响应面优化鱿鱼须酶法脱皮工艺及其质构特性

罗春艳 1，汪振涛 1，傅鹏程 1，楼敏杰 1，陈玲玲 1，方旭波 1′2，袁高峰 1′2，陈小娥 1′2′*

（1.浙江海洋学院食品与医药学院，浙江舟山 316022；2.浙江省水产品加工技术研究联合重点实验室，浙江舟山 316022）

摘要：采用不同蛋白酶进行鱿鱼须脱皮实验，以白度值和原料保留率为指标，筛选出最适蛋白酶。在单因素试验基础上，采用Box-Behnken试验设计优化秘鲁鱿鱼须酶法脱皮工艺参数，并通过挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量、质构与显微组织分析样品的新鲜度及质构特性。结果表明，回归模型能较好反映因素水平与响应值的关系，并确定最适酶法脱皮工艺为胰酶添加量0.25%、料液比17∶20（g/mL）、酶解时间20 min，在此条件下，样品的白度值为63.95±0.31，原料保留率为（81.22±0.28）%，TVB-N含量为（27.60±0.34） mg/100 g，且质构特性与肌纤维组织均无显著变化。脱皮后的秘鲁鱿鱼须TVB-N含量符合GB 2733—2005《鲜、冻动物性水产品卫生标准》规定，色泽鲜亮、肉质有弹性、原料保留率高，该工艺适合生产实际需求。

近年来，随着我国远洋鱿钓的迅速发展和北太鱿鱼的减产，低值、捕获量大的秘鲁鱿鱼（Dosidicus gigas）一跃成为我国主要的远洋鱿钓对象，仅2013年舟山市的秘鲁鱿鱼捕获量就达10万 t以上 [1-3]。秘鲁鱿鱼个体大、有酸涩味，市场销售存在困难，必须通过深加工才能实现资源增值 [4-6]。目前，国内鱿鱼加工企业一般只重视秘鲁鱿鱼胴体的加工，而忽视了对鱿鱼须、耳等可食部位的有效利用，产品附加值低 [7-8]。原因主要是秘鲁鱿鱼须表皮厚而深黑，且吸盘很难去除 [9]，导致其难以被加工利用。

目前，国内鱿鱼加工企业采用人工或机械对鱿鱼酮体进行脱皮。对于鱿鱼足来说，人工脱皮具有速率慢、吸盘难去除、产率低等缺点，而机械脱皮存在脱皮不完全，需人工二次去除残余的皮等问题 [10-11]。酶法脱皮因其作用条件温和、产品质量稳定等优点而备受关注 [12-13]。Raa等 [14]报道采用DiZYM蛋白酶在10 ℃以下进行鱿鱼皮的脱除，鱿鱼皮脱除效果良好，且鱿鱼肌肉组织无变化，但DiZYM蛋白酶是从鱿鱼肠道中提取的，限制了其在工业化生产中的应用。国内有关酶法脱鱿鱼皮的研究相对较少，如鱿鱼酮体 [11]、鱿鱼耳 [15]和鱿鱼足 [9]酶法脱皮，这些实验均以感官或白度值为指标进行研究，但在实际生产中不仅要考虑色泽与感官指标，而且还需考虑产品的得率与质构。

本研究以白度值和原料保留率为指标，比较几种蛋白酶对秘鲁鱿鱼须的脱皮效果并筛选出最优酶，在单因素试验基础上，采用Box-Behnken设计优化酶法脱皮工艺，并对其脱皮前后的样品新鲜度、质构特性以及肌纤维组织进行分析，以期获得较理想的脱皮工艺，旨在提高秘鲁鱿鱼资源利用率，为后续鱿鱼须新型产品的研究开发提供理论依据。

