李亚辉，马艳弘*，黄开红，张宏志
（江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏 南京 210014）
摘 要：利用响应面法对超声波辅助果胶酶提取黑莓酒渣中花色苷的条件进行了优化，并通过测定所提花色苷的抗氧化能力和对细菌生长的影响，评价其生物活性。结果显示，当料液比1∶15（g/mL）、超声波功率300 W、pH 4.5时，最佳提取条件为加酶量0.30%、提取温度48 ℃、提取时间20 min，此条件下花色苷提取量为4.70 mg/g，比酸化乙醇法提高了14.08%；所提花色苷具有一定的抗猪油氧化能力、羟自由基清除能力和较强的1′1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除能力，并可有效抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长。
关键词：黑莓酒渣；花色苷；超声波；果胶酶；生物活性
黑莓又名覆盆子，是新兴的第三代水果。黑莓商业化栽培始于欧洲和北美，于1986年由江苏省中科院植物研究所首次引入中国 [1-2]。目前我国黑莓种植面积约占世界种植面积的1/5，其中江苏省黑莓种植面积约占我国种植面积的80% [1′3]。黑莓具有较高营养价值，尤其花色苷含量丰富 [4-6]，其具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗癌、降血糖、降血压、保护血管和减缓衰老等多种功效 [5′7-12]。
新鲜黑莓保质期短、不易储存，因此对其进行深加工是黑莓产业发展的必由之路。黑莓果酒最大限度的保留了其营养和生物活性物质，是黑莓深加工的重要途径之一。酒渣是果酒酿造中重要的副产物，直接排放不仅污染环境，而且造成资源浪费。黑莓酒渣中含有大量的花色苷，和其目前被用作肥料或动物饲料相比，从中提取花色苷可大大提高其应用和经济价值。目前，关于浆果类花色苷的提取国内外已有较多报道，提取方法主要为有机溶剂萃取法，除此之外还有超临界CO 2萃取法、酶法、发酵法、微波辅助和超声波辅助法等 [13-17]。花色苷存在于植物细胞液中，被细胞壁和细胞膜包裹难于溶出 [13]。超声波的机械作用可破坏细胞壁和细胞膜的结构，加速内容物的溶出；果胶酶可破坏植物细胞壁，提高细胞壁和细胞膜的通透性，也可加速花色苷的溶出 [18-19]。目前，关于黑莓果实花色苷的提取及活性研究虽已有报道 [4′8-11]，但对于黑莓酒酿造中副产物黑莓酒渣中花色苷的研究还鲜有报道。因此，本实验利用超声波辅助果胶酶法提取黑莓酒渣中花色苷，通过响应面优化其提取条件，并对所提花色苷的抗氧化性和抑菌活性进行初步研究。这对黑莓资源的综合利用和黑莓产业的持续发展具有重要意义。
1.1 材料与试剂
黑莓酒渣由句容万山红遍生物科技有限公司提供。
果胶酶（5万 U/g） 无锡明辉国际贸易有限公司化工分公司；猪油 南京某菜市场；大肠杆菌、金黄色葡萄球菌 实验室保存；VC、硫酸亚铁、水杨酸、过氧化氢 天津科密欧试剂公司；其他试剂均为市售分析纯。
1.2 仪器与设备
KQ-2500E型超声波清洗器 昆山禾创仪器有限公司；UV-3802H紫外-可见分光光度仪 上海尤尼柯仪器有限公司；真空冷冻干燥机 上海比朗仪器制造有限公司；R-120型旋转蒸发器 瑞士Büchi公司；pH酸度计 梅特勒-托利多公司；DHG-9070电热鼓风干燥箱 上海齐欣科学仪器有限公司；HH-2数显恒温水浴锅 国华电器有限公司；培养箱、超净工作台 苏州苏净净化设备厂。
1.3 方法
1.3.1 黑莓酒渣前处理
取新压榨分离的黑莓酒渣，用鼓风干燥箱40 ℃烘12～15 h。将烘干的酒渣放入粉碎机粉碎并用200 目筛网过滤，然后置于棕色瓶内在4 ℃条件下密封保存备用。
1.3.2 黑莓酒渣花色苷的提取
超声波辅助果胶酶法提取：将黑莓酒渣干粉按一定料液比加入到蒸馏水中，复水30 min，调节pH值，加入果胶酶0.30%（m/m），超声辅助提取，获得花色苷提取液。将提取液抽滤后在40 ℃真空旋转蒸发至体积约10～15 mL，然后—80 ℃冷冻24 h，最后冷冻干燥即得花色苷粗提物干品。
酸化乙醇法提取：参照王秀菊等 [20]优化的蓝莓酒渣中花色苷的提取条件进行提取。以含1% HCl的70%乙醇溶液为提取溶剂，其他条件为料液比1∶25（g/mL）、提取温度70 ℃、提取时间60 min。
1.3.3 花色苷含量的测定
参照宋德群等 [21]报道的pH示差法测定提取花色苷的含量。计算公式为：
式中：ρ为花色苷提取量/（mg/g）；A 0、A 1分别为pH 1.0、pH 4.5时花色苷在520 nm波长处的吸光度；V为提取液总体积/mL；n为稀释倍数；M为矢车菊色素-3-葡萄糖苷的相对分子质量，449；ε为矢车菊色素-3-葡萄糖苷的消光系数，29 600；m为样品质量/g。
1.3.4 单因素试验
