花蛤中糖胺聚糖的分离与结构鉴定

摘要：目的：以花蛤为提取原料，用多酶水解法提取花蛤中糖胺聚糖，利用红外光谱法对提取物中的硫酸软骨素的结构进行分析。采用超高效液相色谱与电喷雾-质谱联用技术对糖胺聚糖类组分进行研究。方法：色谱柱ACQUITY UPLC BEH Amide（2.1 mm×100 mm，1.7 ☒m）；保护柱ACQUITY UPLC BEH Amide VanGuard（2.1 mm×5 mm，1.7 ☒m）；流动相乙腈-水（体积分数0.2%冰醋酸）的体积比为75∶25；流速0.1 mL/min；进样20 μL。结果：超高效液相色谱-电喷雾-质谱法可快速定性分离糖胺聚糖组分。结论：本实验为糖胺聚糖化合物的结构鉴定提供了一种有效的分析方法。

关键词：花蛤；糖胺聚糖；硫酸软骨素；超高效液相色谱-电喷雾-质谱；红外光谱

糖胺聚糖（glycosaminoglycans，GAGs），也叫黏多糖、硫酸酯多糖、结缔组织多糖，为杂多糖的一种，主要存在于高等动物结缔组织中，植物中也有发现。GAGs是动物中蛋白聚糖的糖链部分，是多聚阴离子，为长链不分支的糖，具有羧基和硫酸基团 [1]，是一类由重复的二糖结构单元组成的带有负电荷的长链大分子物质 [2]。常见的GAGs有透明质酸、硫酸软骨素、硫酸角质素、硫酸皮肤素、肝素和硫酸乙酰肝素等。GAGs分子是呈酸性的，其原因是GAGs分子中含有己糖醛酸并连有硫酸基团。GAGs因具有抗凝血、抗肿瘤、抗病毒、降血脂、增强免疫等生理活性 [3-6]，已成为学术界瞩目的一类生物高分子。近年来，国内外对大西洋鳐 [7]、海星 [8]、扇贝 [9]等的GAGs进行了研究。贝类在提取过程中，主要采用酶进行酶解 [10-12]，以酶解产物为原料提取GAGs，进而测定GAGs的含量。

近年来，超高效液相色谱（ultra high performance liquid chromatography UPLC）作为一种新兴的色谱分析手段，被广泛应用到与质谱联用中 [13]，且UPLC具有高速、高分离度、低消耗等特点 [14]，特别是针对GAGs的结构分析 [15]，更具有显著的优势。张小军 [16]利用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法对GAGs的二糖结构进行了分析。GAGs的定量分析方法主要以比色法 [17]、HPLC法和电泳法为主 [18-19]。本实验采用UPLC-电喷雾-质谱（UPLC-electrospray-mass spectrometry，UPLC-ESI-MS）联用技术对扇贝GAGs的结构进行研究，为进一步开发贝类多糖提供理论依据。

1 材料与方法

硫酸软骨素标准样品美国阿拉丁公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶生工生物工程（上海）股份有限公司；枯草杆菌中性蛋白酶北京索莱宝科技有限公司；花蛤粉末自制；乙腈为色谱纯，色谱实验用水均为超纯水，其他所用试剂均为分析纯。

高速台式离心机上海安亭科学仪器厂；十万分之一分析天平 Sartorius科学仪器（北京）有限公司；AE200S万分之一天平梅特勒-托利多仪器有限公司；Acquity UPLC超高压液相色谱仪、Acquity UPC2质谱检测器美国Waters公司；Vertex70傅里叶红外光谱仪德国Brüker公司。

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH Amide（2.1mm× 100 mm，1.7 ☒m）；保护柱：ACQUITY UPLC BEH Amide VanGuard（2.1 mm×5 mm，1.7 ☒m）；采用二元线性梯度洗脱：流动相A为体积分数0.2%冰醋酸溶液；流动相B为乙腈；流动相梯度组成列于表1；流速0.1 mL/min；柱温25 ℃；进样量20 ☒L。