1 材料与方法

冷冻秘鲁鱿鱼须浙江正龙食品有限公司；菠萝蛋白酶（50万 U/g）、动物蛋白水解酶（20万 U/g）、中性蛋白酶（20万 U/g）、胰酶（4 000 U/g）、碱性蛋白酶（20万 U/g）和木瓜蛋白酶（40万 U/g）南宁庞博生物工程有限公司；苏木精-伊红染色液（生物染色剂）上海榕柏生物技术有限公司；其他化学试剂均为分析纯国药集团化学试剂有限公司。

HH-4型电热恒温水浴锅常州国华电器有限公司；BS 110 S型电子天平北京赛多利斯仪器系统有限公司；PHS-3B型精密pH计上海精密科学仪器有限公司；CR-10型便携式色差计日本柯尼卡美能达公司；TMS-Pro型质构仪美国FTC公司；YD-202型轮转式切片机金华市益迪医疗设备有限公司；CX 31型三目显微镜日本奥林巴斯公司；KDN-103 F型自动定氮仪上海纤维仪器公司。

将冷冻的秘鲁鱿鱼须流水解冻，选取表皮相似的鱿鱼须，切成10 cm左右的小段，清洗干净，挑选粗细相同的进行分类、备用。

以白度值和原料保留率为指标，在酶添加量（质量分数）0.2%、料液比1∶2（g/mL）、酶解时间20 min、各自最适pH值与酶解温度条件下，分别使用菠萝蛋白酶、动物蛋白水解酶、中性蛋白酶、胰酶、碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶6 种酶对秘鲁鱿鱼须进行酶法脱皮，待酶解结束后，快速用去离子水冲洗，室温沥干，测其白度值和原料保留率。平行实验3 次。

在筛选出胰酶的最适温度45 ℃和pH 7.5条件下，基本酶解条件为料液比1∶2（g/mL）、酶解时间20 min和酶添加量0.2%，以白度值和原料保留率为指标，改变1 个因素的水平，其他因素水平不变，考察料液比、酶解时间及酶添加量对秘鲁鱿鱼须脱皮效果的影响。其中料液比为1∶8、1∶4、1∶2、1∶1、2∶1（g/mL），酶解时间为5、10、20、30、40 min，酶添加量为0.05%、0.1%、0.2%、0.4%、0.6%。平行实验3次。

根据上述单因素试验的结果，选取料液比（A）、酶解时间（B）、酶添加量（C）为试验因素，以秘鲁鱿鱼须的白度值和原料保留率为响应值，根据Box-Behnken试验设计原理，利用软件Design-Expert V 8.0.6对试验结果进行分析，获得最适酶解条件。

参考文献：[16-17]的方法，沿鱿鱼须轴线切成长宽高约1.5 cm 3的立方体鱿鱼块，采用TPA模式，选用P/5圆柱形探头（Φ 5 mm），测前速率5.0 mm/s，测试速率60 mm/min，测后速率5.0 mm/s，压缩比50%，间隔时间5 s，触发力5.0 g。每组样品测10 次。

将鱿鱼须切成0.2 cm 3小块，用10%中性福尔马林固定24 h后 [18]，按Nuria等 [19]方法进行组织结构的观察。

按SC/T 3032—2007《水产品中挥发性盐基氮的测定》方法 [20]进行测定，每组样品测3 次。

鱿鱼须用保鲜袋包实，利用CR-10型色差计测量其L、a、b值，白度值（W）按式（1）计算 [21-22]，样品平行测试10 次。

原料保留率表示脱皮后鱿鱼须的产率，其值越高，表示鱿鱼须损失越少。

采用软件Origin 7.5作图，通过软件SPSS 19.0进行结果统计分析，结果采用Tukey法检验差异显著性，差异显著水平P＜0.05。

2 结果与分析

图1 几种蛋白酶对白度值与原料保留率的影响
Fig.1 Effect of several enzymes on raw retention rate and whiteness

由图1可知，木瓜蛋白酶处理的鱿鱼须白度值最高为63.32而原料保留率却最低为75.01%，中性蛋白酶处理的鱿鱼须原料保留率最高为83.17%而白度值却最低为57.22，而胰酶处理后的鱿鱼须的白度值和原料保留率分别为62.45和81.85%。因此综合考虑酶法脱皮后的白度值与原料保留率，最终选择胰酶为最适酶。

