响应面法优化藻油中抗氧化剂的复配组合

吕军伟 1′2，杨贤庆 1′*，林婉玲 1，李来好 1，马海霞 1，魏涯 1

（1.中国水产科学研究院南海水产研究所，国家水产品加工技术研发中心，农业部水产品加工重点实验室，广东广州 510300；2.上海海洋大学食品学院，上海 201306）

摘要：为了提高藻油氧化稳定性，对添加在藻油中的抗氧化剂组合进行优化。利用Box-Behnken试验设计并结合响应面分析法，以迷迭香粉（≥30%鼠尾草酸）、VE、VC棕榈酸酯添加量为试验因素，以藻油过氧化值（peroxide value，POV）、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）值及二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）含量为响应值，并进行二次回归设计建立模型，得到的最佳抗氧化剂组合为：迷迭香粉0.37‰、VE 0.11‰、VC棕榈酸酯0.20‰。该优化条件下藻油经过12 d烘箱实验后测得POV为9.26 meq/kg，TBA为0.35 mg/kg，DHA含量为30.27%，其与模型预测值相吻合，表明所建立的回归模型是切实可行的。

二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）有脑黄金之称，隶属于ω-3系列多不饱和脂肪酸。当前鱼油和藻类是DHA提取的主要来源，但从鱼油中提取的DHA有腥味、胆固醇含量高，且受污染率较高，而DHA藻油恰好克服了鱼油的这些弱点，且具有培养周期短、生长速率快、生物积累量高、营养价值高及占地面积少等优点 [1-2]。DHA具有明目抗癌、健脑益智、消炎以及抗衰老等功能特性，在生理学、医学等研究领域具有非常广泛的应用 [3-10]。DHA为高度不饱和脂肪酸，对温度、光照、空气、金属离子等外界因素很敏感，极易被氧化，氧化后产物对身体有一定危害作用。抗氧化剂是防止食品氧化变质的一种食品添加剂，能为易氧化物质提供氢原子，捕获并中和自由基，从而延缓食或防止食品被氧化。因此，通过添加抗氧化剂防止油脂被氧化是经济、实用的方法。目前油脂中常用的抗氧化剂有叔丁基羟基茴香醚（butylated hydroxyanisole，BHA）、叔丁基对苯二酚（tertiary butylhydroquinone，TBHQ）、二叔丁基羟基甲苯（butylated hydroxytoluene，BHT）、没食子酸丙酯（propyl gallate，PG）等，这些抗氧化剂价格低廉，但安全性受到质疑 [11-13]，在婴幼儿食品及保健领域受到限制，所以天然抗氧化剂的使用是当前食品抗氧化领域发展的一种必然。另外多项研究 [14-15]表明，复合抗氧化剂的使用效果明显优于单一抗氧化剂的抗氧化作用。因此，本实验在借鉴抗氧化剂国家限量标准使用范围的基础上，以过氧化值（peroxide value，POV）、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）值和DHA含量作为油脂氧化稳定性的评价指标，采用Box-Behnken试验设计并结合响应面分析法对3 种抗氧化剂迷迭香粉、VE和VC棕榈酸酯的复配组合进行优化，探究其对藻油稳定性的影响。

1 材料与方法

DHA藻油广东润科生物工程有限公司；迷迭香粉（≥30%鼠尾草酸）广州三元科技有限公司；VE 日本TCI公司；VC棕榈酸酯广州齐云公司；三氟化硼-甲醇溶液上海安谱科学仪器有限公司；铁粉、氯化亚铁、三氯甲烷、硫氰酸钾、甲醇、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、氢氧化钾等均为分析纯。

GC-MS-QP2010气相色谱-质谱联用仪日本岛津公司；紫外分光光度计上海美谱达公司；电热恒温鼓风干燥箱上海一恒科技有限公司。

参考GB/T 5009.37—2003《食用植物油卫生标准的分析方法》测定POV [16]。

试验各个因素水平值的设计是参考GB/T 2760—2011《食用植物油卫生标准的分析方法》及相关文献[20]对各个添加剂使用限量的规定进行，在国标理论值范围内选取最优抗氧化剂组合。依据Box-Behnken试验设计原理，选取迷迭香粉、VE及VC棕榈酸酯添加量3 个因素为试验因素，以POV、TBA值以及DHA含量为响应值，设计三因素三水平响应面优化试验。根据试验设计方案分别添加不同组合的抗氧化剂于藻油中，然后将各样品置于60 ℃烘箱中加速氧化12 d后测定POV、TBA值和DHA含量。

