鱼类抗冻蛋白结构与抗冻活性的关系

纪瑞庆 1,刘爱国 1,*,陈 龙 1,吴子健 1,胡兆博 2,刘 斌 3

(1.天津商业大学生物技术与食品科学学院,天津市食品生物技术重点实验室,天津300134;2.天津市食品研究所,天津301609;3.天津商业大学天津市制冷技术重点实验室,天津300134)

摘要:抗冻蛋白通过不可逆附着于冰特定表面来有效抑制冰晶生长和重结晶,具有很强的抗冻活性。本文选取若干代表性鱼类抗冻蛋白为例,阐述6类鱼类抗冻蛋白的结构特性(氨基酸残基组成与特定序列、二级结构组成以及蛋白的空间构象等)、稳定蛋白结构的重要因素以及分子中参与冰晶结合的氨基酸残基位点,重点揭示蛋白结构与抗冻活性的内在关系,以期为将来的广泛应用提供一定理论基础。

关键词:鱼类抗冻蛋白;结构;抗冻活性;吸附冰晶性能

AFP应用于冰淇淋生产中,消除产品的冰渣感觉,改善品质与口感,并得到了美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration,FDA)的认可。2006年我国曾公布抗冻蛋白可以作为新的食品添加剂添加到冷冻食品中,由于未出现此类产品在食品工业中的大规模应用,在2012年未被列入食品添加剂列表中。迄今为止,按生物体来源的不同,已发现的AFP可分为鱼类抗冻蛋白、昆虫抗冻蛋白、植物抗冻蛋白、细菌抗冻蛋白。其中对于鱼类AFP(特别是源于极地鱼类机体的AFP)的研究比较透彻,鱼类AFP按照结构可分为6类(图1) [5]:Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型、抗冻糖蛋白(antifreeze glycoprotein,AFGP)、 高活性抗冻蛋白。

图1 6种鱼类抗冻蛋白的结构示意图 [5]5
Fig.1Structural illustration for six kinds of fish antifreeze pro teins [5]

AFP的结构与其抗冻活性具有十分密切的关系。通常 在冻结温度下溶液中的水会形成冰晶结构,但当AFP存在时,情况就会发生变化:一方面,AFP会不可逆地附着到冰晶特定的表面并成为冰晶的一部分,可阻止其他水分子在冰晶表面的吸附,也可掩蔽那些能成为异质冰核的存在位点;另一方面,AFP在冰晶表面的附着会致使吸附蛋白间的冰按照弯曲锋面生长,此处表面张力加大改变了原有水分子结晶形成冰所需的能量平衡状态,使得冰在此进一步生长延伸所需能量无法满足,这就是开尔文效应(Kelvin effect)。在此过程中,溶液的冰点降低,而熔点几乎保持不变,熔点与降低之后的冰点之间产生的差值即为热滞活性(thermal hysteresis activity,THA) [6]。以上就是AFP具有抑制冰晶生长及重结晶活性(ice growth and recrystallization inhibition activity) [7]的原因,而THA也被用作衡量抗冻蛋白抗冻活性的一项重要指标。AFP不可逆地附着到冰晶的表面是AFP具有抗冻活性的关键,而AFP在冰晶表面的有效附着是AFP与冰晶表面相互作用的结果,在此过程中,AFP的结构,特别是特定区域的结构以及与冰面结合的氨基酸残基位点起到了十分重要的作用。当然目前不同来源的抗冻蛋白结构多样,它们的氨基酸残基序列以及与冰晶结合的相关结构域所形成的构象没有一致性,且有些AFP蛋白在低温下还会发生构象改 变 [8],造成了目前用构象来判断蛋白质是否属于AFP具有一定困难和不确定性,但对AFP晶体结构的进一步探索以及与冰晶体结合位点的确定可以帮助研究人员深入理解AFP与冰晶结合的机制。本文拟通过总结目前已经报道的6种鱼类AFP的结构及其与冰晶结合的机制,揭示鱼类AFP的结构与抗冻活性的关系,期望能从蛋白质自身结构的角度分析讨论鱼类AFP具有抗冻活性的内在原因。

1 Ⅰ型抗冻蛋白的结构与抗冻活性的关系

Ⅰ型抗冻蛋白(typeⅠAFP)是一类结构最简单的鱼类AFP,通常含有约40个氨基酸残基,且富含丙氨酸残基(约>60%,如图2所示) [9],分子质量约为3.3~4.5ku,其空间结构(图1b)具有高度或完全α-螺旋化,THA约为0.7℃。该类蛋白发现于美洲拟鲽鱼(winter flounder,拉丁名Pseudopleuronectes americanus)、短角杜父鱼(shorthorn sculpin,拉丁名Myoxocephalus corpius) [10]的血清和皮肤等组织中,在机体中含量极低,通常为10~15mg/mL。该类蛋白吸附在六棱双金字塔形冰晶(hexagonal ice)沿<011-2>方向的{202-1}锥面上。