表1 高效液相色谱流动相比例
Table1 Solvent composition of HPLC mobile phase hase

时间/min体积分数0.2%冰醋酸溶液/%乙腈/%曲线0 2575 2 2575线性505050线性

电喷雾离子源（负离子）；质量扫描范围m/z 100～1 000；毛细管电压3.80 kV；锥孔电压25.00 V；锥孔气流量45 L/h；提取电压2.00 V；离子源温度150℃；脱溶剂气温度300℃；脱溶剂气流量300 L/h。

称取花蛤粉末5.000 g，以固液比1∶3（g/mL）的比例溶于蒸馏水。先后用质量分数1.3%胃蛋白酶、质量分数1.4%胰蛋白酶、质量分数0.9%枯草杆菌蛋白酶进行酶解。酶解后取酶解液加入体积分数60%乙醇进行醇沉24 h。醇沉后取沉淀用乙醇、丙酮交替洗脱3 次干燥得硫酸软骨素。将硫酸软骨素配制成质量分数5%糖液，用稀碱将pH值调至2.0，去沉淀，再将pH值调至7.0去沉淀。上清液透析48 h。加入体积分数5%无水NaAc溶液和1.5 倍体积分数95%乙醇，使醇量达60%，醇沉24 h。弃上清液，沉淀干燥后得GAGs-1。将GAGs-1配制成1%糖液，透析48 h，加入乙醇-乙酸钠试剂，使乙醇量达60%，醇沉24 h。弃上清液，沉淀干燥后得GAGs-2。GAGs-2置于4 ℃条件下保存备用。

硫酸软骨素钠标准储备液的配制：准确称取标准样品0.004 g，用1.4%复合酶酶解，4 ℃贮存备用。

2 结果与分析

取硫酸软骨素二糖储备液于1 cm比色皿中，以0.1 mol/L Tris-HAc（pH 9.1）缓冲液为参比，扫描测定波长180～600 nm的紫外-可见吸收曲线，得到化合物的紫外-可见吸收光谱。硫酸软骨素的最大吸收波长在228 nm处，因此本实验选择228 nm为硫酸软骨素二糖的检测波长。

花蛤中提取的GAGs酶解液的HPLC图，如图1所示，在实验色谱条件下得以分离，经与标样对比，确定峰3为硫酸软骨素。

图1 样品的液相色谱图
Fig.1 HPLC chromatogram of GAGs extracted from hard clams

硫酸软骨素标准样品ΔDi-4S、ΔDi-6S的质谱图见图2。图1中峰1、2的质谱图见图3。

图2 标准样品ΔDi-4S（A）、ΔDi-6S（B）的质谱图
Fig.2 MS spectra of ΔDi-4S and ΔDi-6S standards

图3 样品酶解产物峰1（A）、2（B）的质谱图
Fig.3 MS spectra of peaks 1 and 2 of the enzymatic hydrolysate of hard clams

图2 中硫酸软骨素二糖电离后产生的分子离子峰，m/z 458是单硫酸二糖的准分子离子峰[M—H] —，ΔDi-4S（ΔGlcUA-[1→3]-GalNAc-4S）、ΔDi-6S（ΔGlcUA-[1→3]-GalNAc-6S）由于质量数均为459，因此难以通过准离子峰将其区分开来，其差别主要体现在碎片离子上。Begona等 [19]对这2 种硫酸软骨素二糖的质谱研究表明，ΔDi-4S的特征碎片峰表现为离子丰度m/z 300大于m/z 282或不存在m/z 282，而ΔDi-6S的特征碎片峰表现为离子丰度m/z 282大于m/z 300或不存在m/z 300。对于本实验，ΔDi-4S和ΔDi-6S的质谱碎片峰同样表现出以上特征。ΔDi-4S的质谱图中m/z 300丰度较高但不含m/z 282，ΔDi-6S的质谱图中m/z 282丰度较高，大于m/z 300。图3A中仅出现m/z 300，而无m/z 282，正是ΔDi-4S特征的体现；而图3B中仅出现m/z 282，而无m/z 300，体现出ΔDi-6S特征。结果表明，通过质谱分析可实现花蛤中GAGs的结构鉴定。