图2 料液比对白度值和原料保留率的影响
Fig.2 Effect of solid-to-liquid ratio on raw retention rate and whiteness

图2 表明，在料液比1∶8～1∶1范围内，鱿鱼须的白度值随着原料用量的增加而增大，而原料保留率却逐渐降低。进一步提高原料用量，白度值减小而原料保留率却升高。因此，考虑到白度值、原料保留率，料液比为1∶2～1∶1比较理想。

图3显示，随着酶解时间的延长，白度值逐渐增大而原料保留率却逐渐降低，其中在30 min内，原料保留率在82%～84%范围内，而在40 min后，原料保留率降至79.02%，此时的鱿鱼须有点硬且具有颜色偏白现象，可能是部分蛋白失水而变性引起其白度值增大和原料保留率降低的原因。因此，酶解时间选择20～30 min范围为宜。

图3 酶解时间对白度值和原料保留率的影响
Fig.3 Effect of hydrolysis time on whiteness and raw retention rate

图4 酶添加量对白度值和原料保留率的影响
Fig.4 Effect of enzyme dosageon whiteness and raw retention rate

图4 表明，在酶添加量0.05%～0.4%范围，白度值随酶添加量的增加而增大，原料保留率却降低，当酶添加量超过0.4%时，白度值缓慢增大，原料保留率却开始上升。可能是由于在酶作用下使得鱿鱼肌肉组织更易吸水。综合考虑，酶添加量为0.2%左右。

表1 响应面试验方案与结果
Table1 Experimental design and results of response surface methodology

试验号A料液比（g/mL）B酶解时间/ min 添加量/%W白度值Y原料保留率/% C酶11∶1300.2062.8381.30 23∶4200.2563.8781.02 33∶4250.2061.8382.18 43∶4300.1563.7980.60 51∶2300.2062.9481.65 61∶2200.2058.2885.39 73∶4300.2562.9680.08 83∶4250.2061.5983.12 91∶2250.2561.8682.43 101∶1250.2561.0681.93 113∶4250.2060.3583.17 121∶1200.2061.9385.04 131∶2250.1556.8984.40 141∶1250.1559.8584.76 153∶4250.2061.9083.16 163∶4250.2060.6983.15 173∶4200.1556.7985.64

利用Design-Expert V8.0.6软件建立响应值对自变量编码值的二次回归模型方程：W=61.27＋0.71A＋1.46B＋1.55C—0.94AB—0.94AC—1.98BC—0.86A 2＋1.08B 2—0.50C 2；Y=82.96—0.10A—1.68B—1.24C＋0.000AB—0.21AC＋1.03BC＋0.97A 2—0.58B 2—0.54C 2。

表2 回归模型的方差分析（白度值为响应值）
Table2 Variance analysis of the regression mode (whiteness as response vaalluuee))

注：P＜0.01，差异极显著；P＜0.05，差异显著。下同。

方差来源平方和自由度均方F值P值模型71.6797.9624.560.000 2 A料液比4.0614.0612.530.009 5 B酶解时间16.97116.9752.330.000 2 C酶添加量19.31119.3159.570.000 1 AB3.5313.5310.900.013 1 AC3.5313.5310.900.013 1 BC15.64115.6448.250.000 2 A 23.0913.099.540.017 6 B 24.9114.9115.160.006 0 C 21.0511.053.240.114 7残差2.2770.32失拟项0.2730.0910.180.902 8纯误差240.50总误差73.9416 R 2=0.929 8，R 2 Adj=0.898 6

表3 回归模型的方差分析（原料保留率为响应值）
Table3 Variance analysis of the regression mode (raw retention rate as response vaalluuee))