图2Ⅰ型抗冻蛋白的一级结构的氨基酸序列 [11]11
Fig.2Amino acid sequence f or the primary structure of type I AFP [11]

美洲拟鲽血清中发现的HPLC-6就是一种典型的Ⅰ型抗冻蛋白,分子质量3.3ku,由37个氨基酸残基组成(图2a),且包含3个由11个氨基酸残基组成的重复序列单元(Thr-Al a-Ala-X-Ala-X-X-Ala-Ala-X-X,其中X为任意氨基酸残基),含23个丙氨酸残基(62%)且多成簇排列,此氨基酸易形成α-螺旋结构,疏水性氨基酸残基(如丙氨酸残基、亮氨酸残基)约占67.6%,亲水性氨基酸约占32.4%。HPLC-6空间结构几乎完全由双亲右手α-螺旋构成,只有C端的最后一个螺圈为3 10螺旋。HPLC-6上N端和C端各自含有一个帽子结构,维系着整个分子螺旋结构的稳定性(图3a),其中N端帽子结构上的Asp1、Thr2、Ser4以及Asp5残基侧链和两个紧密结合的水分子间的8个氢键构成 一个有序的氢键网络;而C端帽子结构由Arg37残基侧链和酰胺化羧基端形成的3个氢键组成 [11-12]。HPLC-6分子沿着螺旋轴向方向形成3个面(图3b):1)疏水面,由丙氨酸和苏氨酸残基的甲基组成;2)亲水面,由精氨酸残基、谷氨酸残基、丝氨酸残基和天冬酰胺残基组成;3)Thr-Asx面,主要由苏氨酸残基和天冬酰胺/天冬氨酸残基的亲水性基团组成 [13]。这种结构使得分子上的4个苏氨酸残基(Thr2、Thr13、Thr24和Thr35)等间距排列于疏水面和Thr-Asx面之间的棱边上(图3c) [14]

图3HPLC-6蛋白的构象示意图 [13]13
Fig.3Schematic diagram of HPLC-6 [13]

a.HPLC-6的构象示意图(PDB编码1WFA),帽子构象以及与冰晶结合有关的氨基酸残基在图中标出 [15];b.沿螺旋轴轴向方向观察HPLC-6的模式图,显示蛋白结构的疏水面、亲水面和Thr—Asx面,突起表示α-螺旋表面Thr、Asx、Glu以及Arg的侧链 [13];c.HPLC-6的4个苏氨酸残基(Thr2、Thr13、Thr24和Thr35)等间距排列于螺旋的一个侧棱上。

HPLC-6的构象可以清晰地表明Ⅰ型AFP分子中连续完整螺旋化结构与该类抗冻蛋白的抗冻活性有密切关系。首先,Ⅰ型AFP螺旋构象的长度是决定其抗冻活性强弱的重要因素,长度越长则THA越高,抗冻活性越强,HPLC-6含有3个由11个氨基酸残基组成的重复序列单元,形成了约10个α-螺旋圈和1个3 10螺旋圈,在质量浓度为10mg/mL时 ,其THA为0.68℃,而同样来源于美洲拟鲽鱼的AFP9亚型蛋白则含有4个由11个氨基酸残基组成的重复序列单元(图2b),因此其所含螺旋圈数高于HPLC-6,在质量浓度为10mg/mL时,AFP9亚型蛋白的THA为1.0℃ [16]。这种特点的潜在原因在于AFP是通过吸附冰晶来抑制冰晶的生长,而Ⅰ型AFP的螺旋构象正是其与冰晶表面相结合匹配重要因素,提高螺旋结构的长度或者说增加重复序列的数目(即增加了螺旋圈数)也就增加了Ⅰ型AFP与冰晶相作用的面积。其次 , HPLC-6吸附于冰晶的椎体平面(pyramidal plane) [17],而Ⅰ型AFP中沿着螺旋轴向方向形成3个面中至少有一个面是与冰晶结合的结合面。最初Ⅰ型AFP-冰晶结合理论认为Thr—Asx面是蛋白与冰晶结合的结合面,而分子中Thr残基与水分子所形成的氢键是结合的主要驱动力。但是近年来越来越多的研究结果指出由Ala和Thr残基上的甲基所形成的疏水面才是蛋白与冰晶吸附的结合面,该面上的氨基酸残基(Thr、i+4Ala、i+8Ala)为冰晶结合位点,主要的证据来自于:Zhang Wei等 [18]利用突变体实验证明HPLC6上苏氨酸残基的甲基对其与冰晶结合能力至关重要;Baardsnes等 [19]通过的突变体实验表明Ala17和Ala21位于HPLC-6与冰晶结合区域;Mao Yougang等 [20]证实Ala残基上的甲基作用于冰水界面的冰晶表面,并且推断Ⅰ型抗冻蛋白皆含有一个富丙氨酸残基的α-螺旋结构,且这些丙氨酸残基又进一步形成一个疏水性的冰晶结合平面,而α-螺旋亲水面上的极性氨基酸残基可提高AFP的溶解性。另外,Thr-Asx面上的Leu残基可防止AFP在生理质量浓度(10mg/mL)下聚集,Asn残基可提高HPLC-6的溶解性 [21];Lys18与Glu22间的盐桥虽不会影响抗冻活性,但可稳定蛋白的构象,并且盐桥数量的增加也可增加蛋白的溶解性 [22]

