]

图1 ZnS包被的CdSe量子点在近紫外灯下的10种不同颜色的发射光 [11]11
Fig.1Ten distinguishable emission colors of ZnS-capped CdSe QDs excited with a near-UV lamp [11]

从左到右其发射峰依次位于443、473、481、500、518、543、565、587、610、655nm。

1.2.2 嵌入式核壳荧光纳米颗粒

嵌入式核壳荧光纳米颗粒是指一些负载有机荧光染料分子的无机纳米颗粒或多聚生物大分子包被型纳米颗粒 [12]。这种材料在蛋白质标记成像中有固有优点。首先,纳米颗粒对内部所包裹的荧光染料有保护作用,使其荧光稳定性增强,可以克服外界环境对荧光材料的影响 [13]。其次,一个纳米颗粒内所包裹的荧光分子往往多达几千甚至几万个,因此,更多的荧光分子可以连接在生物分子上,当产生信号响应时,很多荧光分子同时产生荧光信号,起到了信号放大的作用,从而提高检测灵敏度 [14]。但这种纳米颗粒存在内部有机染料可能泄露的缺陷。在众多嵌入式核壳荧光纳米颗粒中,基于二氧化硅的纳米颗粒由于其良好的生物修饰性、生物亲和性和检测灵敏度,近些年来发展迅速,并且逐渐扩展应用到生物分析的多个领域。

1.2.3 碳点

碳点是一种近似球型且直径小于10nm的零维半导体纳米晶体,是由极少分子或是原子组成的纳米团簇 [15]。荧光性能是碳点最突出的性能,碳点具有荧光稳定性高、荧光波长可调、抗光漂白能力强、激发光宽且连续、能够实现一元激发、多元发射等特点 [16]

制备碳点的碳源来源丰富且价廉、毒性低,常用的有蜡烛灰、天然气燃烧产生的烟灰、活性炭、西瓜皮、柠檬酸等。利用碳点表面的—NH 2和—OH,在碳点表面接上对生物分子有特异性识别作用的核酸适体或分子印迹聚合物,可提高分析的灵敏度和选择性 [17]。在蛋白质研究中,碳点通过与蛋白质的作用,改变了表面电子空穴对之间的复合效率,从而发生荧光的增强或猝灭,实现对蛋白质的标记和分析。

1.2.4 碳纳米管

碳纳米管是由单层或多层类似六边形网格结构的石墨烯片卷曲而成的中空纳米管状物。碳纳米管的管径通常为几埃到几十纳米,长却可以达到几十微米到几毫米。多壁碳纳米管每层之间保持着固定的距离,约为0.34nm [18]

O’Connell等 [19]研究发现,单根分散的单壁碳纳米管能够在近红外波段吸收光子并发出荧光。碳纳米管发射的荧光是由于其表面存在较多缺陷,可以捕获激发光的能量,属于能带间隙的光致发光。碳纳米管的长度越短,发光强度越大,原因在于长度越短,缺陷越多,其最低空轨道和最高占有轨道之间的能隙增大,捕获激发光的能量增强,因而发射的荧光也随之增强 [20]。但是由于碳纳米管具有巨大的相对分子质量和很强的管间作用,容易团聚而导致荧光猝灭,且很难分散于水和其他溶剂中,这在一定程度上的限制了碳纳米管的应用。因此,碳纳米管的功能化修饰是目前碳纳米管研究领域中的一个重要方向 [21]。碳纳米管在蛋白质研究领域的应用在国内并不常见,在国外主要集中在蛋白质标记成像方面。

1.2.5 贵金属元素纳米簇

贵金属元素纳米簇的尺寸通常小于2nm,具有强的可见-近红外荧光。同其他荧光纳米材料相比,贵金属元素纳米簇更加稳定,分散性更好。近几年来,贵金属纳米簇分子桥的研究是一大热点。在过去的研究里,分子桥通常需要氨基或巯基进行连接,但是合成含有氨基或巯基的分子通常需要复杂的步骤。Komoto等 [22]利用芳基碘化物作为金纳米簇的连接分子,连接电极,构成分子桥,研究了其导电性质。由于金属纳米簇的低毒性,近红外光谱特征,超小尺寸及优良的荧光性质,它们已广泛用于蛋白质检测、标记成像及蛋白质间相互作用的研究领域。