按照1.3.2节所述超声波辅助果胶酶法，分别研究在料液比1∶10、超声波功率400 W、pH4.0、加酶量0.2%、提取温度50 ℃和提取时间40 min条件下，改变单一因素对花色苷提取量的影响，单因素试验水平如下：料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL），超声波功率100、200、300、400、500 W，pH 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，加酶量0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，提取温度30、40、50、60、70℃，提取时间10、20、30、40、50 min。每个单因素试验平行重复3 次，结果取平均值。
1.3.5 响应面试验设计
在单因素试验结果基础上，选择料液比1∶15（g/mL）、超声波功率300 W、pH 4.5，采用Box-Behnken试验设计，以加酶量、提取温度和提取时间3 个因素为自变量，进行响应面分析，以—1、0、1分别代表自变量的低、中、高3 个水平，试验因素水平设计见表1。
表1 响应面试验设计因素与水平
Table1 Factors and levels used in response surface methodology
水平因素X 1加酶量/%X 2提取温度/℃X 3提取时间/min—1 0.24020 0 0.35030 1 0.46040
1.3.6 黑莓酒渣花色苷的抗氧化性分析
1.3.6.1 抗油脂氧化能力测定
参照李颖畅等 [22]所述方法，称取黑莓酒渣花色苷粗提物，按0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%添加量加入到50 g猪油中进行实验，空白组不加花色苷粗提物，阳性对照组加相同质量浓度的VC，每个样品重复3 次。
1.3.6.2 1′1-二苯基-2-三硝基苯肼（1′1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力测定
参照Atoui等 [23]所述方法，分别取1 mL质量浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的黑莓酒渣花色苷溶液进行实验，空白组用水代替样品，对照组用同等质量浓度的VC代替，每个样品重复3 次。
1.3.6.3 羟自由基清除能力测定
参照李颖畅等 [24]所述方法，分别取1 mL质量浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的黑莓酒渣花色苷溶液进行实验，空白组用水代替样品，对照组用同等质量浓度的VC代替，每个样品重复3 次。
1.3.7 黑莓酒渣花色苷的抑菌活性分析
参照韩永斌等 [25]所述方法，将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别培养至对数生长中期，按5%接种量分别接种于100 mL LB液体培养基中，对照组中不添加花色苷，实验组添加不同量花色苷，使其终质量浓度分别为0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL。37 ℃培养，24 h后取样在600 nm波长处测定其吸光度（A）。每个样品重复3 次。
1.4 数据分析
利用SPSS 18.0和Design-Expert V8.0软件进行数据处理及统计分析。
2.1 单因素试验结果
表2 料液比对花色苷提取量的影响
Table2 Effects of solid/liquid ratio on the extraction yield of anthocyanins
注：不同字母表示差异显著（P＜0.05）。下同。
料液比（g/mL）1∶51∶101∶151∶201∶25花色苷提取量/（mg/g）2.40±0.05 c3.50±0.07 b4.00±0.09 a4.08±0.08 a4.10±0.07 a
如表2所示，随着溶剂用量的增加，花色苷提取量逐渐升高，当料液比为1∶25、1∶20和1∶15时，花色苷提取量无显著差异，因此选择1∶15为最佳料液比。
表3 超声波功率对花色苷提取量的影响
Table3 Effects of ultrasonic power on the extraction yield of anthocyanins
超声波功率/W100200300400500花色苷提取量/（mg/g）3.01±0.08 c3.50±0.05 b4.08±0.07 a4.16±0.04 a4.18±0.05 a
如表3所示，随着超声波功率的增加，花色苷提取量逐渐增加，当功率为300、400、500 W时，花色苷提取量无显著差异，因此选择300 W为最佳提取功率。
表4 pH值对花色苷提取量的影响
Table4 Effects of pH on the extraction yield of anthocyanins
pH3.03.54.04.55.0花色苷提取量/（mg/g）2.97±0.04 d3.35±0.08 c3.95±0.05 b4.26±0.03 a4.18±0.05 a