2 Ⅱ型抗冻蛋白结构与抗冻活性的关系

Ⅱ型抗冻蛋白(typeⅡAFP)是一类富含半胱氨酸残基的鱼源抗冻蛋白,发现于鲱鱼、胡瓜鱼等的血清中,分子质量范围为11~24ku,THA约为0.13℃。根据其吸附冰晶是否依赖Ca 2+的参与,Ⅱ型AFP又可分为两种亚型:Ca 2+依赖亚型与Ca 2+不依赖亚型。但这两种亚型的Ⅱ型AFP构象极其相似,其中Ca 2+有助于蛋白质分子构象的稳定 [23]。该类蛋白通过吸附冰晶的{101-0}棱面从而显示出其抗冻活性。

图44源于Clupea harenngguuss的AFP的一级结构的氨基酸序列 [2233]
Fig.4Amino acid sequence for the primary structure of AFP from Clupea harengus [23]

大西洋鲱鱼抗冻蛋白(herring antifreeze protein,拉丁名Clupea harengus,hAFP)是一种由130个氨基酸残基(Ala1~Lys130),如图4所示,构成的Ⅱ型Ca 2+依赖亚型的抗冻蛋白中疏水性氨基酸约占36.9%,亲水性氨基酸约占63.1%;所含的10个半胱氨酸残基形成5对二硫键(Cys4~Cys15,Cys32~Cys125、Cys69~Cys100、Cys89~Cys111、Cys101~Cys117);整个分子构象类似于Rossman折叠结构域(Rossman fold domain),如图5a所示,8条β-折叠股(β1,aa9~11;β2,aa14~23;β3,aa38~39;β4,aa62~67;β5,aa76~77;β6,aa101~106;β7,aa111~115;β8,aa121~128)构成扭曲居中的反向平行β-折叠,两侧各排列一个α-螺旋(α1,aa25~33;α2,aa45~53);分子中参与Ca 2+结合的区域位于Gln92~Asp114之间的无规则卷曲,即:“Ca 2+结合环”(Ca 2+-binding loop),其中的Gln92O ε1、Asp94O δ2、Glu99O ε1、Asn113O δ1、Asp114O和O δ1与Ca 2+形成配位键(图5b)。

图5hAFP的构象示意图 [24]24
Fig.5Schematic representation of AFP structure [24]

hAFP吸附冰晶并抑制冰晶生长的因素在于:首先,Thr96、Thr98、Asp94和Glu99是hAFP与冰晶进行有效吸附的结合位点 [24],天然状态下,这些氨基酸残基共同形成一个较平坦的平面,并受到“Ca 2+结合环”两侧二硫键(Cys69~Cys100与Cys89~Cys111)的稳定作用 ,该平面能与冰晶晶格表面有效吸附,并抑制冰晶的生长 [25];另一个方面,“Ca 2+结合环”上配位结合的Ca 2+不仅稳定了hAFP蛋白构象,更协同加强了hAFP与冰晶的相互作用,当蛋白与冰晶作用时,与Ca 2+配位相连的有序水分子也可成为生长冰晶的一部分。

