鸭肉蛋白源抗氧化肽的酶法制备工艺

王璐莎1,张首玉2,黄 明1,*,周光宏1

(1.南京农业大学食品科技学院,农业部畜产品加工重点实验室,江苏 南京 210095;2.河南职业技术学院烹饪食品系,河南 郑州 450046)

摘 要:以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除率为指标,采用响应曲面法(response surface methodology,RSM)优化胃蛋白酶制备鸭肉抗氧化肽的最佳酶解工艺条件。结果表明:以底物质量浓度、酶与底物质量比和酶解时间为自变量,以DPPH自由基清除率为响应值,得到的回归方程拟合度高(R2=0.995 7,R2Adj=0.992 7)。其中酶与底物质量比对DPPH自由基清除率的影响最大,其次是酶解时间,底物质量浓度的影响最小。胃蛋白酶的最优酶解工艺条件为底物质量浓度10.89 g/100 mL、酶与底物质量比0.013%、酶解时间3.54 h,此时DPPH自由基清除率的理论值可达84.23%,通过优化验证实验测得,在最优酶解条件下,DPPH自由基清除率的实际值为(83.57±0.20)%。

关键词:鸭肉;胃蛋白酶;抗氧化肽;DPPH自由基清除率;响应曲面

研究发现机体内过多的自由基会破坏核酸、蛋白质和脂质等大分子物质的结构和功能,使机体细胞和组织产生严重的氧化损伤,从而诱发一些疾病的发生,如动脉粥样硬化、关节炎、糖尿病、老年痴呆症和癌症等[1-3]。自由基也是导致油脂氧化的重要原因之一,而油脂的氧化会改变食品的风味、色泽和质地等感官品质,甚至会产生有毒有害物质,最终导致食品变质而无法食用。因此抗氧化剂的研究具有重要的意义。目前一些人工合成的抗氧化剂如二丁基羟基甲苯(butylated hydroxytoluene,BHT)、丁基羟基茴香醚(butylated hydroxyanisole,BHA)、特丁基对苯二酚(tertbutylhydroquinone,TBHQ)等已在食品中广泛使用,但这些物质具有一定的副作用,会威胁人体健康;一些天然抗氧化剂因成本过高或对食品感官有影响,在使用上存在着局限性[4-5]。因此急需寻找一种安全健康高效的抗氧化剂。

目前,用动植物蛋白制备抗氧化肽已成为了研究热点,这种抗氧化肽被认为是安全的。此外它还具有低成本、低分子质量、高活性、稳定性高和易吸收等特点[3]。抗氧化肽可通过动植物蛋白酸解、酶解或微生物发酵获得。酶解法因具有快捷、可控、便于重复等优点成为了制备抗氧化肽的主要方法[6]。已有研究者通过酶解大豆[7]、玉米[8]、花生[9]、酪蛋白[10]、猪皮[11]、蓝园鲹[12]、草鱼[13]、沙丁鱼[14]、鱿鱼[15]、鳕鱼[5]、鸡肉[16]等动植物蛋白而获得了抗氧化肽,并证实它们具有较强的抗氧化性。

我国是世界上最大的鸭肉生产国,根据联合国粮食及农业组织(Food and Agriculture Organization of the United Nations,FAO)的统计数据显示,2012年我国鸭肉产量约为300 万t,约占全世界的69%,位居世界第一位。鸭肉的营养价值很高,可食用部分蛋白质含量约为16%~25%[17]。目前用来制备动物蛋白源抗氧化肽的蛋白主要为各种鱼类蛋白,以鸭肉为蛋白源的抗氧化肽研究在国内还很少,因此酶解鸭肉蛋白来制备抗氧化肽具有一定的研究和应用价值。

该研究的主要目的是探讨鸭肉蛋白源抗氧化肽的酶法制备工艺条件,以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除能力作为评价指标,选用胃蛋白酶为工具酶,经单因素试验和响应曲面法(response surface methodology,RSM)优化抗氧化肽的制备条件,以期为深入研究酶法制备抗氧化肽及相关产品的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

樱桃谷鸭 江苏省南京市苏果超市。

胃蛋白酶1∶3 000(Amresco 0685,3 000~3 500 NFU/mg) 美国Amresco公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基 梯希爱(上海)化成工业发展有限公司;其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

