表1 梯度洗脱程序表
Table 1 HPLC ggrradient elution program for biogenic amine analysis
郝淑贤，魏 涯，周婉君，杨贤庆，李来好，胡 晓，林婉玲，邓建朝
（中国水产科学研究院南海水产研究所，农业部水产品加工重点实验室，国家水产品加工技术研发中心，广东 广州 510300）
摘 要：从鲭鱼体内分离7 株生物胺产生菌，其中3 株菌可以产生色胺，4 株菌可以产生2-苯乙胺，4 株菌可以产生腐胺，1 株菌可以产生尸胺，3 株菌可以产生组胺，1 株菌可以产生酪胺。组胺生成量较高的No.1菌株形态学、生理生化分析及菌种鉴定结果表明该菌株极有可能为侵肺巴斯德氏菌，可信度为99.9%。
关键词：鲭鱼；生物胺产生菌；组胺；生化特性
鲭鱼又名青花鱼，是一种常见的可食用鱼类，多见于西太平洋及大西洋海岸附近，喜群居。鲭鱼平均体长30～50 cm，寿命最长可达11 年，它以浮游生物及鲟鱼、鳕鱼和鲱鱼所产鱼卵为生，属于青皮红肉鱼类。近年来先后在江苏及天津等地发现鲭鱼生物胺中毒事件[1-2]。
组胺是含咪唑环化合物，在附着在鱼肉中的摩氏摩根氏菌，磷发光杆菌等微生物来源的组氨酸脱羧酶（histidine decarboxylase，HDC）的作用下，使组氨酸脱去羧基而产生组胺[3-5]。游离氨基酸是生物胺产生的前体物质，水产品中游离氨基酸的量和种类对氨基酸脱羧酶的活力都会产生影响[6]。其中组胺是引起过敏性食物中毒的最主要化学物质，是人们对海水鱼类安全问题关注的热点[7]。
生物胺产生菌普遍存在于海水鱼的体表及活鱼的鳃和内脏中，在鱼体存活时对鱼体并不产生危害[8]。鱼体一旦死亡，随着防御系统被破坏，生物胺产生菌在适宜温度下迅速繁殖并产生大量组胺。基于鲭鱼频繁引起生物胺特别是组胺中毒现象，本实验通过研究筛选生物胺产生菌，对分离菌的形态特征、生物胺生成情况进行分析，为鲭鱼贮藏过程中生物胺的形成及控制提供参考依据。
1.1 材料、试剂与设备
1.1.1 材料
冰鲜鲭鱼购于广州市海珠区下渡路水产市场，经去头、去内脏、无菌包装后于室温下（18～23 ℃）存放备用。
1.1.2 试剂
生物胺标准品：组胺（h i s t a m i n e，H I S）（≥97%）、色胺（tryptamine，TRP）（≥98%）、2-苯乙胺（2-phenethylamine，2-PHE）（≥99.5%）、尸胺（cadaverine，CAD）（≥97%）、腐胺（putrescine，PUT）（≥99%）、亚精胺（spermidine，SPM）（≥98%）、精胺（spermine，SPD）（≥97%）、酪胺（tyramine，TYR）（≥99%）、丹磺酰氯（99%）、1,7-二氨基庚烷（98%） 美国Sigma公司；乙腈、甲醇、丙酮均为色谱纯 美国Burdick & Jackson公司；其他试剂均为化学纯或分析纯，购于广州粤申化学试剂厂。
1.1.3 培养基
PCA培养基（1 L）：准确称取蛋白胨5.0 g、酵母浸粉2.5 g、葡萄糖1.0 g、琼脂15 g，加入1 mol/L氢氧化钠调节pH值至7.0±0.2。
生物胺筛选培养基（1 L）：准确称取蛋白胨5.0 g、酵母浸粉5.0 g、L-组氨酸18.5 g、氯化钠5.0 g、碳酸钙1.0 g、琼脂20 g和溴甲酚紫0.06 g，使用1 mol/L盐酸调pH值至5.3±0.2。
TSA培养基（1 L）：称取47 g干粉于1 L蒸馏水中加热煮沸溶解，灭菌后制成平板备用。
TSBH培养基（1 L）：准确称取TSB培养基38 g和L-组氨酸20 g，加入1 L蒸馏水，煮匀，灭菌后使用；以上培养基于1.01×105Pa高压下121 ℃蒸汽灭菌15 min。
1.1.4 仪器与设备
TU-1990紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；3K30型冷冻离心机 美国Sigma公司；388型立式蒸汽压力灭菌锅 上海申安医疗器械厂；Agilent 1100高效液相色谱仪 美国Agilent公司；WGP-350隔水式电热恒温培养箱 上海华岩仪器设备有限公司。
1.2 方法
1.2.1 菌落总数的测定
参考卢涵等[9]的方法测定菌落总数。取常温贮藏0、1、2、3、4、5 d的鲭鱼背部肌肉组织，无菌条件下捣碎混匀，称取10 g置于装有90 mL生理盐水的锥形瓶中（内含灭菌玻璃珠），混匀。用无菌生理盐水依次稀释成10 倍系列稀释样品匀液，无菌条件下进行PCA培养基平板稀释实验。
1.2.2 菌株的分离与纯化
参考杨健等[10]的方法，将上述样品稀释液在无菌条件下在生物胺筛选培养基上进行平板涂布实验，然后将涂布后的培养基置于35 ℃的恒温培养箱中培养3 d，肉眼观察生物胺筛选培养基上的菌落，蓝紫色菌落即为生物胺产生菌。用接种环将培养基中的蓝紫色菌落接种于TSA培养基中纯化培养，35 ℃培养2 d。