方差来源平方和自由度均方F值P值模型45.7395.0832.66＜0.000 1 A料液比0.08810.0880.570.476 0 B酶解时间22.65122.65145.57＜0.000 1 C酶添加量12.35112.3579.39＜0.000 1 AB0.0910.091.210.531 2 AC0.1810.181.190.311 7 BC4.2014.2027.010.001 3 A 23.9413.9425.310.001 5 B 21.4111.419.040.019 7 C 21.2411.247.980.025 6残差1.0970.16失拟项0.3330.110.590.652 3纯误差0.7540.19总误差46.8216 R 2=0.946 8，R 2 Adj=0.860 4

为检验这两个模型的有效性，对其进行方差分析和显著性检验，结果见表2、3。可以看出，两个模型的P=0.000 2和P＜0.000 1，说明这两个模型高度显著；失拟项的P=0.902 8＞0.05和P=0.652 3＞0.05，不显著；对白度值和原料保留率回归方程检验，两个模型的相关系数分别为R 2=0.929 8＞0.9和R 2=0.946 8＞0.9，说明模型拟合程度良好；变异系数分别为0.93%和0.48%，说明两个模型都能很好地反应真实试验值。因此可用这两个模型对鱿鱼须酶法脱皮效果进行分析预测。

分析这两个模型各个系数P值，因素A、B、C、 BC、B 2对白度值影响极显著（P＜0.01），因素A 2、AB、AC对白度值影响显著（P＜0.05）；因素B、C、BC、A 2对原料保留率影响极显著（P＜0.01），因素B 2、C 2对原料保留率的影响显著（P＜0.05）；3个因素对酶解脱皮效果的影响顺序为：酶添加量（C）＞酶解时间（B）＞料液比（A）。

通过回归模型绘制试验因素之间的交互作用的响应面图，如图5～7所示。结合模型和响应面曲线图分析获得秘鲁鱿鱼须酶法脱皮较理想的工艺参数为：料液比171∶200、酶解时间20 min、酶添加量0.25%。为了实际操作方便，选取料液比17∶20、酶解时间20 min、酶添加量0.25%，在此条件下，进行6次重复验证性实验，得白度值为63.95±0.31、原料保留率为（81.22±0.28）%，与回归方程所得的白度值64.08和原料保留率81.29%的相对标准偏差分别为0.20%和0.09%，说明通过响应面优化得到的最佳工艺参数有效、可靠，能较好预测产品的白度值与原料保留率。同时，感官评定表明获得的鱿鱼须皮肉完全分离，色泽洁白明亮，肉质与原料基本上无差异，满足消费者的感官要求。

图5 料液比和酶解时间对白度值和原料保留率影响的响应面图
Fig.5 Responsible surface plots for whiteness and raw retention rate affected by solid-to-liquid ratio and hydrolysis times

图6 料液比和酶添加量对白度值和原料保留率影响的响应面图
Fig.6 Responsible surface plots for whiteness and raw retention rate affected by solid-to-liquid ratio and enzyme dosage

图7 酶解时间和酶添加量对白度值和原料保留率影响的响应面图
Fig.7 Responsible surface plots for whiteness and raw retention rate affected by hydrolysis time and enzyme dosage

表4 样品的TVB-N含量和质构分析
Table4 TVB-N content and textural analysis of control and treated samples

注：同列不同字母表示差异显著（P＜0.05）。

处理样品TVB-N含量/（mg/100 g）硬度/g弹性/mm咀嚼性/mJ胶黏性/g内聚性酶解前的鱿鱼须21.28±0.33 a12.43±2.35 a1.36±0.29 a7.98±2.77 a5.72±1.01 a0.47±0.04 a酶解后的鱿鱼须27.60±0.34 b11.08±2.04 a1.11±0.11 a5.73±0.39 a5.45±0.54 a0.48±0.05 a

图8 酶解前后鱿鱼须肌肉组织切片显微镜图（×200）200
Fig.8 Micrographs of muscle slices of control and treated samples (×200)