C-MAG HS7数显加热磁力搅拌器、匀浆机 德国IKA公司;HH-W恒温水浴箱 恒丰仪器制造有限公司;GRINDOMIX GM200刀式混合研磨仪 德国Retsch公司;pH计 瑞士Mettle Toledo公司;M2e酶标仪美国MD公司;Avanti J-E高速离心机 美国Beckman Coulter公司;KjeltecTM2300全自动凯氏定氮仪 瑞典FOSS公司;Hitachi L-8900A氨基酸自动分析仪 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 酶解产物制备工艺流程

宰杀鸭子→取胸肉与腿肉→去除脂肪与筋腱→绞碎(2 000 r/min,10 s)→煮制使蛋白适度变性(90 ℃,10 min)→加甘氨酸-HCl缓冲液(pH 2.0)匀浆→加胃蛋白酶→恒温酶解→灭酶(调pH 7.0,再沸水浴10 min)→离心取上清液(7 000 r/min,15 min)→测DPPH自由基清除率与三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)可溶性蛋白(短肽)含量

1.3.2 常规理化指标测定

总蛋白质含量:参照GB 5009.5—2010《食品中蛋白质的测定》中的凯氏定氮法测定;水分含量:参照GB 5009.3—2010《食品中水分的测定》中常压干燥法测定;灰分含量:参照GB 5009.4—2010《食品中灰分的测定》中的干法灰化法测定;脂肪含量:参照GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的测定》中索氏抽提法测定。1.3.3 氨基酸分析

参照GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的测定》的方法将鸭肉用6 mol/L盐酸,在110 ℃真空条件下水解24 h,酸解后的样品采用氨基酸自动分析仪Hitachi L-8900A进行氨基酸含量测定。

1.3.4 酶解条件的单因素试验设计

1.3.4.1 不同底物质量浓度对DPPH自由基清除率以及TCA可溶性蛋白(短肽)含量的影响

底物质量浓度设为3、5、8、10、13、15、18、20 g/100 mL,酶与底物(鸭肉)质量比0.01%,pH 2.0,37 ℃恒温反应3 h,离心取上清液测TCA可溶性蛋白(短肽)含量和DPPH自由基清除率。

1.3.4.2 不同的酶与底物质量比对DPPH自由基清除率以及TCA可溶性蛋白(短肽)含量的影响

酶与底物(鸭肉)质量比设为0、0.003%、0.005%、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%,底物质量浓度10 g/100 mL,pH 2.0,37 ℃恒温反应3 h,离心取上清液测TCA可溶性蛋白(短肽)含量和DPPH自由基清除率。

1.3.4.3 不同酶解时间对DPPH自由基清除率以及TCA可溶性蛋白(短肽)含量的影响

酶解时间设为0.5、1、2、3、4、5、6、7 h,底物质量浓度10 g/100 mL,酶与底物(鸭肉)质量比0.01%,pH 2.0,37 ℃恒温反应,离心取上清液测TCA可溶性蛋白(短肽)含量和DPPH自由基清除率。

1.3.5 酶解条件的响应曲面试验设计

在单因素试验的基础上,选择底物质量浓度(X1)、酶与底物质量比(X2)、酶解时间(X3)为试验因子,以DPPH自由基清除率为响应值,利用三元二次回归旋转组合设计进行酶解条件的优化。

1.3.6 DPPH自由基清除率的测定

参照Cumby等[18]的方法并稍做修改。具体方法为将DPPH自由基溶解于甲醇中,配制成质量浓度为0.101 5 g/L的溶液。其中样品组为500 μL酶解产物(3 mg/mL)与500 μL DPPH自由基溶液在室温下避光反应30 min,在517 nm波长处测其吸光度,记为A1;对照组1为500 μL酶解产物(3 mg/mL)与500 μL甲醇在517 nm波长处的吸光度,记为A2;对照组2为500 μL蒸馏水与500 μL DPPH自由基溶液在517 nm波长处的吸光度,记为A3;调零组为500 μL甲醇与500 μL蒸馏水在517 nm波长处的吸光度。