萨哈林小眼八角鱼抗冻蛋白(longsnout poacher antifreeze protein,拉丁名Brachyopsis rostratus,LpAFP)是由127个氨基酸残基构成的单亚基蛋白,属于典型的Ⅱ型Ca 2+不 依赖亚型的抗冻蛋白,疏水性氨基酸残基约占42.8%,亲水性氨基酸残基约占57.2%;所含的10个半胱氨酸残基构成了5对二硫键(Cys4~Cys15、Cys32~Cys122、Cys66~Cys97、Cys86~Cys108、Cys98~Cys114),其一级结构如图6所示。LpAFP的分子构象与hAFP相似 [26],类似于Rossman折叠模式(Rossman fold)(图7)。整个分子的二级结构包括2个α-螺旋(α1,aa25~34;α2,aa45~54)、8个β-折叠股(β1,aa9~11;β2,aa14~22;β3,aa38~39;β4,aa59~64;β5,aa73~74;β6,aa98~102;β7,aa109~112;β8,aa118~125)以及4个环区(L1,aa66~72;L2,aa74~78;L3,aa86~89;L4, aa91~97),其中L3、L4以及β7、β6的C端、β4的N端及其周围氨基酸残基组成较平坦的平面,此平面又被分为两部分:疏水区(连接二级结构的无规则片段:Gly57~Ile58、Ala103~Ala104、Pro113~His118)和亲水区(环区和β-折叠股)。以Ile58为中心的疏水区是吸附冰晶的位点,此区与冰晶晶格匹配而紧密结合。Ile58周围发现含有有序的碳原子(Ile58的C δ、Ala103的C β、His 118的C ε),这与Doxey等 [27]报道AFP的冰结合区域中有序的表面碳原子靠近极性原子一致。Asn91、Asp110、Asp111(对应于结合Ca 2+的氨基酸残基)与一个水分子形成氢键,与二硫键Cys66~Cys97、Cys86~Cys108一起维持环区的构象稳定。

图66源于Brachyopsis rostraattuuss的AFP的一级结构的氨基酸序列 [2233]
Fig.6Amino acid sequence for the primary structure of AFP from Brachyopsis rostratus [23]

图7lpAFP的整体折叠构象 [26]26
Fig.7Overall folding of longsnout poacher lpAFP [26]

二级结构组成表示主链结构,分别为:α-螺旋,α1~α2;β-折叠股,β1~β8;二硫键,Dsb1~Dsb5;N和C分别表示N端和C端。

3 3Ⅲ型抗冻蛋白结构与抗冻活性的关系

Ⅲ型抗冻蛋白(typeⅢAFP)是一类分子质量约为7.0ku(6.5~7.14ku)的球蛋白(图8a),THA一般为0.53℃。该类蛋白的两个端瓣(N端瓣和C端瓣)各含有一个由若干不完全的短β-折叠股形成的β-片层,两个β-片层间夹着一段只有一个螺旋圈的α-螺旋;主链内许多“类似β-结构”的β-股间氢键使得整个蛋白折叠紧密并具一定刚性(图1、8);蛋白构象中含有能与冰晶表面(棱面或锥面)相互作用的平坦面,此面与晶格的 棱面上氧原子形成互补的结构,并且还与 锥面互补,形成六方双锥体冰晶。蛋白表面通过氢键识别冰晶的结合面,互补性的结构允许冰晶-蛋白之间范德华力相互作用,加强冰晶-蛋白的相互吸引力,使得蛋白更好的吸附冰晶。

美国大绵鳚(eel pout,拉丁名Macrozoarces americanus)含有12种Ⅲ型抗冻蛋白,分别为HPLC-1~HPLC-12,目前研究比较透彻的是HPLC-12。HPLC-12具有典型的Ⅲ型抗冻蛋白的空间构象,也属于季铵基乙基-葡聚糖凝胶结合型(quaternary aminoethyl(QAE)-sephadex-binding group)Ⅲ型抗冻蛋白,即QAE型 [28]。该蛋白含有66个氨基酸残基,其N端瓣和C端瓣各含有一个β-片层(每个片层各含3股β-折叠股)(图8a),aa3~7、aa15~17、aa22~26、aa43~45、aa53~54、aa60~62分别形成6段不完整的β-折叠股;37~40aa为短的α-螺旋 [29]。不过也有观点认为33~43aa形成5个β-转角,而33~37aa和36~40aa间连续的两两转角分别形成两个3 10-螺旋 [30]。不同温度条件下,该蛋白的构象基本不变 [30]

目前,对该蛋白与冰晶相互作用并结合的机制解释有两种理论:1)单个双亲冰晶结合平面理论 [29],该理论的提出较早,HPLC-12含有一个能与冰晶基本棱面(primary prism plane,PPP)吸附的拟平行四边形平面(pseudo-parallelogram),其中Thr18和Ala16的羰基以及Gln44相连形成拟平行四边形的一条边,而Gln9和Thr15形成了平行的另一条边,两边相距4.5☒,并且该面被邻近的一些疏水性氨基酸残基(Leu10、Pro12、Ile13、