2 结果与分析

表1 响应面试验设计与结果
Table1 Results of response surface experimentsments

试验号A 迷迭香粉添加量/‰Y 3DHA含量/% 10.30.075 0.07513.090.3622.18 20.30.20.07511.340.5324.67 30.40.20.12510.9 20.5826.24 40.40.1250.07512.390.6223.19 50.30.20.212.570.3623.83 60.30.0750.210.740.6027.16 70.30.1250.1259.510.4829.94 80.20.0750.12514.820.7919.87 90.30.1250.1259.720.4329.13 100.20.20.12513.580.6321.39 110.20.1250.212.120.5924.05 120.40.1250.28.850. 2930.12 130.40.0750.12511.030.4526.79 140.30.1250.12510.080.4428.17 150.20.1250.07514.520.7121.01 B VE添加量/‰C VC 棕榈酸酯添加量/‰Y 1POV/（meq/kg）Y 2TBA值/（mg/kg）

依据表1数据，用软件 Design-Expert对以上结果回归分析并建立回归模型，得到各试验因素对响应值的回归方程如下：

Y 1=37.27—100.35A—95.14B—54.64C＋37.67AB—38.00AC＋159.11BC＋142.63A 2＋247.33B 2＋137.56C 2

Y 2=2.04—6.56A—6.36B＋0.84C＋9.67AB—7.00AC—4.44BC＋8.75A 2＋13.33B 2＋2.67C 2

Y 3=—20.18＋178.69A＋178.58B＋96.95C—69.00AB＋129.67AC—258.67BC—268.75A 2—501.33B 2—320.00C 2

表2 POV方差分析
Table2 Variance analysis off PPOOVV

注：**.极显著（P＜0.01）；*.显著（P＜0.05）。下同。

方差来源平方和自由度均方F值P值显著性模型42.6794.746.840.023 8* A迷迭香粉添加量17.55117.5525.340.004 0** B VE添加量0.2010.200.290.612 7 C VC棕榈酸酯添加量6.2316.238.990.030 1* AB0.3210.320.460.527 4 AC0.3210.320.470.523 9 BC3.2013.204.630.084 2 A 27.5117.5110.840.021 6* B 27.1517.1510.320.023 7* C 22.2112.213.190.134 1残差3.4650.69失拟项3.3031.1013.230.071 1误差0.1720.083总和46.1314

由表2可知，POV模型回归显著（P＜0.05）且失拟项不显著（P＞0.05），R 2为0.924 9，表明该方程拟合良好。在因素水平范围内，各因素对藻油POV的影响排序为：A＞C＞B。POV模型中A的一次项高度显著，C的一次项显著，A、B的二次项对POV的影响显著，表明各试验因素对响应值并不是简单的线性关系，二次项对响应值也有一定的关系。

表3 TBA值方差分析
Table3 Variance analysis of TBA valuevalue

方差来源平方和自由度均方F值P值显著性模型0.2390.0255.920.031 9* A迷迭香粉添加量0.07210.07216.970.009 2** B VE添加量0.02110.0214.970.076 9 C VC棕榈酸酯添加量0.05610.05613.190.015 0* AB0.02110.0214.940.076 8 AC9.025×10 —319.025×10 —32.120.205 1 BC2.500×10 —312.500×10 —30.590.478 0 A 20.03010.0307.030.045 4* B 20.01910.0194.560.085 8 C 21.131×10 —311.131×10 —30.270.628 2残差0.02154.255×10 —3失拟项0.02036.625×10 —39.460.097 1误差1.400×10 —327.000×10 —3总和0.2514

由表3可知，TBA值模型回归显著（P＜0.05）且失拟项不显著（P＞0.05），R 2为0.914 6，说明该方程拟合良好。在因素水平范围内，各因素对藻油TBA值的影响排序为：A＞C＞B。TBA模型中A的一次项高度显著，C的一次项显著，A的二次项对TBA值影响显著，表明各因素对响应值并不是简单的线性关系，二次项对响应值也有一定的关系。