1.3.7 TCA可溶性蛋白(短肽)含量的测定

一般功能性肽含有2~20 个氨基酸残基,分子质量小于6 000 D[3],因此可认为功能性肽可溶解于TCA中。TCA可溶性蛋白(短肽)含量的测定方法参照Jang等[19]的方法并稍做修改。将10 mL酶解液与等量的20% TCA混合后离心(3 000×g,5 min),取上清液与双缩脲试剂在室温下反应30 min,然后在540 nm波长处测其吸光度,根据该吸光度对照标准曲线得到的值即为10% TCA可溶性蛋白质量浓度。样品中总蛋白含量用凯氏定氮法测定。

1.4 数据处理

实验重复3 次,采用SAS 8.1软件进行统计分析,用One-Way ANOVA方法进行方差分析,采用Duncan’s multiple range test进行多重比较,显著水平设为P<0.05,应用Design-Expert 7.0.0进行响应曲面优化试验设计。

2 结果与分析

2.1 常规理化指标和氨基酸分析

鸭肉肉糜(湿样)经测定各组分含量为:总蛋白质含量(22.00±0.49)%、水分含量(74.60±0.59)%、灰分含量(1.43±0.08)%、脂肪含量(1.35±0.05)%。结果表明鸭肉的蛋白含量较高,适合用来蛋白质酶解。

表1 鸭肉氨基酸组成
Table 1 Amino acids composition of duck meat

注:a. 必需氨基酸。

氨基酸名称含量/(mg/100 g) 氨基酸名称 含量/(mg/100 g)Asp+Asn 1 927.67±88.56 Ilea 964.33±48.54 Thra 979.33±50.01 Leua 1 724.67±80.13 Ser 867.33±44.06 Tyra 790.00±33.51 Glu+Gln 3 539.33±225.50 Phea 924.33±39.93 Gly 945.33±14.01 Lysa 1 921.33±93.09 Ala 1 276.67±47.75 His 621.67±56.50 Cys 106.33±23.97 Arg 1 431.67±59.34 Vala 1 030.00±44.58 Pro 742.67±13.58 Meta 600.33±29.54 总计 20 393.00

如表1所示,鸭肉的氨基酸组成合理,必需氨基酸的总量所占比例为43.82%,其中Lys和Leu含量最高,分别占总蛋白质的9.42%和8.46%,对婴儿来说也是必需氨基酸的His含量占总蛋白质的3.05%。鸭肉富含Glu、Gln、Asp、Asn、Lys、Leu、Arg和Ala。研究发现一些特定氨基酸的存在(如Glu、Asp、 Lys、Leu和Ala)能够增强肽的抗氧化性。Lys、Asp和Glu因其侧链有氨基或羧基而具有螯合金属离子或清除自由基的作用[20]。Leu的侧链具有很强的疏水性,提高抗氧化肽的油溶性,并使肽能够很好的通过磷脂双分子层,在细胞内发挥抗氧化作用[21]。因此鸭肉蛋白是一种用来制备抗氧化肽的优质原料。

选用胃蛋白酶作为工具酶来水解鸭肉蛋白制备抗氧化肽。胃蛋白酶在对蛋白或多肽进行水解时,具有一定的氨基酸特异性,其酶切位点主要为氨基端或羧基端为Phe、Trp和Tyr的肽键[22]。研究发现Phe、Trp和Tyr对肽的抗氧化性做出了贡献,因为Trp、Tyr分别含有吲哚基、酚羟基,能够作为电子供体而起到清除自由基的作用[3],Guo Hang等[23]研究发现肽链中含有Trp、Tyr的寡肽表现出很强的自由基清除能力。用胃蛋白酶水解得到的一些肽在其氨基端或羧基端含有Phe、Trp或Tyr,因此这些肽很可能具有很强的抗氧化性。

2.2 酶解条件的单因素试验

2.2.1 不同底物质量浓度的影响

图1 不同底物质量浓度对DPPH自由基清除率以及TCA可溶性蛋白含量的影响
Fig.1 Effect of substrate concentration on DPPH radical scavenging rate and TCA-soluble peptide yield

