吴 嫚 1，李 森 1，吴淑燕 1，陈国薇 1，刘 芳 2，张 超 1，董庆利 1，刘 箐 1,*
（1.上海理工大学医疗器械与食品学院，上海200093；2.甘肃出入境检验检疫局国际旅行卫生保健中心，甘肃兰州730020）
摘要：菌膜是微生物黏附在介质表面形成的大量细菌群居的一种生存状态，结构致密的菌膜能够使细菌更强地抵御外界的不利环境而生存下来。在食品工业中，菌膜的形成使污染的细菌难以被彻底清除；而在医学领域，由于菌膜对抗生素的耐药性使其成为许多慢性感染性疾病反复发作和难以控制的主要原因之一。本文综合分析了近年来菌膜形成影响因素的研究成果，并对其研究进展及未来发展予以评述。
关键词：食源性致病菌；菌膜；影响因素；食品工业
由食源性疾病引发的食品问题已成为我国目前首要的食品安全问题。2010年7月至2011年7月间，国家食品安全风险评估中心监测了上海等六省急性胃肠炎的发生，结果显示，我国急性胃肠炎的发病率为0.56 次/（人·a），其中由食源性疾病引发的发病率为0.157 次/（人·a），平均每6 个人即有1 人发生食源性疾病 [1]。在世界范围内，目前全球每年因食源性疾病而发病的人数约10亿 人，美国每年约有4 800万 人患病，12.8万 人入院接受治疗 [2]。以上这些数字足以说明食源性疾病已成为严重影响人类健康的常见病。
食源性疾病的致病因子主要有：病毒、细菌、寄生虫、生物毒素和化学物质等，其中，微生物是主要食源性疾病病原。从2006—2010年4 年间，卫生部公布的食物中毒事件中，微生物引起的食物中毒事件占40.09%，患者人数占61.92%，居食品安全事件首位，副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、沙门氏菌（Salmonella）、变形杆菌（Proteus vulgaris）和致泄性大肠埃希氏菌（Escherichia coli）是主要的致病细菌 [3]。这些菌膜菌在形成菌膜后，对各种化学杀菌剂的敏感程度只有浮游菌的1/10～1/1 000，耐热性也相应增加，并且对环境变化不敏感，使感染部位难以得到彻底清除。在食品的加工、运输和贮藏的过程中，致病菌以菌膜形式黏附在固体上使细菌难以清除，导致致病菌的扩散蔓延，是造成食源性致病菌污染的一个重要原因。
菌膜（biofilm，BF）是细菌在生长过程中为了适应生存环境而吸附于惰性物体后形成的一种特殊的复合体，由细菌和自身分泌的多糖、蛋白质等胞外基质组成，是一个三维立体空间结构的生态系 [4]。在菌膜的保护下，细菌可以在紫外线、有毒金属、酸、盐和抗菌剂等多种恶劣的条件下生存，并且还能忍受高浓度的消毒剂和食品防腐剂。在研究中发现，影响菌膜黏附和形成的主要因素包括与细菌接触面的物理化学性质（静电电荷和疏水性）、细菌血清型的多样性、细菌鞭毛的表达、胞外聚合物的组成以及环境条件如pH值、温度和培养基等 [5]。本文将一一对这些因素如何影响菌膜形成展开详细介绍。
菌膜黏附的材质的物理化学性质主要是指其静电荷数和疏水性，不同的材质对细菌菌膜的形成十分重要，会影响菌膜的初始黏附能力，继而导致最终菌膜形成量的差异。
Kennedy等 [6]研究了金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）分别在处理过的组织培养板和未处理的聚苯乙烯培养板上的生长情况，并对菌膜的生成量进行比较，结果发现在处理过的组织培养板上，金黄色葡萄球菌菌膜的形成量会增加很多，未处理的培养板是疏水性的，而经过处理后的培养板具有亲水性并带有负电荷，其原因也许是这种亲水性材料会促进细菌细胞的黏附。在实验室中，测定菌膜最常用的方法之一是96 孔细胞培养板，其材料是疏水性的聚苯乙烯，李琼琼等 [7]发现，通过对聚苯乙烯材料表面进行羊血浆处理或者商品化组织（真空血浆喷雾）处理，使其表面的疏水性降低，可使金黄色葡萄球菌菌膜的生成量显著提高。Nguyen等 [8]研究发现，鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhiumukriunm）比较偏爱不锈钢，而不太适合黏附到有机玻璃表面。Ryu等 [9]则发现不锈钢是适度亲水的，并且表面带负电荷，而聚苯乙烯却是疏水性的。