1.2.3 菌株生长状况及生物胺生成情况
将纯化后的细菌接种于TSBH培养基中，分别置于4 ℃和35 ℃环境中振荡培养2 d，用紫外分光光度计连续测定培养液的OD605 nm值，表示各细菌的生物量。参考杨贤庆等[11]的方法，取1 mL 35 ℃条件下培养48 h的发酵液，采用柱前衍生高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）对组胺（HIS）、色胺（TRP）、2-苯乙胺（2-PHE）、腐胺（PUT）、尸胺（CAD）、酪胺（TYR）、亚精胺（SPD）和精胺（SPM）8 种生物胺进行测定分析，实验重复3 次。
色谱测定参数：色谱柱：Grace Smart RP-18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温40 ℃，流速1.0 mL/min，进样量10 μL，荧光激发波长为350 nm，发射波长为520 nm。流动相A为0.1 mol/L乙酸铵溶液，流动相B为乙腈，流动相C为超纯水。梯度洗脱程序见表1。
表1 梯度洗脱程序表
Table 1 HPLC ggrradient elution program for biogenic amine analysis
1.2.4 生化实验
1.2.4.1 菌落形态及色泽观察
观察并描述单菌落在平板上的形状、大小、边缘、表面、隆起形状、透明度、菌落及培养基的颜色等菌落特征。
1.2.4.2 革兰氏染色
挑取菌落，进行革兰氏染色实验，用显微镜观察菌体的革兰氏染色情况。
1.2.4.3 菌种鉴定
挑取单菌落分别接种于3 mL质量分数0.45%无菌NaCl溶液（pH 4.5～7.0）中，混匀，配制相当于0.80～0.10麦氏单位的菌悬液，使用VITEK 2全自动微生物分析系统进行菌种鉴定[12]。
2.1 菌落总数测定结果
图1 鲭鱼在常温贮藏过程中菌落总数的变化情况
Fig.1 Changes in total bacterial counts in mackerel during storage at normal temperature
由图1可知，贮藏初期，鲭鱼体内的细菌总数为3.41 （lg（CFU/g）），在贮藏第2天时，鲭鱼体内的细菌总数为8.74 （lg（CFU/g）），而后鲭鱼体内的细菌进入稳定期。
2.2 菌株的分离与纯化
取贮藏2 d后的鲭鱼样品，进行生物胺生成菌株的分离、鉴定。因目前国内外研究学者还未研制出直接筛选组胺菌的培养基。组胺生成菌分离琼脂（histamineforming bacteria isolation agar，HBI）培养基是最早用来分离产组胺细菌的培养基，由美国研究学者Niven等[13]研制。但是随着科技的不断进步，研究者们发现HBI培养基分离的菌种不仅仅是组胺产生菌，还有其他生物胺产生菌[14-16]，本研究根据生物胺改变pH值的原理利用HBI培养基对生物胺生成菌株进行初步的分离筛选。通过初步的分离筛选共得到7 株不同菌落形态的菌株，它们都能够使得生物胺筛选培养基变成蓝紫色，见图2。
图2 生物胺筛选培养基中的菌落
Fig.2 Colonies with blue or purple color on BA-forming bacterium isolation agar
2.3 菌株生长状况分析
图3 7 株细菌在4 ℃（a）及35 ℃（b）的生长曲线
Fig.3 Growth curves of seven strains at 4 ℃ (a) and 35 ℃ (b)
将分离的7 株细菌接种到TSA培养基中纯化培养后，确定7 株细菌在4 ℃和35 ℃条件下的生长曲线，结果如图3所示。7 株细菌在4 ℃条件下OD605 nm值增长缓慢，培养5 d期间OD605 nm值低于0.03。在35 ℃条件下培养2 d，每隔2 h测定一次OD605 nm值，可以看出7 株细菌在35 ℃条件下OD605 nm值增长迅速，特别是在培养4～12 h期间，7 株菌株的OD605 nm值呈对数增长，培养约12 h后菌株OD605 nm值趋于稳定，而后增长速率缓慢，No.1菌株OD605 nm值增长最大，在培养48 h后OD605 nm值为1.96。结果表明7 种菌株在35 ℃条件下生物量变化比较明显。文献[17]报道，生物胺生成菌适宜生长温度范围主要分3 种，分别为嗜冷菌（低于20 ℃）、嗜温菌（25～40 ℃）和嗜热菌（高于40 ℃），Mackie等[17]认为导致鱼体腐败形成生物胺的菌株主要是嗜温菌。
2.4 生物胺生成情况分析