由图1可知,不同底物质量浓度对DPPH自由基清除率和TCA可溶性蛋白(短肽)含量都有显著的影响(P<0.01)。底物质量浓度为3~10 g/100 mL时,DPPH自由基清除率和TCA可溶性蛋白(短肽)含量都显著增加,之后两者都有下降的趋势。原因可能为底物质量浓度的增加有利于其有效占据酶的活性中心,增加敏感肽键的数量,加快酶反应速率,有利于增加抗氧化肽的数量[24]。但当底物质量浓度过高时,过多的底物聚集在酶分子表面,形成了一种酶活性的中间产物,抑制了酶解作用[25],同时过高的底物质量浓度会降低有效水分浓度,从而降低了酶和底物的扩散运动,最终降低了酶解作用[26]。通过综合考虑,选择底物质量浓度为10 g/100 mL。

2.2.2 不同酶与底物质量比的影响

由图2可知,酶与底物质量比对DPPH自由基清除率和TCA可溶性蛋白(短肽)含量都有显著影响。随着酶与底物质量比的增加(0~0.01%),TCA可溶性蛋白(短肽)含量和DPPH自由基清除率都显著增加(P<0.01),但继续增加酶与底物的质量比,TCA可溶性蛋白(短肽)含量和DPPH自由基清除率都有下降的趋势。这可能是因为在底物分子充足的条件下,增加酶用量可提高底物与酶的结合,从而加快反应速率,此时酶与底物质量比越高,TCA可溶性蛋白(短肽)含量就越大,得到的抗氧化肽就越多。但当酶与底物质量比超过0.01%时,底物已被完全饱和,酶过量,具有抗氧化活性的肽链被降解为无活性的氨基酸或二肽,所以表现出了TCA可溶性蛋白(短肽)含量和DPPH自由基清除率下降的迹象。通过综合考虑,确定最佳酶与底物质量比为0.01%。

图2 不同酶与底物质量比对DPPH自由基清除率以及TCA可溶性蛋白含量的影响
Fig.2 Effect of enzyme-to-substrate ratio on DPPH radical scavenging rate and TCA-soluble peptide yield

2.2.3 不同酶解时间的影响

图3 不同酶解时间对DPPH自由基清除率以及TCA可溶性蛋白含量的影响
Fig.3 Effect of hydrolysis time on DPPH radical scavenging rate and TCA-soluble peptide yield

由图3可知,不同酶解时间对DPPH自由基清除率和TCA可溶性蛋白(短肽)含量都有显著影响(P<0.01),并且DPPH自由基清除率和TCA可溶性蛋白(短肽)含量两者的变化呈正相关(R2=0.910 7)。在0~3 h时,随着时间的延长,DPPH自由基清除率和TCA可溶性蛋白(短肽)含量都增加。酶解时间为3 h时,DPPH自由基清除率达到最大值(73.01±2.53)%;3 h过后,DPPH自由基清除率和TCA可溶性蛋白(短肽)含量都下降。这可能是因为反应初期,底物质量浓度较高,水解较快,产生的活性肽增加,从而使DPPH自由基的清除活性迅速增强;但随着反应的进行,具有抗氧化活性的长链肽被再一次降解,从而使抗氧化活性下降[27]。通过综合考虑,确定最佳反应时间为3 h。

2.3 酶解条件的响应曲面试验

2.3.1 响应曲面试验结果

表2 响应曲面试验设计与结果
Taabblle 2 Design program and experimental results of RSM

试验号因素 Y DPPH自由基清除率/% TCA可溶性蛋白含量/% X1底物质量浓度/(g/100 mL)X2酶与底物质量比/% X3酶解时间/h 1 1(11) 1(0.013) 1(3.6) 84.01±2.52 5.30±0.09 2 1 1 -1(2.4) 77.49±3.03 4.03±0.34 3 1 -1(0.007) 1 73.81±1.73 3.57±0.31 4 1 -1 -1 64.15±2.29 2.54±0.11 5 -1(9) 1 1 79.89±2.32 4.71±0.23 6 -1 1 -1 75.51±2.42 4.18±0.35 7 -1 -1 1 72.73±1.25 3.49±0.19 8 -1 -1 -1 64.11±2.79 2.37±0.16 9 1.682(12) 0(0.010) 0(3.0) 79.11±1.96 4.42±0.11 10 -1.682(8) 0 0 75.28±2.43 4.04±0.21 11 0(10) 1.682(0.015) 0 80.85±1.53 4.82±0.61 12 0 -1.682(0.005) 0 62.26±1.31 2.22±0.91 13 0 0 1.682(4.0) 80.94±2.28 4.97±0.30 14 0 0 -1.682(2.0) 69.57±2.67 3.07±0.25 15 0 0 0 79.83±2.51 4.49±0.16 16 0 0 0 80.08±3.21 4.59±0.23 17 0 0 0 80.04±1.45 4.63±0.19 18 0 0 0 79.13±0.62 4.51±0.18 19 0 0 0 79.65±2.52 4.50±0.24 20 0 0 0 80.92±2.38 4.71±0.20 21 0 0 0 80.08±1.70 4.55±0.15 22 0 0 0 79.42±0.69 4.61±0.13 23 0 0 0 80.34±0.53 4.65±0.32