不锈钢是食品加工最常用的材料，而在食品加工、运输和贮藏的过程中，一旦不锈钢材质的表面不小心被污染了食源性致病菌，等其形成菌膜，就很难彻底地清理干净。因此，食品加工厂在选择食品包装及运输材料时应避免选择不锈钢等亲水性材料，而应多考虑聚苯乙烯及有机玻璃等疏水性材料，或者降低材料表面的亲水性，这样，即使被污染了病原菌，菌膜的形成量很少或生长缓慢处于未成熟阶段便于清理，既保证了食品的安全性，又使厂家避免遭受难以估计的损失。
菌膜的形成受细菌细胞间的群体感应调节的影响，与外部环境的刺激紧密相关，因此，在不同的环境条件下，细菌菌膜的形成方式及其累积量会有所不同 [10]。关于环境条件，本文主要介绍温度、pH值以及培养基的营养成分对菌膜形成的影响。
2.1 温度
在食品加工、运输和贮藏的过程中所涉及的温度范围较广泛，因此，关于温度对菌膜形成影响的研究很有意义。温度是影响菌膜形成的重要因素，在不同的培养温度下，菌膜的形成量表现出较大的变化。李琼琼等 [7]研究了10 株不同来源的金黄色葡萄球菌在不同温度下菌膜的生成量，发现其中3 株在37 ℃时菌膜形成量最大，4 株在42 ℃时菌膜量达到最大，3 株在46 ℃达到最大，1 株菌膜的生成量一直较低，但温度的升高也能刺激菌膜的形成。di Bonaventura等 [11]研究4、12、22、37 ℃温度下单增李斯特菌在聚苯乙烯、玻璃、钢材料表面形成菌膜能力时发现，不管是在哪种材料表面，4 ℃时菌膜生成的量最少。
由此可知，较高的温度有利于菌膜的形成，所以，当环境温度较高时，食品加工厂应当预防细菌生成菌膜而带来的安全隐患。现在大多数低温贮存食品都选择4 ℃，虽然4 ℃也能形成菌膜，但是相对来说该温度形成的菌膜量较少，而且大多数致病菌在4 ℃条件下生长速率缓慢，所以食品加工厂要尽可能的在低温条件下作加工、运输和贮藏食品。
2.2 pH 值
细菌生长环境pH值的不同往往会影响其生长速率和生长量，每种菌都有适于自己生长的pH值条件，一旦过酸或过碱则会给其形成一种不利环境的压迫，细菌为了保护自己则会形成更多的菌膜，因此，找到一个可以把细菌菌膜生长量降到最低的一个pH值是至关重要的。
Nguyen等 [8]通过比较在pH值为6和7的酸性条件下鼠伤寒沙门氏菌菌膜形成量发现，在培养后的前十几小时之内，pH 6的条件下菌膜形成量要比pH 7条件下的形成量要少，因此，猜测培养基的酸度主要影响细菌的初始附着的能力，导致其在较低的pH值条件下菌膜形成能力下降。Tresse等 [12]的研究也有类似的结果，他们发现4 种单核细胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes）株在pH 5条件下黏附聚合物表面的能力比pH值为7时的要差，表明食品保存的条件可能对单增李斯特菌的黏附能力有一定的影响。因此，在食品加工过程中，能够利用低pH值这一有利条件来延误细菌菌膜在惰性表面的形成，将会减少食源性致病菌给人带来的危害。
2.3 培养基营养成分
尽管不同的细菌对营养的需求不同，但培养基中应包含其所需要的营养物质：碳源、氮源、无机盐和生长因子等。经前人的研究发现，不同浓度的糖类和无机盐类会对细菌菌膜的生成量产生一定的影响。
Lim等 [13]对金黄色葡萄球菌进行高盐渗透发现，NaCl的质量分数低于1.6%时，菌膜的形成量按比例升高；在1.6%～5.6%之间时，菌膜生成量达到稳定；而高于5.6%时，则没有发现有菌膜生成。而李琼琼等 [7]的发现却与上述结果有些不同，他们对10 株不同的金黄色葡萄球菌进行研究，在TSB培养基中添加1.0%的NaCl能极显著提高4 株菌菌膜的形成能力，1 株菌株的菌膜形成量下降，而另外5 株菌菌膜的生成量却没什么明显变化，这可能是因为不同的菌株可能涉及不同的菌膜调控模式。尽管不同质量分数的NaCl对不同菌株的影响并没有稳定的结果，但足以证明，不管是高盐还是低盐，一旦促使细菌感到其处于危险或营养贫乏的地步时，细菌就会产生比平常多的菌膜用来抵御这不利的外界环境。食品加工厂可以利用这一点，对相应的食品采取一定的处理措施。