Leu19、Val20、Val41以及Leu51)围绕;拟平行四边形上的Gln9、Thr15和Thr18侧链上的氧原子、Gln44侧链上的氮原子以及Ala16的主链氧原子共同形成与冰晶表面水分子直接作用的平坦平面(图8b),且这5个原子间的距离与冰晶棱面水分子上氧原子的间 距完全匹配;正是这些关键原子和冰晶表面氧原子之间的氢键作用使得HPLC-12能沿着六棱形冰晶的中心轴(即C轴)方向与冰晶棱面结合。2)复合冰晶结合平面型理论 [31],该理论目前较为流行,HPLC-12的分子质量虽 然只有7.0ku,却拥有两个能与冰晶上平行于冰晶C轴或稍微倾斜的表面(即所吸附冰晶的棱面和所吸附冰晶的锥面)同时相互吸附的平面,两个面相邻呈150°,且均位于蛋白上较为疏水的区域(图8c),其中Thr18、Leu19、Val20、Val41组成的平面与PPP吸附,而Gln9、Leu10、Ile13、Asn14、Thr15、Ala16、Met21和Gln44负责其与冰晶锥面的吸附作用。

图8Ⅲ型AFP的构象和复合冰晶吸附位点示意图
Fig.8Schematic representation of AFP structure

a.AFP的带状图,二级结构组成用氨基酸残基的位点表示;b.AFP-冰晶的嵌合模型。空间填充模型表示冰晶的{101-0}棱面,显示了5个(Gln9、Thr15、Thr18、Gln44、Ala16)与冰晶棱面结合的氨基酸残基,冰晶表面与AFP氢键作用(虚线)的氧原子用小圆球表示 [29];c.Ⅲ型AFP复合冰晶结合位点示意图 [31],此面上与冰晶结合有关的氨基酸残基以及对应的冰晶表面(冰晶锥面和基本棱面)图中已标出。

4 Ⅳ型抗冻蛋白结构与抗冻活性的关系

Ⅳ型抗冻蛋白(typeⅣAFP)是一类具有四螺旋捆结构域(由4个反平行左手α-螺旋组成)的抗冻蛋白,如图1e所示。其分子质量约为Ⅰ型抗冻蛋白的3倍左右,大约为12.0ku,富含谷氨酸残基(17%),THA较低,一般为0.08~0.5℃。此类蛋白吸附在对称于垂直C轴的一个轴两侧,呈香肠型的吸附面积,使得冰晶呈扭曲的六方双锥体(hexagonal bipyramid),即六方偏方面体(hexagonal trapezohedra)。

长角杜父鱼(longhorn sculpin,拉丁名Myoxocephalus octodecimspinosis)血清中分离的LS-12是最早发现的Ⅳ型抗冻蛋白,其一级氨基酸残基序列如图9所示,分子质量为12.3ku,由108个氨基酸残基组成,含11个谷氨酸残基(约10.1%)和17个谷氨酰胺残基(约15.7%),疏水性氨基酸残基约占41.6%,亲水性氨基酸残基约58.4%,N端含有一个焦谷氨酰基团;其空间构象高度螺旋化,具有典型的四螺旋捆(four-helix bundle)结构域(图10),每个螺旋的疏水侧链居于各螺旋间并形成疏水核心,而亲水侧链则位于旋 捆的外表面,可与冰晶表面形成特异性吸附 [32]。当LS-12蛋白存在时,形成的冰晶结构呈六方偏方面体,而不是常见的六方双锥体,冰蚀刻实验发现它并不吸附六方双锥体棱面(如美洲拟鲽AFP)和第二棱面(如短角杜父鱼AFP),而是吸附在对称于垂直C轴的一个轴两侧,因此冰晶形态不同于其他抗冻蛋白 [33]

图99源于Myoxocephalus octodecimspinoossiiss的AFP的一级结构的
氨基酸序列 [3322]
Fig.9Amino acid sequence for the primary structure of AFP from Myoxocephalus octodecimspinosis [32]