表4 DHA含量方差分析
Table4 Variance analysis of DHA contentntent

方差来源平方和自由度均方F值P值显著性模型147.73916.4110.550.009 2** A迷迭香粉添加量50.10150.1032.210.002 4** B VE添加量2.112×10 —312.112×10 —31.358×10 —30.972 0 C VC棕榈酸酯添加量24.89124.8916.000.010 3* AB1.0711.070.690.444 4 AC3.7813.782.430.179 6 BC8.4718.475.440.066 9 A 226.67126.6717.150.009 0** B 229.36129.3618.880.007 5** C 211.96111.967.690.039 2*残差7.7851.56失拟项6.2132.072.640.287 0误差1.5720.79总和155.5114

由表4可知，DHA含量模型回归极显著（P＜0.01）且失拟项不显著（P＞0.05），R 2为0.950 0，显示该方程拟合良好。在因素水平范围内，各因素对藻油响应值的影响排序为：A＞C＞B。在DHA含量模型中A的一次项高度显著，C的一次项显著，A、B的二次项对DHA含量的影响高度显著，C的二次项对响应值影响显著，表明各验因素对响应值并不是简单的线性关系，二次项对响应值也有一定的关系。因此，有必要探究两因素间的交互作用。

根据各因素对响应值所构成的三维曲面图，可直观反映各个因素对其响应值的影响，响应图中曲线越陡峭，则表明相对应因素对响应值的影响越大，响应值变化越大 [21]；响应图中等高线形状也可以直观反映出两因素之间交互作用大小，等高线呈现椭圆形体现两因素交互效应显著，而圆形则说明因素间交互作用较弱 [22-23]，等高线和响应面整体趋势图有一致性。各因素对POV、TBA值、DHA含量的影响见图1～3。

图1a、2a、3a显示当VC棕榈酸酯质量分数一定时，迷迭香粉和VE的加入量对POV、TBA值及DHA含量的交互影响。迷迭香质量分数一定时，VE质量分数为0.05‰～0.14‰之间时，POV、TBA值随VE质量分数增加而下降，DHA含量随其质量分数增加而升高，当VE质量分数超过0.14‰时，随着VE质量分数增加，POV、TBA值呈升高趋势，DHA含量呈下降趋势；当VE质量分数一定时，迷迭香质量分数增加，POV、TBA值随其下降，DHA含量增加，交互作用较为显著。

图1b、2b、3b显示当VE质量分数一定时，迷迭香粉和VC棕榈酸酯加入量对POV、TBA值及DHA含量的交互影响。VC棕榈酸酯质量分数一定时，随着迷迭香质量分数的增加，POV、TBA值先下降后上升，DHA含量先升高后下降，变化趋势相对比较平缓；当迷迭香粉质量分数一定时，随着VC棕榈酸酯质量分数的变化，POV、TBA值及DHA含量没有明显变化，说明两因素间交互作用不显著。

图1c、2c、3c显示当迷迭香粉质量分数一定时，迷迭香粉和VE的加入量对POV、TBA值及DHA含量的交互影响。VE质量分数一定时，随着VC棕榈酸酯质量分数的增加，POV、TBA值下降，DHA含量升高，变化速率比较快，曲线陡峭；当VC棕榈酸酯质量分数一定时，VE质量分数为0.05‰～0.14‰区间时，POV、TBA值呈下降趋势，DHA含量呈升高趋势；当VE质量分数大于0.14‰时，随着VC棕榈酸酯质量分数增加，POV、TBA值随其升高，DHA含量下降，交互作用显著。

图1～3直观地体现了各因子间的交互作用。从响应面的极值点和等高线可以看出，在所取范围内存在极值，其是响应面的最高点也是等高线椭圆的中心点。对图1～3综合分析可知，B（VE添加量）和C（VC棕榈酸酯添加量）、A（迷迭香粉添加量）和B（V E添加量）两组对应的响应曲面比较陡峭，且等高线呈扁平或椭圆状，表明这两组因素间的交互作用比较大；A（迷迭香粉添加量）和C（VC棕榈酸酯添加量）两因素在图1和图2对应的响应曲面相对比较平缓，图中等高线倾向圆形形状，虽图3中对应响应曲面较为陡峭，但3 个模型综合分析表明两因素间的交互作用不大。