利用生存条件对菌膜形成的影响，在食品工业中可以针对不同特点的食品而使用不同的环境条件来抑制菌膜的形成。某些不会因温度改变而改变性质的食品则可以借助高温来抑制菌膜；而一些食品本身就是酸性物质，则可借助这一点利用pH值来抑制菌膜；有些腌渍食品，则可以利用NaCl来抑制菌膜。
由于抗生素的广泛应用，细菌的耐药性日趋严重，因此，研究细菌菌膜的耐药机制以及发现新的抗生素已经非常紧迫。
有研究发现，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的耐药机制非常复杂，其中菌膜的形成是产生耐药性的重要因素之一，使菌对抗生素和宿主免疫系统具有很强的抵抗力，从而会导致严重的临床问题 [14]。大环内酯类抗生素对铜绿假单胞菌没有抑菌活性，有报道称大环内酯类药物可抑制或损坏多糖蛋白复合物的产生从而增强其他抗生素的杀菌能力 [15-16]。还有研究发现，联合应用罗红霉素能增加铜绿假单胞菌菌膜对头孢噻肟抗生素的敏感性，而单独使用头孢噻肟的结果却没有联合用药组的作用好 [17]。在针对铜绿假单胞菌菌膜则可以使用大环内酯类药物作为辅助抗生素，而对于其他致病菌菌膜的研究则可以借助此方法继续研究其耐药机制，此领域也是近年细菌耐药机制研究的新方向。
菌膜的形成过程一般分为两个阶段：黏附阶段和聚集阶段。在黏附阶段主要是细菌与接触材料间通过物理因素和黏附因子的作用，发生特异性的结合。紧接着进入聚集阶段，在细胞间多糖黏附素（polysaccharide intercellular adhesion，PIA）等的介导下，细菌之间开始相互黏附，继而分化、增殖，形成细胞团块，产生大量的黏液，最后形成了菌膜。
胞间多糖黏附素是细菌菌膜形成过程中必不可少的成分，由ica（intercellular adhesion operon）操纵子控制合成。Chien [18]和Cramton [19]等已发现在金黄色葡萄球菌中ica操纵子的表达受到SarA基因表达的SarA蛋白（一种DNA 结合蛋白）的调控。Valle等 [20]通过实时荧光定量多聚核苷酸链式反应（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）也发现，SarA基因的突变，会致ica操纵子转录的下调，由此认为SarA能够通过提高ica操纵子的转录而促进金黄色葡萄球菌菌膜的形成。Allignet [21]、Conlon [22]等则发现ica操纵子中icaADBC结构基因的表达直接控制PIA的合成，PIA可引起细胞间的黏附，在其他因子的参与下可在接触材料表面形成多层细胞聚集物，无氧条件下可以导致金黄色葡萄球菌ica操纵子的转录和PIA合成的增加，因此，在内部环境中，PIA的表达是控制葡萄球菌感染人体的关键点之一。
群体感应就是细菌能够自发产生、释放某些特定的信号分子，并且能够感知其浓度变化，调节微生物群体行为的调控系统。该系统在菌膜形成过程中主要作用于聚集阶段，细菌在感受到外界不利条件的胁迫后，会通过群体感应系统发出信号，然后细菌开始聚集，并形成菌膜。人们彻底研究的群体感应系统主要包括革兰氏阴性菌体内的酰基高丝酰胺内酯（acyl-homoserine lactones，AHL）系统和革兰氏阳性菌体内的小分子多肽作为信号分子 [23-25]。还有一类AI-2型系统在革兰氏阳性菌和阴性菌中均被发现 [23]。Hentzer等 [26]发现，卤代呋喃酮化合物可以干扰AHL系统，并且通过使用绿色荧光蛋白得出结论：在大多数菌膜细胞中，呋喃酮化合物可以穿透小菌落，阻碍细胞信号和群体感应系统，进而影响生物膜的结构，并增强细菌互相分离的能力。卤代呋喃酮与细菌分泌的自诱导物在结构上相似，故而可以与自诱导物竞争性结合到菌体内或胞膜上的自诱导物受体，并通过影响细菌的密度感应系统而影响菌膜的形成 [27]。
在研究菌膜的过程中，往往会发现一些特殊物质可以影响菌膜的形成，这些物质不是专门抑菌的抗生素，而是一些精油、消毒剂亦或者是一些中药提取物。这些物质的发现，既可以减轻细菌对抗生素的耐药性，也可以在食品加工方面提供更好的细菌清除剂。