图1 0LS-12的结构示意图 [33]33
Fig.10Schematic representation of LS-12structure [33]

a.LS-12的反平行四螺旋捆示意图;b.LS-12的的螺旋轮结构示意图,显示a图中氨基酸排布,疏水氨基酸残基由圆圈表示,位于旋捆的中心。

通常Ⅳ型抗冻蛋白在宿主机体中的含量极低,如LS-12在宿主机体内的质量浓度仅为100μg/mL,机体并没有产生足够数量的AFP保护宿主防冻 [34],对于Ⅳ型抗冻蛋白的功能仍存在争议,但目前认为它可能含有抗冻活性,并且除了结合冰晶的功能外还可能具有结合配体的功能。此外,发现该类蛋白在宿主胚胎发育的整个期间高度表达,如另一种Ⅳ型抗冻蛋白——银鲫Ⅳ型抗冻蛋白(Carassius auratus gibelio antifreeze typeⅣprotein,CagAFPⅣ)。Liu Jingxia等 [35]的研究表明,CagAFPⅣ蛋白基因的转录始于囊胚期,并且在整个宿主的胚胎发育期都保持高水平的表达,而其在已孵化成的幼体内表达急剧下降。表明其可能具有保护尚未产生血液循环系统胚胎的功能,这对鱼类进化可能具有益处,使得生物机体在获得有活性的抗冻蛋白前能够适应寒冷环境 [36]

5 抗冻糖蛋白结构与抗冻活性的关系

抗冻糖蛋白(antifreeze glycoprotein,AFGP)是一类富含糖基的抗冻蛋白,其THA一般为1.2℃。该类蛋白的一级序列含重复的三肽单元,即Ala—Ala—Thr(图11),其中苏氨酸残基的β-羟基上结合一个O-连接的二糖基团,为β-D-吡喃半乳糖苷-(1,3)-2-乙酰氨基2-脱氧-β-D-

吡喃半乳糖(图1a)。AFGP所含三肽单元的重复数目范围为4~50,因此AFGP的分子质量范围为2.6~33.7ku。根据分子质量的不同,AFGP可分为8种亚型,AFGP1亚型分子质量最大,为33.7 ku,而AFPG8亚型分子质量最小,为2.6 ku。对于AFGP的空间构象的认识目前没有统一观点,早先运用圆二色谱和核磁共振的研究表明AFGP

的空间构象为延展状的无规则卷曲;也有研究表明它们的构象呈有序的双亲螺旋结构,糖基排列在螺旋一侧,因此其亲水面含有二糖基的羟基,而疏水面包含氨基酸残基上疏水性的甲基;但是目前多数的研究表明分子质量较大的

AFGP1~AFGP5亚型并不具有长而有序的结构(long-range order structure),而分子质量很小的AFPG8亚型整体是无规则卷曲结构,但也有局部有序片段的存在 [5]

图1 1AFGP3亚型的一级结构的氨基酸序列 [37]37
Fig.11Amino acid seq uence for the primary structure of AFGP3 [37]

由于通常南极鱼(Antarctic notothenioid,拉丁名Notothenia coriiceps)等抗冻鱼机体中含多种AFGP,并且制备单种AFGP纯品非常困难,目前对AFGP抗冻机制以及它们的结构与抗冻活性关系的研究还不够深入。另外,迄今为止利用分子生物学技术表达并纯化AFGP还未成功,因此目前主要通过化学合成的方法制备一定量的AFGP纯品来研究各种AFGP蛋白结构与性质的关系 [15]。Tachibana等 [38]通过液相合成了几种AFGP的类似物,发现AFGP能够具有显著抗冻活性的主要结构要素为:连接在每一个苏氨酸残基上的二糖糖基必须是α-构象,N-乙酰基团必须位于C2位上,二糖糖基必须是半乳糖型,苏氨酸残基上的α-甲基对抑制冰晶生长活性非常关键。糖基中的若干个羟基(除了C6位)对抗冻活性有很大影响,而主链的氨基酸组成对活性无明显影响 [39]。研究发现半乳糖基与多肽主链合适的距离才能保持其活性,水合作用和在冻结状态下主轴构象无明显改变对冰晶抑制也有重要作用 [40-41]。多肽链越长活性越大,一定条件下形成二聚体以及α-螺旋含量增加以及高度灵活性的构象都会增加AFGP全部分子与冰晶的作用,允许更强大的吸附,而增强抗冻活性 [42-44]。AFGP动力学研究表明其两步抑制冰晶过程:1)不完整的吸附或改变表面较弱的作用;2)较强的作用实现完整的吸附以抑制冰晶生长。冰晶生长从一个粗糙表面形成一个平整表面,在过冷温度下停止生长,然而之后的回复生长过程中,蛋白释放到液相中而不是之前所认为的成为冰晶的一部分,因此认为抗冻行为只是纯粹的动力学现象 [45]