1.2.6 磁性荧光纳米颗粒

磁性荧光纳米颗粒是一种结合了磁性和发光性能的纳米材料。磁性荧光纳米材料集合了磁性纳米颗粒的快速磁响应性以及荧光材料的光致发光能力,在分离的同时还能进行光学检测。陈顺等 [23]利用Fe 3O 4磁性纳米粒子和量子点的结合,制备了具有荧光性质的磁性纳米颗粒。采用表面活性剂修饰Fe 3O 4磁性纳米粒子,经质子化后,Fe 3O 4磁性纳米粒子表面披覆大量正电荷,与表面带负电荷的核壳CdSe/CdS/ZnS量子点通过强烈的静电作用发生组装,得到兼具磁性和荧光性能的磁性荧光纳米材料。Sathe等 [24]将Fe 3O 4和量子点包覆在硅壳内,将合成的具有磁性的红色量子点和没有磁性的绿色量子点混合在一起,外加磁场并用蒸馏水冲洗,于荧光显微镜下观察,没有磁性的绿色量子点消失,视野中只剩下带有磁性的红色量子点。基于这种方法可以设计蛋白质的快速分离。

从表1中可以看出,以上6种荧光纳米材料的特点与特征、常见的表面功能修饰基团以及其可以再蛋白质研究方面的应用领域。

表1 各种荧光纳米材料的特点、常见的表面功能修饰以及其在蛋白质研究方面的应用
Table1Characteristics and functional surface modification of fluorescence nanomaterials,and their applications in protein research

荧光纳米材料特点常见功能修饰在蛋白质研究方面的应用分析检测、蛋白质相互作用、多色标记成像等多个方面,应用最为广泛嵌入式核壳荧光纳米颗粒半导体量子点尺寸依赖性,荧光光谱可调;但由于其中的Cd等重金属,存在一定毒性SiO 2层、巯基乙酸、巯基丙酸荧光稳定性强,荧光强度高;但内部有机染料存在泄露的可能SiO 2层、聚乙二醇、—NH、—OH、—COOH标记成像碳点无毒性,制备材料来源丰富且价廉表面存在—NH和—OH基团,生物相容性良好标记成像、分析检测碳纳米管吸附能力强;但表面惰性强,易团聚—OH、—COOH、羰基近红外标记成像贵金属元素纳米簇较为昂贵SiO 2层近红外标记成像、分析检测、蛋白质相互作用磁性荧光纳米颗粒低毒性,超小尺寸;但制备材料兼具磁性和荧光性能,在分离同时可以进行荧光检测Si层蛋白质固定与分离

2 荧光纳米材料在蛋白质分析中的应用

2.1 蛋白质标记成像

2.1.1 荧光纳米材料标记蛋白质的原理与条件

传统染料分子在进行活体荧光成像时,会在体内循环而导致被测活体全身均有荧光,使得背景信号高,干扰作用强,靶向性差。而荧光特性良好的纳米材料可以实现特异性地标记蛋白质。为了能与蛋白质相连,必须对纳米材料的表面进行亲水性修饰。以半导体纳米晶体为例,目前主要采用两种方法实现纳米材料表面的功能化。一种是利用纳米晶体表面的元素如Zn、Cd等与巯基之间强络合作用,使半导体纳米晶体与巯基酸络合带上羧基,实现亲水功能化 [25]。另一种是将半导体纳米晶体的表面包覆一层亲水层的无机物,然后在表面修饰可与生物材料连接的官能团,从而实现蛋白质的标记 [26]。但对半导体纳米晶体表面包覆一层物质,发光强度往往会下降,并且操作的难度较大。