对花蛤GAGs提取物在500～4 000 cm —1波数范围内扫描测试，其结构分析结果如图4。在波数3 429 cm —1附近有强吸收，说明有多糖羟基（—OH）；在2 927cm —1波数处有吸收，说明有—CH 3的C—H伸缩振动；在1 639cm —1附近有强吸收，说明有乙酰氨基（—NHCOCH 3—）的存在；在波数1 418 cm —1附近有吸收，说明有羧基（—COO —）存在；在波数1 264 cm —1附近有吸收，说明有硫酸基（—O—SO 3—）存在；在波数700.82 cm —1说明在氨基己糖上有硫酸酯键的连接。以上现象均说明该提取物具备硫酸软骨素的基本特征 [20-22]。花蛤GAGs的红外光谱图分析的官能团见表2。由图4、表2分析可知，花蛤GAGs含有羟基、酰胺基、硫酸基、氨基。

图4 花蛤提取物的红外光谱测定
Fig.4 IR spectrum of hard clam extract

表2 花蛤GAGs红外光谱图分析
Table2 IR spectral analysis of GAGs extracted from hard clams

红外吸收波数/cm —1振动方式官能团3 429 2 927 1 639 1 537 1 418 1 376 1 264 822 1 167、1 043、1 119—OH键伸缩振动—CH键伸缩振动C＝O伸缩振动N—H变角振动—C—O—伸缩振动C＝O伸缩振动S＝O对称伸缩振动C—O—S伸缩振动（赤道配位）C—O伸缩振动糖类的—OH红外—CH 3酰胺基氨基—COO—O—SO 3——C—O—C—

用800 mg/L硫酸软骨素标准溶液，依次稀释为400、200、100、50 mg/L和25 mg/L，在选定的检测条件下，分别由低质量浓度向高质量浓度进样分析。以峰面积对应软骨素质量浓度ρ（mg/L）作线性回归，得回归方程为ρ=0.23A＋0.39，相关系数为0.999 9；说明硫酸软骨素在25～400 mg/L质量浓度范围内，具有良好的线性关系。并由色谱峰面积计算可得ΔDi-4S的质量分数为3.5%，ΔDi-6S的质量分数为2.3%。

3 结论

GAGs是生物组织中重要的活性大分子，通过酶解方法提取其有效成分，获得GAGs种类、结构、性质等方面的信息 [23]，对研究其生物学性质至关重要 [24-25]。本研究采用UPLC-ESI-MS联用技术对花蛤中GAGs类组分进行分离与结构鉴定，方法行之有效，利于批量样品的快速分离与测定。

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Separation and Structure of Glycosaminoglycans from the Hard Clam Meretrix meretrix

LIN Jianyuan JIA Kangming LI Yao
(College of Biological and Environmental Sciences Zhejiang Wanli University Ningbo 315100′China)

Abstract：Objective To extract glycosaminoglycans (GAGs from hard clams (Meretrix meretrix by multi-enzymatic hydrolysis and to analyze the structure of chondroitin sulfate in the extract by infrared (IR spectroscopy Methods The components of GAGs were examined by ultra high performance liquid chromatography-electrospray-mass spectrometry (UPLC-ESI-MS using an ACQUITY UPLC BEH Amide chromatographic column (2.1 mm × 100 mm′1.7 ☒m and an ACQUITY UPLC BEH Amide VanGuard guard column (2.1 mm × 5 mm′1.7 ☒m). The mobile phase was composed of a mixture of water and methanol (75:25′V/V containing 0.2% glacial acetic acid at a flow rate of 0.1 mL/min The injection volume was set as 20 μL Results Rapid separation of the components was achieved and their structures were determined by UPLC-ESI-MS Conclusion This paper provides an effective method to identify the structure of GAGs.

Key words：hard clams glycosaminoglycans chondroitin sulfate ultra high performance liquid chromatographyelectrospray-mass spectrometry (UPLC-ESI-MS); infrared spectroscopy (IR)

基金项目：浙江省科技厅分析测试项目（2012C37026）；浙江省现代微生物技术与应用重中之重学科资助项目（ZS2013010）

作者简介：林建原（1965—），女，副教授，硕士，研究方向为天然产物提取及分析检测。E-mail：linjianyuan33@163.com

花蛤中糖胺聚糖的分离与结构鉴定

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结 论

3 结论