表4为脱皮前后样品的鲜度指标和质构特性，在GB 2733—2005《鲜、冻动物性水产品卫生标准》 [23]中规定头足类TVB-N含量不大于30 mg/100 g，表4显示酶法脱皮会使鱿鱼鲜度指标TVB-N含量显著升高（P＜0.05），但仍在国标规定的范围内，表明获得的秘鲁鱿鱼须酶法脱皮工艺可行。与脱皮前的样品相比，脱皮后的鱿鱼须硬度、弹性、咀嚼性、胶黏性均有一定的下降，而内聚性有微弱的升高，但均无显著变化（P＞0.05）。图8为酶解前后的样品组织石蜡切片，可看出脱皮前后的样品肌纤维大小均一、形状规则、直径与间距相似，结构均致密而紧凑，两者无明显变化，与表4结果相一致，进一步说明该脱皮工艺条件对鱿鱼须的质构影响不显著。

3 结论

本研究以白度值和原料保留率为响应值，比较了几种蛋白酶对秘鲁鱿鱼须的脱皮效果，确定胰酶为优选酶。在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken设计进行酶法脱皮工艺优化，获得的模型显著性高、拟合度好，并获得较理想的酶法脱皮工艺参数为：料液比17∶20（g/mL）、酶解时间20 min、加酶量0.25%。此时样品的白度值和原料保留率分别为63.95±0.31和（81.22±0.28）%，TVB-N含量为（27.60±0.34） mg/100 g且符合GB 2733—2005的规定，脱皮前后样品的质构特性与肌纤维组织均无显著变化。结果表明此工艺既能较好的脱去鱿鱼须的黑皮，又能保持其作为再加工原料的本有特性和较高的原料保留率，能满足企业的实际需求。

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Optimization of Enzymatic Deskinning of Squid Tentacles Using Response Surface Methodology and Measurement of Textural Properties

LUO Chunyan 1′WANG Zhentao 1′FU Pengcheng 1′LOU Minjie 1′CHEN Lingling 1′FANG Xubo 1′2′YUAN Gaofeng 1′2′CHEN Xiao’e 1′2′*
(1. School of Food and Pharmacy Zhejiang Ocean University Zhoushan 316022′China; 2. Joint Key Laboratory of Zhejiang Province for the Research of Fishery Processing Technology Zhoushan 316022′China)

Abstract：Response surface methodology was used to optimize the enzymatic deskinning parameters for squid tentacles Dosidicus gigas feet were hydrolyzed by various proteases to select the optimum enzyme on the basis of whiteness and raw material retention Combination of single factor method and Box-Behnken design was used to investigate the effects of important hydrolysis parameters on whiteness and raw material retention Total volatile basic nitrogen (TVB-N)′texture and microstructure were measured to compare freshness and textual properties The results indicated that the two regression models developed in this study could better indicate the relationship between factor levels and response values and the optimum conditions for enzymatic deskinning were determined as follows pancreatin dosage′0.25%; solid-to-liquid ratio′17:20 (g/mL); and hydrolysis time′20 minutes Under these conditions whiteness and raw material retention rates were 63.95 ± 0.31 and (81.22 ± 0.28)%′respectively and TVB-N value was (27.60 ± 0.34) mg/100 g with no significant changes observed in textural properties or muscle fiber tissue The TVB-N value of the deskinned sample was in line with the requirement of GB 2733—2005 Hygienic Standard for Fresh and Frozen Marine Products of Animal Origin The sample had bright color and was springy with high raw material retention The process could meet the requirement of actual production.

Key words：Dosidicus gigas tentacles enzymatic deskinning response surface methodology texture characteristics

基金项目：国家级大学生创新创业训练计划项目（201310340009）；浙江省自然科学基金项目（LY12C20006）

作者简介：罗春艳（1993—），女，本科生，研究方向为水产品加工。E-mail：992351360@qq.com

*通信作者：陈小娥（1968—），女，教授，博士，研究方向为海洋生物资源综合利用。E-mail：xiaoechen@163.com

响应面优化鱿鱼须酶法脱皮工艺及其质构特性

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结 论

3 结论