如表4所示，当提取液pH值小于4.5时，花色苷提取量随pH值的升高逐渐升高，pH 5.0时，花色苷提取量开始降低，因此选择pH 4.5为提取液最佳pH值。
表5 加酶量对花色苷提取量的影响
Table5 Effects of enzyme dosage on the extraction yield of anthocyanins
加酶量/%0.10.20.30.40.5花色苷提取量/（mg/g）3.98±0.06 b4.22±0.08 b4.51±0.05 a4.49±0.07 a4.54±0.04 a
如表5所示，随着加酶量的增大，花色苷提取量逐渐增大，但当加酶量大于0.3%时花色苷提取量没有显著差异，所以选择最佳加酶量为0.3%。
表6 提取温度对花色苷提取量的影响
Table6 Effects of extraction temperature on the extraction yield of anthocyanniinnss
提取温度/℃3040506070花色苷提取量/（mg/g）3.81±0.07 b4.02±0.06 a4.11±0.04 a3.88±0.05 b3.76±0.06 b
如表6所示，50 ℃时提取量最高，选为最佳提取温度；60、70 ℃时提取量降低可能是因为高温使酶变性，其活力下降造成的。
表7 提取时间对花色苷提取量的影响
Table7 Effects of extraction time on the extraction yield of anthocyanins
提取时间/min1020304050花色苷提取量/（mg/g）3.45±0.09 c3.98±0.05 b4.23±0.07 a4.25±0.06 a4.27±0.08 a
如表7所示，随着提取时间的延长，花色苷提取量逐渐增大，当提取时间大于30 min时提取量没有显著差异，所以选择30 min为最佳提取时间。
2.2 响应面优化试验结果
2.2.1 回归模型的建立及其显著性检验
表8 响应面试验设计及结果
Table8 Design and results of response surface methodology
花色苷提取量/（mg/g）试验值预测值10—114.63±0.114.61 20114.58±0.094.56 30—1—14.76±0.074.77 4—1—104.34±0.104.37 501—14.80±0.094.83 61014.62±0.124.61 70004.79±0.084.83 80004.71±0.074.68 91104.89±0.114.83 100004.63±0.094.65 11—1104.55±0.134.52 1210—14.44±0.124.45 131—104.70±0.084.73 14—10—14.52±0.094.51 15—1014.61±0.144.61试验号X 1加酶量X 2提取温度X 3提取时间
响应面试验结果及其预测值如表8所示（3 次重复）。对表中试验数据进行多元回归拟合，获得花色苷提取量对自变量的二次多项回归模拟方程如下：
Y=14.437X 1＋0.140X 2—1.625×10 —3X 3—0.018X 1X 2＋4.129×10 —16X 1X 3—7.500×10 —5X 2X 3—23.000X 12—1.375×10 —3X 2 2＋5.000×10 —5X 3
2—0.603
式中：Y表示花色苷提取量；X 1、X 2、X 3分别为加酶量、提取温度和提取时间的编码值。利用该方程所得预测值与试验值较为接近，说明该方程合理、拟合度高。
表9 回归模型方差分析
Table9 ANOVA of response surface modelmodel
来源平方和自由度均方F值P值X 1加酶量4.512×10 —314.512×10 —31.770 0.240 5 X 2提取温度0.022 10.022 8.660 0.032 1* X 3提取时间4.512×10 —314.512×10 —31.770 0.240 5 X 1X 21.225×10 —311.225×10 —30.4800.518 7 X 1X 3—2.220×10 —161—2.220×10 —16—8.725×10 —141.000 0 X 2X 32.250×10 —412. 250×10 —40.0880.778 2 X 10.200 10.200 76.7500.000 3** X2 2 9.231×10 —519.231×10 —50.036 0.856 4模型 0.28090.032 12.4300.006 3**残差0.013 52.545×10 —3失拟项5.325×10 —331.775×10 —30.4800.729 3误差7.400×10 —323.700×10 —3总离差 0.30014 0.07010.070 27.430 0.003 4** X3 22