响应曲面试验方案及结果如表2所示。用Design-Expert 7.0.0软件进行分析,得到方差分析结果(表3)和DPPH自由基清除率(Y)对底物质量浓度(X1)、酶与底物质量比(X2)、酶解时间(X3)的二次多项回归模拟方程:Y=-122.84+17.97X1+8 021.46X2+33.35X+207.50XX+0.66XX-512.50XX-1.05X2

312132313.38×105X2-4.83X2

23

方差分析表明,该回归模型极显著(P<0.01),失拟度不显著(P失拟=0.507 1>0.05)。模型的决定系数R2=0.995 7,校正拟合度R2Adj=0.992 7,展望拟合度R2=0.984 2,展望拟合度和校正拟合度相差不大,且模

pred型的信噪比较大,为64.03,说明模型拟合度与可信度都很高,试验误差小,可用该回归模型代替试验真实点对试验结果进行分析。

表3 DPPH自由基清除率试验结果方差分析
Table 3 ANOVA for DPPH radical scavenging rate

注:P<0.01表示差异极显著;P<0.05表示差异显著。

变异来源 平方和 自由度 均方 F值 P值模型 800.50 9 88.94 333.01 <0.000 1 X1 13.67 1 13.67 51.17 <0.000 1 X2 394.11 1 394.11 1 475.59 <0.000 1 X3 170.84 1 170.84 639.62 <0.000 1 X1X2 3.10 1 3.10 11.61 0.004 7 X1X3 1.26 1 1.26 4.73 0.048 6 X2X3 6.81 1 6.81 25.49 0.000 2 X1 2 17.57 1 17.57 65.80 <0.000 1 X2 2 147.40 1 147.40 551.87 <0.000 1 X3 2 47.97 1 47.97 179.61 <0.000 1残差 3.47 13 0.27失拟 1.28 5 0.26 0.93 0.507 1总变异 803.97 22

由表3可知,一次项底物质量浓度(X1)(P<0.000 1)、酶与底物质量比(X2)(P<0.000 1)、酶解时间(X3)(P<0.000 1)对DPPH自由基清除率具有极显著的影响。由回归方程的各系数可知,酶与底物质量比(X2)对DPPH自由基清除率贡献最大,其次是酶解时间(X3)、底物质量浓度(X1)的贡献最小,但X1、X2、X3对酶解产物清除DPPH自由基都产生了正效应影响。交互项X1X2(P=0.004 7<0.01)、X2X3(P=0.000 2<0.01)和二次项X12(P<0.000 1)、X22(P<0.000 1)和X32(P<0.000 1)对DPPH自由基清除 率也具有极显著的影响,这表明各个试验因素对响应值的影响不是简单的线性关系,而是呈二次关系,且3 个因素之间存在着交互作用。

对TCA可溶性蛋白(短肽)含量与DPPH自由基清除率之间进行线性相关性分析,结果为R2=0.980 7,R2=0.979 8,说明TCA可溶性蛋白(短肽)含量与DPPH自