Szczepanski等 [28]发现，使用低于精油最小抑菌浓度的量就可以抑制细菌菌膜的形成，而且低浓度的精油还可以抑制使特定食品变质的细菌的活性。而Jadhav等 [29]则发现蓍草精油可以抑制李斯特菌细胞黏附材料表面的初始附着力。Taweechaisupapong等 [30]则认为精油这些疏水性化合物有抗菌活性，主 要是因为它能破坏细菌的细胞膜，然后导致过度的细胞渗透性。因此，精油或者其成分，可能是发展新消毒剂有用的添加剂，这些消毒剂则可以应用到食品工业中。
Elexson等 [31]研究了消毒剂对耐抗生素的副溶血性弧菌菌膜的影响，发现普通的洗涤剂对该菌株有抗菌活性，只是消毒剂的类型、浓度、曝光时间、菌膜的生长时间以及机械损伤这些因素都在影响消毒剂对菌膜的清除能力。Borges等 [32]则研究了异硫氰酸酯对菌膜的影响，异硫氰酸酯对菌膜有一定的预防作用，并且有很大的潜能能够减少大多数革兰氏阴性菌的菌膜，因此，异硫氰酸酯可以作为应急产品去抑制细菌的活动性，并且可以抑制重要的人类病原菌的菌膜形成。对细菌过多的使用消毒剂和抗生素，均会使其产生一定的耐药性，从而降低细菌对这些药物的敏感性，张文艳 [33]在消毒剂中添加了柠檬醛、肉桂醛和茶多酚3 种天然物质，结果发现，混合菌菌膜对消毒剂双氧水的抵抗能力降低了2～10 倍，对次氯酸钠的抵抗力降低了约2～4 倍，而对过氧乙酸的抵抗力则降低了4～8 倍，说明这3 种天然物质可以有效增强混合菌菌膜对消毒剂的敏感性。
在临床上为了降低细菌的耐药性，新型消毒剂的研发是必不可少的，以上的研究将为新的高效的消毒剂或清除剂的开发作出贡献。
日常生活中，常见的食源性致病菌主要包括沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni enteritis）、霍乱弧菌（Vibrio cholerae）、副溶血性弧菌、肉毒梭菌（Clostridium botulinum）和志贺氏菌（Shigella）等，假若被污染的食品没有加热充分，人食入后则极易产生疾病，小到呕吐腹泻，重则引发炎症，严重脱水，甚至有些则会导致死亡，如若引起交叉污染，造成人与人之间的传播，则后果不堪设想。菌膜的形成严重阻碍了致病菌的清除，它就像是细菌的保护伞，增强了细菌对外界不利条件的抵抗力，所以如何避免菌膜形成，彻底清除致病菌成为医学和食品工业中的一大难题。
菌膜的形成是一个递进的过程：先是细菌依靠自身表面蛋白与接触表面发生瞬时黏附，继而在黏附基质等的作用下聚集在接触面形成微菌落 [34]；紧接着微菌落中的细菌开始进行大量增殖，通过分泌多糖细胞间黏附素等胞外多聚物来形成成熟的菌膜结构 [21]。成熟后的菌膜一般都会向环境中散播细菌，在营养贫乏或其他压力下，菌膜结构会发生解离，有部分菌体会从菌群中脱离并向外散播，然后开始新的菌膜形成过程 [35]。初始阶段细胞黏附可分为可逆黏附和不可逆黏附阶段，在可逆黏附阶段细胞的附着力较弱，此阶段的菌膜比较容易冲洗除去；而在不可逆阶段时，则需要较强的作用力（如擦洗、打碎等）才能除去菌膜 [36-37]；在形成微菌落阶段时，细菌对杀菌剂、抗生素和紫外线等的抗性均有提高 [38]。这些研究成果在清除细菌菌膜方面有很大的贡献，在细菌初始黏附接触面时就进行迅速全面的清洁，避免其形成微菌落，则会减少细菌的量。在食品工业，对菌膜形成的预防和对食物被污染与否的及时有效监控是关键，在菌膜成熟前及早清除，会大大降低食品安全的隐患。
病原菌菌膜形成相关基因的研究是最近几年菌膜方面的研究热点，通过对毒力基因的敲除或过表达，根据其突变株菌膜的生成量，并与正常菌株菌膜的形成量作对比来确定该基因是否参与菌膜的形成过程。也有成功利用转座子阻断法来研究与菌膜形成相关基因的报道 [39-40]，Tn917转座子使用比较广泛，国外有利用该转座子插入表皮葡萄球菌形成突变体，探讨对菌膜形成的影响 [41]，国内也有利用Tn917转座子来筛选单核细胞增生李斯特菌菌膜形成突变子的研究 [42]，该方法是一种常用的鉴定新基因的方法，从细菌到高等植物都有很广泛的应用 [43]。
一些熟悉的致病菌，如金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等，关于其菌膜形成的研究相对成熟，人们对其菌膜形成的影响因素的了解相对深入。相关的研究方法、思考方向及基因的调控为其他致病菌的菌膜研究的开展提供了极其有利的帮助。