2.1.2 荧光纳米材料在蛋白质标记成像方面的应用

由于纳米材料生物相容性好、靶向性好、光学特性优良,在荧光成像中得到了广泛应用。量子点最初用于生物领域便是标记简单的生物大分子。2010年,Liu Jian等 [27]利用多色量子点与CD15、CD30、CD45、Pax5这4种蛋白质生物标记物进行结合,根据蛋白质生物标记物与特定蛋白质的特异性相互作用,利用量子点—蛋白质生物标记物可以对B细胞、T细胞以及霍奇金淋巴瘤进行多色成像,实现了多色量子点对蛋白质的同步标记成像。2010年,Li Qin等 [28]将碳点表面钝化,与转铁蛋白进行标记,得到了转铁蛋白共轭的碳点。将蛋白质共轭和未共轭的碳点分别与HeLa细胞共同培养,发现前者标记的细胞荧光明显增强,证明了转运蛋白标记将有利于碳点通过细胞膜,增强其在细胞内的成像作用。与CdSe/ZnS量子点相比,碳点在成像中迁移速度较慢 [29]

Welsher等 [30]利用碳纳米管在近红外区产生的荧光进行细胞成像。碳纳米管与利妥昔单抗偶联,通过抗体与细胞表面进行特异性识别进行成像。Xie Jianping等 [31]于2008年合成了牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)标记的近红外金纳米簇,这种被BSA包被的金纳米簇结合体为贵金属体内成像提供了可能。之后,Wu Xu等 [32]用这种近红外BSA-金纳米簇结合体在裸鼠体内进行成像,发出红色荧光。该荧光光稳定性良好,并且对小鼠没有明显毒性。碳纳米管和金纳米簇这两种方法的突出优势都是利用纳米材料近红外荧光,将材料荧光与背景荧光很好的区分开来,干扰较小。

2.2 蛋白质相互作用的研究

2.2.1 研究蛋白质相互作用的意义及技术方法

蛋白质间相互作用控制着生命的各个过程,是整个生命体结构和生命活动的基础。目前,研究蛋白质相互作用的常规方法主要有化学交联法、免疫共沉淀法、酵母双杂交法和噬菌体展示法等。一些生物物理学方法也逐渐得到应用,有蛋白质荧光共振能量转移技术、绿色荧光蛋白质近似成像技术和质谱等 [33]。随着纳米技术的发展,荧光纳米材料也逐渐应用到了蛋白质相互作用研究中。

2.2.2 荧光纳米材料在蛋白质相互作用方面的应用

在蛋白质相互作用的研究中,荧光共振能量转移技术是一种常用的分析技术。荧光共振能量转移是指运用荧光蛋白、传统有机染料或其他新材料作为能量供体与能量受体,以适当频率的光能照射供体,产生振荡偶极子,与近处的受体探针的偶极子产生共振。这种共振作用会将供体荧光团的能量非放射性地转移到受体荧光团。荧光共振能量转移技术作为一种高效的光学“分子尺”,具有高分辨率、高灵敏度等优点。Wang Shaopeng等 [34]在2002年利用量子点共振能量转移原理,研究了BSA和抗BSA抗体(IgG)的特异性结合。分别用红、绿两种量子点标记BSA和IgG,根据BSA与IgG免疫相互作用,BSA和IgG形成免疫复合物。这种免疫复合物导致红绿量子点之间发生共振能量转移,BSA上的红色量子点的荧光相对增强,IgG上的绿色量子点荧光相对减弱。当免疫复合物中加入BSA时,它就会与量子点-BSA竞争IgG上的结合位点,将量子点-BSA从免疫复合物上取代下来,阻止共振能量转移的发生,荧光恢复。图2显示了荧光共振能量转移导致了荧光变化情况。根据这种技术,可跟踪了解抗原抗体免疫反应的情况。

图2竞争性的BSA结合到免疫复合物形成的荧光共振能量转移体系对
荧光强度的影响 [34]34
Fig.2Effect of competitive BSA binding on fluorescence resonance energy transfer of the immunocomplex [34]