Adj由基清除率之间呈显著正相关。这与Wang Qiukuan等[28]得到的结论相似,对牡蛎蛋白水解产物进行抗氧化测定,发现羟自由基(·OH)清除率随着TCA可溶性蛋白(短肽)含量的增加而增加。这其中的原因可能是随着蛋白质被水解成小肽,一些能与氧化物质反应的氨基酸残基暴露出来[29],而这些小肽在TCA溶液中有较好的溶解性,所以表现出了蛋白水解产物抗氧化活性随着TCA可溶性蛋白(短肽)含量增加而增强的现象。虽然DPPH自由基清除率与TCA可溶性蛋白(短肽)含量之间存在着一定的相关性,但本研究目标产物为DPPH自由基清除能力最强的鸭肉蛋白酶抗氧化肽,因此以DPPH自由基清除率为第一指标,TCA可溶性蛋白(短肽)含量为辅助指标。

2.3.2 各因素对DPPH自由基清除率的影响

图4 底物质量浓度、酶与底物质量比对DPPH自由基清除率的影响
Fig.4 Effect of substrate concentration and enzyme to substrate ratio on DPPH radical scavenging rate

由图4可知,固定时间为中心点水平,当底物质量浓度一定时,随着酶与底物质量比的升高,DPPH自由基清除率先增加后减小,在0.013%左右达到最大值,DPPH自由基清除率下降的原因可能是抗氧化肽被再一次水解;当酶与底物质量比一定时,随着底物质量浓度的增加,DPPH自由基清除率先增加后减小,在11.00 g/100 mL左右达到最大值。

由图5可知,固定酶与底物质量比为中心点水平,当底物质量浓度一定时,随着酶解时间的延长,DPPH自由基清除率先增加后减小,在3.5 h左右达到最大值;当酶解时间一定时,随着底物质量浓度的增加,DPPH自由基清除率先增加后减小,在11.00 g/100 mL左右到达最大值。

图5 底物质量浓度、酶解时间对DPPH自由基清除率的影响
Fig.5 Effect of substrate concentration and hydrolysis time on DPPH radical scavenging rate

图6 酶与底物质量比、酶解时间对DPPH自由基清除率的影响
Fig.6 Effect of enzyme-to-substrate ratio and hydrolysis time on DPPH radical scavenging rate

由图6可知,固定底物质量浓度为中心点水平,当酶解时间较短时,随着酶与底物质量比的增加,DPPH自由基清除率呈上升趋势;当酶解时间较长时,随着酶与底物质量比的增加DPPH自由基清除率先增加后减小,这是因为在水解初期,大量底物蛋白质被迅速水解为肽,抗氧化基团暴露出来并得到积累;随着底物蛋白质的减少,肽含量上升,由于肽链比底物蛋白分子短,灵活性高,更易与蛋白酶接触而进一步被水解,所以有可能使抗氧化肽被进一步水解而使抗氧化能力下降。当酶与底物质量比较小时,随着酶解时间的延长,DPPH自由基清除率呈上升趋势;当酶与底物质量比较大时,随着酶解时间的延长,DPPH自由基清除率先增加后减小。这同样是因为加酶量较多时,酶量相对于底物蛋白质过量,肽分子与底物竞争而被再次水解所致。

2.3.3 优化验证实验

对响应面试验结果用软件进行最优化分析,在酶解pH 2.0,酶解温度37 ℃条件下,以DPPH自由基清除率最大值为评价指标,确定胃蛋白酶的最优酶解条件为底物质量浓度10.89 g/100 mL、酶与底物质量比0.013%、酶解时间3.54 h,此时DPPH自由基清除率的理论值可达84.23%。通过验证实验测得,在最优酶解条件下,DPPH自由基清除率的实际值为(83.57±0.20)%,理论值与实际值的相对误差为0.78%,两者无显著性差异,表明模型可行。

3 结 论

采用单因素试验和响应曲面试验,建立了胃蛋白酶水解鸭肉制备抗氧化肽所需的工艺条件的二次模型,模型拟合度较高。其中酶与底物质量比对DPPH自由基清除率影响最大,其次是酶解时间,底物质量浓度的影响最小,这3 个因素之间的交互作用对DPPH自由基清除率的影响极显著。用胃蛋白酶制备鸭肉蛋白源抗氧化肽的最优酶解工艺条件为底物质量浓度10.89 g/100 mL、酶与底物质量比0.013%、酶解时间3.54 h。

对TCA可溶性蛋白(短肽)含量与DPPH自由基清除率之间进行线性相关性分析,决定系数R2=0.980 7,校正决定系数R2Adj=0.979 8,酶解液的DPPH自由基清除率与TCA可溶性蛋白(短肽)含量呈正相关,即随着TCA可溶性蛋白(短肽)含量的增加,DPPH自由基清除率增加。

参考文献:

[1]URSO M L, CLARKSON P M. Oxidative stress, exercise, and antioxidant supplementation[J]. Toxicology, 2003, 189(1/2): 41-54.