6 高活性抗冻蛋白结构与抗冻活性的关系

高活性抗冻蛋白(hyperactive antifreeze protein,HAFP)是最后一类发现于鱼类机体中的AFP,分子质量较其他AFP大,该类AFP在较低浓度时就能表现出高效的抗冻活性,其质量浓度在4mg/mL时,THA为2℃。该类蛋白是由相同亚基组成的同源二聚体,空间构象呈四螺旋捆(图13a)。此类蛋白具有热不稳定性,在室温条件下易分解并导致其抗冻活性的降低,因而这些蛋白难以在鱼类中检测出来 [46]。 

最早在美洲拟鲽(winter flounder,拉丁名Pseudopleuronectes americanus)中发现一种HAFP,被称为Maxi。Maxi为由两个分子质量约为17ku的相同亚基组成的同源二聚体,如图12所示,每个亚基均含195个氨基酸残基,其中丙氨酸残基含量为62%,其一级序列含有类似于Ⅰ型抗冻蛋白的由11 个氨基酸残基(Ile/ ThrXXXAlaXXXAlaXX,X为任意氨基酸残基)组成的重复单元(图12)。Maxi亚基由一个长约145☒的螺旋-环-螺旋模体(helix-loop-helix motif)构成,其二级结构组成中以α-螺旋为主(含量>95%) [47-48],中部所含的一个Ω-环区(由每个亚基中间的7个氨基酸残基构成)将长约290☒的亚基180°对折,使得N端和C端彼此相邻排列于亚基的一头,且两端各含有一个帽子结构维持着螺旋构象的稳定性;从二级结构的层面来说,各亚基大部分(除了中部的Ω-环区以及N端和C端的帽子结构)是由11 个氨基酸残基重复单元序列串联构成的连续螺旋,每个重复单元会形成3圈螺旋(平均每3.7个残基围成1圈),较典型的α-螺旋(平均每3.6个残基围成1圈)松弛一些。Maxi二聚体的空间构象如图13a所示,两个亚基空间相互并不重叠,而是以反向并列方式对齐排布(即两个亚基的N端瓣螺旋以及两个亚基的C端瓣螺旋分别反向比邻排列)进一步形成如棒状的四螺旋捆结构,整个分子具有一个双重旋转对称轴 [49-50]。整个分子的空间构象中,亚基间紧密接触部位主要位于各亚基的帽子结构区域以及Ω-环区:在二聚体的一头,一个亚基环区部位的Leu94和Tyr103与另一个亚基N端帽子上的Ile2和C端帽子上的Phe191亲密接触,形成了含有两个芳香族侧链堆积的局部性疏水区域(图13b);在二聚体的另一头,一个亚基环区的Lys100侧链上亚氨基与另一亚基Ala191、Ala192以及Ala194主链羰基形成氢键,而其自身的Leu94和Ile97主链羰基与Asn98侧链羰基则接受来自另一亚基Arg7的氢键;而在二聚体中间部位,来自各亚基N端瓣螺旋的Ile51和Ile54以及C端瓣螺旋的Val144和Val148形成疏水簇。而分子中一系列重复单元所形成的螺旋区域则是依靠弱的范德华力来维系的,其结构间隙明显疏松(图13c),且恰好只能容纳单层的水分子,这些水分子在蛋白内部的氨基酸残基(多为丙氨酸残基、苏氨酸残基)周围形成伸展的五边形水环网络(polypentagonal network),如图13d所示,当然偶而也有一些四边形、六边形的水分子环。

图1 2源于Pseudopleuronectes americaannuuss的MMaaxxii的一级结构的氨基酸序列 [4499]
Fig.12Amino acid sequence for the primary structure of HAFP from Pseudopleuronectes americanus [49]

整个蛋白分子形成一个半开放的笼型结构(semiclathrate structure):约400个水分子位于蛋白内部,形成两个彼此交叉且约呈90°的单分子水层,而另一部分水分子会溢出并延伸到蛋白的表面形成有序的水分子网络,进而与冰面上的准液体层(quasi-liquid layer)融合并一起冻结(图13d)。此时,N端瓣螺旋和C端瓣螺旋表面上的结晶水分子簇(图13a、13d中框内区域)可与冰晶上多个表面匹配。此二聚体与冰晶结合的氨基酸残基位于分子的内部,而那些与冰面融合并一起冻结的水分子就像是从Maxi分子内部伸出的“锚”,让Maxi蛋白紧紧地吸附于冰晶表面,是Maxi蛋白折叠迫使水分子溢出机制与半开放笼型结合水锚定机制共同作用的结果。