图1 两因素交互作用对POV影响的响应面图和等高线图
Fig.1 Response surface and contour plots for the effect of antioxidant combinations on POV

图2 两因素交互作用对TBA值影响的响应面图和等高线图
Fig.2 Response surface and contour plots for the effect ofantioxidant combinations on TBA value

图3 两因素交互作用对DHA含量影响的响应面图和等高线图
Fig.3 Response surface and contour plots for the effect of antioxidant combinations on DHA content

表5 响应值优化添加量
Table5 Optimal antioxidant concentrations for response values

组别迷迭香粉添加量/‰VE添加量/‰VC棕榈酸酯添加量/‰理论值1 0.360.100.19POV为8.949 86 meq/kg 2 0.380.110.20TBA值为0.320 15 mg/kg 3 0.380.110.20DHA含量为34.33%

从表5可知，3 个响应值取得最佳优化结果时3 个影响因素添加量近似，表明3 个模型之间有一定相关性。为了检测模型方程的可信度和适用性，对此条件进行验证实验，得最佳添加量为：迷迭香粉0.37‰、VE 0.11‰、VC棕榈酸酯0.20‰，理论上得到的POV为9.03 meq/kg，TBA值为0.33 mg/kg，DHA含量为30.35%，实际测得POV为9.26 meq/kg，TBA值为0.35 mg/kg，DHA含量为30.17%，结果基本跟预测值保持一致，明显优于空白组（未添加任何添加剂）藻油稳定性指标：POV为23.95 meq/kg，TBA值为1.12 mg/kg，DHA含量为21.60%，说明该模型有一定实用价值。

3 结论

本实验依据Box-Behnken试验设计原理对藻油中抗氧化剂添加量进行了响应面优化，建立了POV、TBA值和DHA含量与3 个抗氧化剂添加量的二次多项式回归模型，且模型经验证可靠合理。得到的最优添加量组合为：迷迭香粉0.37‰、VE 0.11‰、VC棕榈酸酯0.20‰，该优化条件下藻油经过12 d烘箱实验后测得过POV为9.26 meq/kg，TBA值为0.35 mg/kg，DHA含量为30.27%，有效延长了藻油货架期。因此，采用响应面法优化藻油中抗氧化剂组合稳定可行，对生产实践有一定的指导意义。

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Optimization of Antioxidant Combinations for Algal Oil by Response Surface Methodology

L Junwei 1′2′YANG Xianqing 1′*′LIN Wanling 1′LI Laihao 1′MA Haixia 1′WEI Ya 1
(1. Key Laboratory of Aquatic Product Processing Ministry of Agriculture National Research and Development Center for Aquatic Product Processing South China Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences Guangzhou 510300′China; 2. College of Food Science and Technology Shanghai Ocean University Shanghai 201306′China)

Abstract：The concentrations of rosemary powder (containing 30% or more carnosic acid)′VE and VC added together to algal oil for improved oxidative stability were optimized using Box-Behnken experimental design combined with response surface analysis based on peroxide value (POV)′thiobarbituric acid (TBA value and docosahexaenoic acid (DHA content A quadratic regression model was established The optimal combination of the three antioxidants was 0.37‰ rosemary spices′0.11‰ VE and 0.20‰ VC palmitate The POV value was 9.26 meq/kg TB A value 0.35 mg/kg and DH A content 30.27% under the optimized conditions after 12 day of accelerated oven-oxidation test A good agreement was observed between the predicted and actual values indicating that the established model in this study is feasible.

基金项目：海洋经济创新发展区域示范专项（GD2012-A01）；国家海洋局海洋公益性行业科研专项（201005020）

作者简介：吕军伟（1988—），男，硕士研究生，研究方向为水产品加工与质量安全。E-mail：389399231@qq.com

*通信作者：杨贤庆（1963—），男，研究员，博士，研究方向为水产品加工与质量安全。E-mail：yxqgd@163.com

响应面法优化藻油中抗氧化剂的复配组合

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结 论

3 结论