金纳米簇也被报道用在蛋白质相互作用研究上。王丽霞 [35]研究了确定浓度的金纳米簇与胰蛋白酶的相互作用机理。金纳米簇的出现使胰蛋白酶发生自发荧光猝灭,随着金纳米簇浓度的增加胰蛋白酶荧光猝灭增强,利用Stern-Volmer方程确定了猝灭常数以及猝灭机理,推测金纳米簇与胰蛋白酶结合反应的猝灭机理很可能是复合物形成的静态猝灭,而不是发生分子碰撞的动态猝灭,通过计算可以得到金纳米簇-胰蛋白酶体系的结合常数和结合位点数。

2.3 蛋白质固定与分离

功能化的磁性纳米颗粒标记蛋白质时,一方面能够作为载体起到富集与固定的作用;同时,磁性纳米颗粒在外加磁场的作用下,能够快速有效地实现免疫复合物与未结合物的分离。蛋白质与磁性纳米粒子的结合和解离通过蛋白质与磁性纳米粒子表面的电荷来控制,在低pH值条件(pH<pI)下 ,带正电的蛋白质被吸附在带负电的磁性纳米粒子表面;在较高的pH值(pH>pI)下,带负电荷的蛋白质将被排斥离开磁性纳米粒子的表面 [36]。Bucak等 [37]报道了Fe 3O 4磁性纳米粒子用于蛋白质混合物中单一蛋白质的回收和分离。该磁性纳米粒子的吸附容量大,运用高梯度磁性过滤技术,不受其他共存物质的干扰,没有常用离子交换剂的传输阻力,很容易进行蛋白质回收。另外,基于磁性荧光双功能纳米材料在此领域也逐步得到了应用,在实现蛋白质固定的同时可对多种物质进行可视分析检测。王显祥等 [38]用CdTe量子点和超顺磁性纳米Fe 3O 4合成了荧光和磁性双功能亲水复合纳米材料,并在这种复合纳米材料表面固定了葡萄糖氧化酶。基于葡萄糖氧化酶催化葡萄糖产生H 2O 2能够引起量子点荧光的猝灭,实现了对样品中葡萄糖的分离和快速可视化荧光检测。

2.4 快速超灵敏蛋白质分析检测

2.4.1 基于荧光纳米材料自身与蛋白质的相互作用进行检测

蛋白质的痕量分析检测在食品、药物及临床分析中具有重要意义。基于荧光纳米材料与蛋白质的相互作用,利用纳米材料的特殊荧光性质,实现对蛋白质的精确、快速痕量分析。Cai Zhaoxia等 [39-40]基于共振瑞利散射的原理,利用金纳米粒子和掺杂Cd的ZnSe量子点为探针实现了鸡蛋白中溶菌酶的超灵敏分析,检测限可达纳克级别。图3是Cd掺杂ZnSe量子点和溶菌酶作用体系的共振瑞利散射光谱图。当量子点与溶菌酶结合后,由于共振瑞利散射作用,散射强度显著增强,该方法灵敏度高,检测速度快。

图3Cd掺杂的ZnSe量子点和溶菌酶作用系统的RRS光谱RRS [40]40
Fig.3RRS spectra of Cd doped ZnSe QDs and lysozyme systems [40]

2.4.2 基于荧光共振能量转移技术进行检测

基于荧光共振能量转移技术,也可以进行蛋白质的分析检测。由于荧光共振能量转移技术具有光学“分子尺”的作用,故在蛋白质分析检测中具有更高的灵敏度。黄珊等 [41]使用CdSe量子点,基于量子点与蛋白质之间的能量转移,建立了简单快速检测溶菌酶的新方法。该法在0.01~0.8μmol/L的范围内,荧光强度与溶菌酶浓度呈很好的线性关系,检测限为5.2nmol/L。