通过对TSBH培养液中细菌代谢物的检测，7 株细菌在35 ℃时有生物胺检出，在4 ℃时无生物胺检出。7 株细菌在35 ℃条件下生物胺的产生情况如表2所示。在7 株细菌中，有3 株细菌可以产生色胺，有4 株细菌可以产生2-苯乙胺，有4 株细菌可以产生腐胺，有1 株细菌可以产生尸胺，有3 株细菌可以产生组胺，有1 株细菌可以产生酪胺。虽然No.6、No.7菌株可以产生组胺，但是组胺产生量相对较少，而No.1菌株产生的生物胺含量较高，因此继续对No.1菌株进行鉴定。
表2 7 株细菌的生物胺产生情况
Table 2 Biogenic amine Contents produced by seven strains
注：－.未检出。
2.5 菌株鉴定
2.5.1 形态学观察结果及革兰氏染色结果
通过观察平板上单菌落形态发现No.1菌株菌落为淡黄色，圆形，湿润光滑，边缘整齐。革兰氏染色结果确定为革兰氏阴性细菌。通过显微镜观察为G－杆菌。
2.5.2 No.1菌株鉴定
表3 No.1菌株的鉴定结果
Table 3 Identification of strain No.1
注：＋. 阳性反应；－. 阴性反应。
No.1菌株生理生化指标见表3，结果表明该菌株D-葡萄糖、D-麦芽糖、D-甘露糖及蔗糖反应为阳性，其他指标反应为阴性。API（32E）鉴定No.1菌株可能为侵肺巴斯德氏菌，可信度为99.90%。
本研究利用生物胺生成改变pH值的原理，通过HBI培养基对生物胺生成菌进行初步筛选，共从鲭鱼体内分离出疑似菌株7 株。各菌株生成生物胺的种类与含量存在很大差异，其中以No.1菌株组胺生成量最多，总生物胺生成量最高，种类最丰富，通过形态学、生理生化指标分析鉴定，确认No.1菌株与侵肺巴斯德氏菌的可信度为99.9%。赵中辉等[18]在鲅鱼鱼肉中检测到该菌株，并且确认其与组胺等生物胺生成有关。该菌属于巴斯德氏菌属，在4 ℃生长缓慢，35 ℃生长良好，说明该菌为嗜温菌。说明细菌对生物胺的产生非常重要，因此预防组胺中毒最有效的方法是防止细菌污染，有效控制细菌生长。
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HAO Shuxian, WEI Ya, ZHOU Wanjun, YANG Xianqing, LI Laihao, HU Xiao, LIN Wanling, DENG Jianchao
(National R&D Center for Aquatic Product Processing, Key Laboratory of Aquatic Product Processing, Ministry of Agriculture, South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300, China)
Abstract: Seven biogenic amine-producing strains were isolated and purified from mackerel. The results showed that three of the strains produced serotonin, four produced 2-phenylethylamine, four generated putrescine, one produced cadaverine, three produced histamine, and one produced tyramine. Strain 1 that produced a higher amount of histamine than other strains was identified as lung Pasteurella pneumotropica with a reliability of 99.9% by analysis of morphological and physio-chemical properties.
Key words: mackerel; biogenic amine-producing bacteria; histamine; physio-chemical properties
doi:10.7506/spkx1002-6630-201507018
中图分类号：TS201.6
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2015）07-0097-04
作者简介：郝淑贤（1972—），女，研究员，博士，主要从事水产品加工与质量安全研究。E-mail：susanhao2001@163.com
基金项目：“十二五”国家科技支撑计划项目（2012BAD28B05）
收稿日期：2014-01-20