图1 3Maxi四螺旋捆结构以及其半开放的笼型结构示意图 [50]50
Fig.13Four-helix bundle structure with an open core of HAFP [50]

a.Maxi的四螺旋捆结构的条带结构模型显示单体1、2的反平行发卡结构。C2表示中心区,与帽子结构和中心区以范德华力连接的氨基酸残基显示了其侧链;b.Maxi帽子结构的俯视图,虚线表示氢键;c.a图中框内蛋白界面的俯视图,小圆球表示20☒深处的结晶水;d.Maxi内部的水分子网络结构。Maxi的剖面图显示内部水分子的网络结构,与单体相连的水分子分别框出。虚线表示氢键。框内的水分子与冰晶多个表面结构匹配,并且不受蛋白空间位阻影响。

7 结语

目前对于鱼类AFP参与抗冻活性的关键因素已经有了很深入的认识,人们已经能够从分子动力学层面上解析AFP结构与抗冻活性的内在联系。这些鱼类AFP的氨基酸残基组成、糖基含量、分子质量以及空间构象虽然有一定差异,但都具有一定的抗冻活性,都能有效地与冰晶进行不可逆结合,并进一步防止冰晶的生长,有的AFP具有与冰晶表面结构互补的平面,如:Ⅰ型抗冻蛋白、Ⅱ型抗冻蛋白、Ⅲ型抗冻蛋白;而有的AFP则通过锚定机制与冰晶结合,如HAFP;而稳定AFP-冰晶复合物的主要作用力为疏水相互作用和范德华力。AFP具有广泛的应用前景,但是对于如何开放和利用AFP,仍然存在以下问题:1)目前抗冻蛋白主要是从极地鱼类、陆地昆虫、植物、细菌等生物体中分离纯化得到,而这些生物机体中AFP含量很低,造成提取与分离的困难,产量也很低,因此亟待开发AFP的新来源;2)目前利用生物技术改造微生物,通过重组微生物的方式来表达与产生AFP,所得到的产品在应用时存在食品安全性问题。我们有理由相信,随着生物技术的进步,以上问题可以逐步得到解决,AFP的应用也会更加广泛。

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Relationship between Structure and Antifreeze Activity in Fish Antifreeze Proteins

JI Ruiqing 1,LIU Aiguo 1,*,CHEN Long 1,WU Zijian 1,HU Zhaobo 2,LIU Bin 3
(1.Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology,College of Biotechnology and Food Science,Tianjin University of Commerce,Tianjin300134,China;2.Tianjin Food Research Institute,Tianjin301609,China;3.Tianjin Key Laboratory of Refrigeration Technology,Tianjin University of Commerce,Tianjin300134,China)

Abstract:Antifreeze proteins,which possess strong antifreeze activity,can effectively inhibit ice growth and recrystallization by binding irreversibly to the ice crystal surface.The structural characteristics(including amino acid residues,specific sequences,secondary structure contents and protein spatial configuration)of six representative kinds of fish antifreeze proteins,important factors involved in stabilizing protein structure and amino-acid residue sites involved in ice binding are discussed in this paper.Much attention is focused on revealing the potential relationship between structure and antifreeze activity,and the purpose is to provide a theoretical basis for its widespread application in the future.

K ey words:fish antifreeze proteins;structure;antifreeze activity;ice-binding property

中图分类号:R392.1

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2015)05-0274-09

doi:10.7506/spkx1002-6630-201505049抗冻蛋白(antifreeze protein,AFP),又称热滞蛋白或冰结构蛋白,是生物机体为适应低温或过冷的环境而在体内积累产生的一类蛋白 [1],具有很强的抗冻活性,即便在较低的浓度时(较NaCl、乙二醇等抗冻物质产生抗冻活性的物质浓度要低200~500倍 [2])也会产生有效抗冻活性,从而使得生物机体具有耐冻(freezetolerant)以及防冻(freeze-avoidant)的性能 [3]。鉴于其独特的功能,AFP可应用于细胞以及组织的低温保存、制冷系统的冰浆、以及食物的贮藏等多方面。Bindslev-Jensen等 [4]曾经研究AFP的过敏性,发现其与已知的过敏原无同源性,且加入AFP后无组胺释放,表明AFP无过敏性,是一种安全的食品添加剂;2004年联合利华公司将

收稿日期:2014-09-10

基金项目:天津市科技计划项目(14ZCZDTC00021);天津市科技支撑项目(14ZCZDNC00016)

作者简介:纪瑞庆(1990—),女,硕士研究生,研究方向为食品生物技术。E-mail:lmx9009@126.com

*通信作者:刘爱国(1964—),男,教授,硕士,研究方向为食品生物技术与食品添加剂。E-mail:liuaiguo@tjcu.edu.cn