在临床上应用于人体的生物材料容易引起细菌的黏附和菌膜的产生，导致相关感染性疾病及慢性感染的反复发作；在食品工业中一旦细菌污染并形成菌膜，不仅会对加工设备、输送管道表面造成损失，更会造成食品安全问题。国内外的许多研究机构都投入了大量的资金和人力去研究菌膜，并获得了一部分的理论体系，其最终目的是将这些理论及实验结果应用到临床和食品工业中，减少由于菌膜造成的疾病和损失。
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A Review of Factor Affecting Biofilm Formation by Food-Borne Pathogenic Bacteria
WU Man
1，LI Sen
1，WU Shuyan
1，CHEN Guowei
1，LIU Fang
2，ZHANG Chao
1，DONG Qingli
1，LIU Qing
1，*
（1.School of Medical Instrument and Food Engineering，University of Shanghai for Science and Technology，Shanghai200093，China；2.International Travel Healthcare Center，Gansu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Lanzhou730020，China）
Abstract：Bacterial biofi lm is the condition under which microorganisms survive by adhering to the medium surface and forming a large number of bacterial colonies. The dense structure of bacterial biofi lm enables bacteria to survive in adverse environmental conditions. In the food industry, it is impossible to completely eliminate bacterial contamination due to the formation of biofilm. Meanwhile, in the medical field, biofilm is one of the major reasons for repeated attacks and diffi cult control of many chronic and infectious diseases because of the drug resistance. In this paper, the recent progress in understanding of bacterial biofi lm is systematically reviewed, and future development is proposed.
Key words：food-borne pathogenic bacteria; biofi lm; influencing factors；food industry
中图分类号：Q935
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2015）05-0239-05
doi：10.7506/spkx1002-6630-201505044
收稿日期：2014-04-24
基金项目：国家自然科学基金面上项目（31371776；31271896）
作者简介：吴嫚（1990—），女，硕士研究生，研究方向为食源性致病菌致病机理。E-mail：mandywu1247@gmail.com
*通信作者：刘箐（1970—），男，教授，博士，研究方向为食源性致病菌致病机理及快速检测技术。E-mail：liuq@usst.edu.cn