如表9所示，提取温度（X 2）对花色苷提取量影响显著（P＜0.05），加酶量二次项（X 1 2）和提取温度二次项（X 2 2）对花色苷提取量影响极显著（P＜0.01），说明提取温度对花色苷提取量具有较大影响，加酶量对其有一定影响，而提取时间对其影响较小。所得模型极显著（P＜0.01），失拟项不显著（0.729 3），且表8中预测值与试验值较接近，说明该回归模型合理，可很好解释响应值。
2.2.2 响应面分析及优化
图1 加酶量和提取温度对黑莓酒渣花色苷提取量影响的响应面图
Fig.1 Response surface plot showing the effects of enzyme amount and extraction temperature on the yield of anthocyanins extracted from blackberry wine pomace
图2 加酶量和提取时间对黑莓酒渣花色苷提取量影响的响应面图
Fig.2 Response surface plot showing the effects of enzyme amount and
extraction time on the yieldo f anthocyanins extracted from blackberry wine pomace
图3 提取温度和提取时间对黑莓酒渣花色苷提取量影响的响应面图
Fig.3 Response Surface plot showing the effects of extraction temperature and time on the yield of anthocyanins extracted from blackberry wine pomace
由图1～3可看出，任何两个交互因素的响应面都存在最高点，加酶量和提取温度对花色苷提取量的影响较大，而提取时间对其影响较小。通过Design-Expert V8.0软件分析得到黑莓酒渣中花色苷的最佳提取条件为加酶量0.30%、提取温度48.39 ℃、提取时间20 min，在此提取条件下黑莓酒渣中花色苷提取量的预测值为4.86 mg/g。为了验证该响应面结果的可行性，对所得最佳条件进行了优化和验证实验。在加酶量、提取温度和提取时间分别为0.30%、48 ℃和20 min条件下进行5 次实验，所得花色苷提取量平均值为4.70 mg/g，标准偏差为0.07 mg/g，说明该条件下试验结果稳定；与预测值的相对误差为3.29%，说明该响应面结果可靠。
2.3 超声波辅助果胶酶法与酸化乙醇法的比较
利用优化的超声波辅助果胶酶法提取黑莓酒渣中花色苷提取量为（4.70±0.11） mg/g，与常用的酸化乙醇法所得提取量（4.12±0.06） mg/g相比提高了14.08%。这可能是因为花色苷存在于黑莓皮渣细胞内部的液泡中，果胶酶酶解掉黑莓细胞壁中的果胶，促使细胞破裂；另外，超声波的空化效应和振动作用，也促使黑莓细胞破裂；同时，超声波还有助于果胶酶与细胞壁中果胶充分结合和作用 [18-19]。因此在果胶酶和超声波的双重作用，大大加速了黑莓细胞壁的溶解和细胞的破裂，从而促进了细胞内部花色苷的溶出。
2.4 黑莓酒渣中花色苷的抗氧化性分析
图4A显示的是花色苷的抗猪油氧化能力测定结果，随着花色苷添加量的增加，其抗猪油氧化的能力逐渐增强；添加量为0%～0.8%时，随着添加量的增加，其抗氧化能力增加较快，添加量大于0.8%时其对猪油的抗氧化能力达到最大；和VC相比，其抗猪油氧化能力略小于同等添加量条件下VC。图4B、4C分别显示的是提取花色苷的羟自由基清除能力和DPPH自由基清除能力测定结果。随着花色苷质量浓度的增加，其羟自由基清除能力和DPPH自由基清除能力均逐渐增强；花色苷质量浓度在0～0.4 mg/mL时，随着质量浓度的增加，其羟自由基和DPPH自由基清除能力增加较快，质量浓度大于0.4 mg/mL时两清除率均达70%以上；和同质量浓度的VC相比其羟自由基清除率略小，而其DPPH自由基清除率略大。这些结果说明黑莓酒渣中花色苷具有一定的抗猪油氧化能力、羟自由基清除能力和较强的DPPH自由基清除能力。
图4 黑莓酒渣中花色苷的抗氧化性
Fig.4 Anti-oxidant activity of anthocyanins extracted from blackberry wine pomace
2.5 黑莓酒渣中花色苷的抑菌活性分析
图5 黑莓酒渣花色苷对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌生长的抑制作用
Fig.5 Inhibitory effects of anthocyanins from blackberry wine pomace on growth of E. coli and Staph. aureus