[2]YOU Lijun, ZHAO Mouming, CUI Chun, et al. Effect of degree of hydrolysis on the antioxidant activity of loach (Misgurnus anguillicaudatus) protein hydrolysates[J]. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 2009, 10(2): 235-240.

[3]SARMADI B H, ISMAIL A. Antioxidative peptides from food proteins: a review[J]. Peptides, 2010, 31(10): 1949-1956.

[4]BOUGATEF A, HAJJI M, BALTI R, et al. Antioxidant and free radical-scavenging activities of smooth hound (Mustelus mustelus) muscle protein hydrolysates obtained by gastrointestinal proteases[J]. Food Chemistry, 2009, 114(4): 1198-1205.

[5]CHEUNG I W Y, CHEUNG L K Y, TAN N Y, et al. The role of molecular size in antioxidant activity of peptide fractions from Pacifi c hake (Merluccius productus) hydrolysates[J]. Food Chemistry, 2012, 134(3): 1297-1306.

[6]黄明, 王璐莎. 动物蛋白源抗氧化肽的研究进展[J]. 中国农业科学, 2013, 46(22): 4763-4773.

[7]CHEN Huaming, MURAMOTO K, YAMAUCHI F. Structural analysis of antioxidative peptides from soybean β-conglycinin[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1995, 43: 574-578.

[8]ZHOU Kequan, SUN Shi, CANNING C. Production and functional characterization of antioxidative hydrolysates from corn protein via enzymatic hydrolysis and ultrafiltration[J]. Food Chemistry, 2012, 135(3): 1192-1197.

[9]JAMDAR S N, RAJALAKSHMI V, PEDNEKAR M D, et al. Infl uence of degree of hydrolysis on functional properties, antioxidant activity and ACE inhibitory activity of peanut protein hydrolysate[J]. Food Chemistry, 2010, 121(1): 178-184.

[10]SUETSUNA K, UKEDA H, OCHI H. Isolation and characterization of free radical scavenging activities peptides derived from casein[J]. Journal of Nutritional Biochemistry, 2000, 11(3): 128-131.

[11]LI Bo, CHEN Feng, WANG Xi, et al. Isolation and identification of antioxidative peptides from porcine collagen hydrolysate by consecutive chromatography and electrospray ionization-mass spectrometry[J]. Food Chemistry, 2007, 102(4): 1135-1143.

[12]何婷, 崔春, 龙小涛. 蓝园鲹制备抗氧化肽酶解工艺的研究[J]. 食品科技, 2008, 33(2): 70-74.

[13]任娇艳, 赵谋明, 崔春. 草鱼蛋白源抗氧化肽的分离与鉴定[J]. 食品科学, 2009, 30(13): 13-17.

[14]BOUGATER A, NEDJAR-ARROUME N, MANNI L, et al. Purification and identification of novel antioxidant peptides from enzymatic hydrolysates of sardinelle (Sardinella aurita) by-products proteins[J]. Food Chemistry, 2010, 118: 559-565.

[15]GIMENEZ B, ALEMAN A, MONTERO P. Antioxidant and functional properties of gelatin hydrolysates obtained from skin of sole and squid[J]. Food Chemistry, 2009, 114(3): 976-983.

[16]SUN Yangying, PAN Daodong, GUO Yuxing, et al. Purification of chicken breast protein hydrolysate and analysis of its antioxidant activity[J]. Food and Chemical Toxicology, 2012, 50(10): 3397-3404.

[17]唐婧苗, 刘章武, 杜金平. 酶法水解鸭肉蛋白制备鸭肉肽[J]. 食品研究与开发, 2010, 31(4): 75-78.

[18]CUMBY N, ZHONG Ying, NACZK M, et al. Antioxidant activity and water-holding capacity of canola protein hydrolysates[J]. Food Chemistry, 2008, 109(1): 144-148.