2.4.3 基于特异性免疫反应进行检测

基于抗原抗体间的免疫反应,可以实现特定蛋白质的定量检测。Xu Bailu等 [42]在2012年以葡萄糖为碳源制备出可溶于水的碳点,再分别用氨基修饰的凝血酶适体TBA 15和TBA 29修饰该碳点和SiO 2纳米颗粒,凝血酶便可与这两者相互作用形成“碳点-凝血酶-SiO 2纳米颗粒”夹层结构,随着凝血酶浓度的增加,碳量子点的荧光强度增加,检测限为1nmol/L。林卉 [43]提出了根据金纳米簇荧光猝灭机理,检测无标记木瓜蛋白酶检测方法。木瓜蛋白酶对包覆在BSA-金纳米簇表面的BSA的降解可引起BSA-金纳米簇的聚集,进而使BSA-金纳米簇的荧光发生猝灭。荧光强度的变化对木瓜蛋白酶的浓度有很好的响应,对木瓜蛋白酶的检测限为0.07μg/mL。Ruan Xiaojuan等 [44]通过ZnSe量子点,根据对牛分支杆菌表面的MPB83蛋白与其抗体之间的特异性免疫反应,实现对MPB83蛋白的痕量分析,为牛分支杆菌的快速检测提供了一种新思路。目前,基于免疫层析技术的量子点试纸条在医学检测方面的研究取得较大进展。郭勤 [45]利用CdTe量子点偶联入葡萄球菌蛋白A,在免疫量子点的基础上,构建了免疫层析试纸条检测抗HIV-1gp41抗体,为荧光纳米材料的商品化、便携化应用奠定了基础。这些方法通过免疫相互作用进行蛋白质测定,其特异性良好,干扰较小,可以方便快捷实现高通量的分析检测。

3 结语

随着科学技术的不断发展,蛋白质研究技术也在不断地发展、进步和完善。荧光纳米材料作为近些年来极具发展潜力的新型材料,以其特殊的光学性质在蛋白质应用研究中显示出独特的优越性。基于多种新型的荧光纳米材料的荧光特性,可用于蛋白质快速分析检测、蛋白质相互作用、蛋白质标记成像等多个方面。磁性荧光纳米颗粒现已有成熟的合成方法,但在蛋白质研究方面应用还不够广泛,基于其良好的荧光性与磁性,未来应用前景也将十分广阔。总之,荧光纳米材料由于其特殊的光学和电学性质,将会在蛋白质领域有着更广泛的应用价值和发展前景,将会应用于蛋白质的各个领域并带来革命性的进步。

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Recent Progress in Fluorescence Nanomaterial Application in the Field of Protein Analysis

WANG Qi,WANG Beibei,MA Meihu,CAI Zhaoxia *
(National Research and Development Center for Egg Processing,College of Food Science and Technology,Huazhong Agricultural University,Wuhan430070,China)

Abstract:Protein plays an important role in human metabol ism,immunity and disease occurrence.At present,proteins have been studied in the fields of biology,medicine,food and others.The technologies used for protein research have become the focus of worldwide attention.Developing functional fluorescent nano-materials with good optical properties and biocompatibility is of great significance for the labeling,analysis and separation of protein.In this paper,the basic properties of fluorescent nano-materials are outlined,such as semiconductor quantum dots,embedded core-shell nanoparticles,carbon dots,carbon nanotubes,precious metal element nano-clusters,and fluorescent magnetic nanoparticles.We also review the applications of these kinds of nano-materials in protein marker imaging,protein interaction,protein immobilization and separation,and protein detection.

Key words:fluorescence;nanometer materials;protein;application

中图分类号:O65

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2015)05-0221-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201505041

收稿日期:2014-05-22

基金项目:国家自然科学基金面上项目(31371810);中央高校基本科研业务费专项资金项目(2013PY036)

作者简介:王琪(1993—),女,硕士研究生,研究方向为食品科学。E-mail:401384873@qq.com

*通信作者:蔡朝霞(1979—),女,副教授,博士,研究方向为食品安全与分析。E-mail:caizhaoxia@mail.hzau.edu.cn