由图5可知，接种于LB液体培养基培养24 h后，随着培养基中花色苷质量浓度的增加，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的A 600 nm值均逐渐减小，在0～1.2 mg/mL质量浓度范围内金黄色葡萄球菌的A 600 nm值下降更为明显；金黄色葡萄球菌和大肠杆菌在花色苷质量浓度分别大于1.2 mg/mL和1.6 mg/mL时，A 600 nm值接近于0（说明其没有生长）。这些结果说明了黑莓酒渣中花色苷对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有一定的抑制作用；对金黄色葡萄球菌的最低抑制质量浓度为1.2 mg/mL，对大肠杆菌的最低抑制质量浓度为1.6 mg/mL；在一定质量浓度范围内对金黄色葡萄球菌的抑制作用要明显于对大肠杆菌的抑制作用。
响应面优化超声波辅助果胶酶法提取黑莓酒渣中花色苷得：当料液比1∶15（g/mL）、超声波功率300 W、pH 4.5时，最佳提取条件为果胶酶添加量0.30%、提取温度48 ℃、提取时间20 min，此条件下花色苷提取量为4.70 mg/g，和常用的酸化乙醇法相比提高了14.08%。所提花色苷具有一定的抗猪油氧化能力、羟自由基清除能力和较强的DPPH自由基清除能力，并可有效抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长。此研究对提高黑莓酿酒副产物的经济价值和促进黑莓产业的发展具有重要意义。
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Ultrasonic-Assisted Enzymatic Extraction and Bioactivity Assessment of Anthocyanins from Blackberry Wine Pomace
LI Yahui MA Yanhong*′HUANG Kaihong ZHANG Hongzhi
(Institute of Farm Product Processing Jiangsu Academy of Agricultural Sciences Nanjing 210014′China)
Abstract：This study was focused on applying response surface methodology to optimize the ultrasonic-assisted enzymatic hydrolysis of blackberry wine pomace using pectinase for anthocyanins extraction The bioactivity of the extracted anthocyanins was also evaluated with respect to antioxidant and antibacterial activities Results showed that the optimum extraction conditions were determined as follows enzyme dosage′0.30%; extraction temperature′48 ℃; extraction time′20 min solid-to-liquid ratio′1:15 (g/mL); ultrasonic power′300 W and pH′4.5. Under these conditions the anthocyanins yield was 4.70 mg/g which was improved by 14.08% compared to that obtained by acidified ethanol extraction The anthocyanins extracted from blackberry wine pomace exhibited a good antioxidant activity by inhibiting lard oxidation and scavenging 1′1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH and hydroxyl radicals and exerted potent inhibition on E. coli and Staph. aureus.
Key words：blackberry wine pomace anthocyanins ultrasonic pectinase biological activity
中图分类号：S567.2
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2015）06-0063-06
doi：10.7506/spkx1002-6630-201506012
收稿日期：2014-08-14
基金项目：江苏省博士后基金项目（1302057B）；江苏省自然科学基金项目（BK2012786）
作者简介：李亚辉（1985—），男，助理研究员，博士，主要从事食品生物技术研究。E-mail：liqianhao217@126.com
*通信作者：马艳弘（1972—），女，副研究员，博士，主要从事食品功能因子开发利用研究。E-mail：ma_yhhyy@126.com