[19]JANG A, LEE M. Purification and identification of angiotensin converting enzyme inhibitory peptides from beef hydrolysate[J]. Meat Science, 2005, 69: 653-661.

[20]WIRIYAPHAN C, CHITSOMBOON B, YONGSAWADIGUL J. Antioxidant activity of protein hydrolysates derived from threadfin bream surimi byproducts[J]. Food Chemistry, 2012, 132(1): 104-111.

[21]KONG Baohua, PENG Xinyan, XIONG Youling, et al. Protection of lung fibroblast MRC-5 cells against hydrogen peroxide-induced oxidative damage by 0.1-2.8 kDa antioxidative peptides isolated from whey protein hydrolysate[J]. Food Chemistry, 2012, 135(2): 540-547.

[22]NELSON D L, COX M M. Lehninger principles of biochemistry[M]. 4th ed. New York: W.H. Freeman, 2004: 100.

[23]GUO Hang, KOUZUMA Y, YONEKURA M. Structures and properties of antioxidative peptides derived from royal jelly protein[J]. Food Chemistry, 2009, 113(1): 238-245.

[24]王龙, 叶克难. 水产蛋白资源的酶解利用研究现状与展望[J]. 食品科学, 2006, 27(12): 807-812.

[25]彭志英. 食品酶学导论[M]. 北京: 中国轻工业出版社, 2007: 155.

[26]TELLO P G. Enzymatic hydrolysis of whey protein: I. Kinetic models[J]. Biotechnology and Bioengineering, 1994, 44(4): 523-528.

[27]黄群, 杨万根, 余佶, 等. 杜仲籽粕蛋白酶解制备抗氧化肽工艺优化[J].食品科学, 2013, 34(17): 205-209. doi: 10.7506/spkx1002-6630-201317044.

[28]WANG Qiukuan, LI Wei, HE Yunhai, et al. Novel antioxidative peptides from the protein hydrolysate of oysters (Crassostrea talienwhanensis)[J]. Food Chemistry, 2014, 145: 991-996.

[29]KONG Baohua, XIONG Youling. Antioxidant activity of zein hydrolysates in a liposome system and the possible mode of action[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2006, 54: 6059-6068.

Preparation of Antioxidant Peptides Derived from Duck Meat by Enzymatic Hydrolysis

WANG Lusha1, ZHANG Shouyu2, HUANG Ming1,*, ZHOU Guanghong1
(1. Key Laboratory of Animal Product Processing, Ministry of Agriculture, College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 2. Department of Cooking Food, Henan Polytechnic, Zhengzhou 450046, China)

Abstract: Response surface methodology (RSM) was used to develop an optimal pepsin hydrolysis procedure of duck meat for the production of antioxidant peptides with high DPPH radical scavenging activity. The results showed that the response surface model indicating the effect of substrate concentration, enzyme-to-substrate ratio and hydrolysis time on DPPH radical scavenging activity of duck meat hydrolysates was well fitted (R2=0.995 7, R2Adj=0.992 7). Among three independent variables, enzyme-to-subs trate ratio exerted the greatest effect on DPPH r adical scavenging activity, while substrate concentration had the least impact. Maximum DPPH radical scavenging activity (83.57 ± 0.20)% was observed for the hydrolysate obtained after 3.54 h of hydrolysis at a substrate concentration of 10.89 g/100 mL and an enzyme to substrate ratio of 0.013%, which was close to the and value (84.23%) obtained from RSM at a 95% confidence interval.

Key words: duck meat; pepsin; antioxidant peptides; DPPH radical scavenging activity; response surface methodology (RSM)

doi:10.7506/spkx1002-6630-201507017

中图分类号:TS251.1

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2015)07-0090-07

*通信作者:黄明(1970—),男,教授,博士,研究方向为肉品质量与安全控制。E-mail:mhuang@njau.edu.cn

作者简介:王璐莎(1989—),女,硕士研究生,研究方向为肉品质量与安全控制。E-mail:2012108029@njau.edu.cn

基金项目:国家自然科学基金面上项目(31171706);公益性行业(农业)科研专项(201303083-2)

收稿日期:2014-03-25