霍山石斛中不同多糖组分的保肝活性

田长城1,2,罗建平1,*

(1.合肥工业大学生物与食品工程学院,安徽 合肥 230009;2.蚌埠学院生物与食品工程系,安徽 蚌埠 233030)

摘 要:采用热水浸提和DEAE-纤维素阴离子交换法从霍山石斛中分离出4 种多糖组分(DHP1、DHP2、DHP3 和DHP4),比较了4 种多糖组分对四氯化碳(CCl4)肝毒性的保护作用。结果表明:口服DHP1显著降低了CCl4诱导的小鼠血清谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)和谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)活性的升高,削弱了肝组织中丙二醛(malondialdehyde,MDA)的表达,同时恢复了肝组织中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化氢酶(catalase,CAT)的活性。因此,DHP1可能是霍山石斛中一种潜在的保肝多糖成分。

关键词:霍山石斛;多糖;四氯化碳;肝损伤

霍山石斛(Dendrobium huoshanense)是我国一种多年生的药用草本植物,其根茎不仅可入药,还是一种名贵的滋补品,具有生津养胃、明目护肝以及抗肿瘤等功效[1]。药理学研究发现,霍山石斛中含有多糖、生物碱、酚类和各种微量元素,其中多糖的活性十分显著,具有抗氧化[2]、免疫刺激[3]、抗糖基化[4]以及抗白内障[5-6]等多种功能活性,受到了人们的广泛关注。

大量的研究表明一些天然产物能够增强肝对毒性物质的抵抗力,呈现有效的保肝作用[7-8]。其中,天然多糖由于其保肝活性显著、毒性小而备受研究者关注[9-10]。黄静等[11]发现霍山石斛粗多糖能够有效增强小鼠对四氯化碳(CCl4)肝损伤的抵抗能力,表现出显著的保肝功效。然而,粗多糖多是通过水提醇沉的方法制备获得,虽然富含碳水化合物,但组分十分复杂。因此,对粗多糖的进一步分离、纯化是研究多糖保肝活性的前提条件,同时也有利于进一步理解多糖性质与活性间的关系。本实验利用DEAE-纤维素阴离子交换树脂对霍山石斛粗多糖进一步分离,得到4 种不同的多糖组分,比较了这4 种组分对CCl4诱导的小鼠肝损伤的保护作用,期望为霍山石斛多糖进一步的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、动物与试剂

霍山石斛幼苗由实验室组培获得。

雄性昆明小鼠(SPF级,体质量(23±2) g)购自安徽医科大学实验动物中心(许可证号:SCXK 2011-002)。

DEAE-纤维素阴离子交换树脂 美国Amersham Pharmacia Biotech公司;水飞蓟素 大马士德制药公司;谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)试剂盒、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)试剂盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)试剂盒、过氧化氢酶(catalase,CAT)试剂盒 南京建成生物工程研究所;其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-1100型紫外-可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司;傅里叶红外波谱仪 美国Nicolet公司;CT15RT冷冻离心机 香港天美科技有限公司;LGJ-18S原位冷冻干燥机 北京松源华兴科技发展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 霍山石斛多糖的提取和分离

霍山石斛干燥后粉碎成末,浸入80%的乙醇中24 h脱除色素和小分子物质;风干后按料液比1∶100(m/V)加入蒸馏水,在65 ℃条件下搅拌提取2 h,过滤后,残渣重新提取一次,合并滤液;用真空旋转蒸发仪浓缩滤液,然后10 000 r/min离心10 min,向上清液中加入4 倍体积的95%乙醇,室温过夜;醇沉物用蒸馏水溶解,采用Sevag法处理5 次,去除蛋白;经透析和冷冻干燥后得到霍山石斛粗多糖(Dendrobium huoshanense polysaccharide,DHP)。

取20 mg DHP溶于5 mL蒸馏水中,充分溶解后3 000 r/min离心10 min,上清液过DEAE-纤维素阴离子交换层析柱(4.3 cm×40 cm)。依次用双蒸水、0.1、0.2、0.3 mol/L的NaCl溶液进行洗脱,每种洗脱液洗脱200 mL,流速为5 mL/min,分别收集得到DHP1、DHP2、DHP3和DHP4 4 种组分。收集液浓缩后用透析袋(截留MW为3 500 D)对自来水透析24 h,适当浓缩后冷冻干燥,精确称质量,计算得率。

1.3.2 多糖组分中总糖质量分数的测定

采用苯酚-硫酸法测定各组分中总糖的质量分数[12]

1.3.3 霍山石斛多糖的红外波谱分析

样品在60 ℃烘箱中干燥24 h后与KBr碾磨压片,利用傅里叶红外波谱仪扫描4 000~400 cm-1区间的吸收峰。

1.3.4 动物实验

雄性昆明小鼠饲养在标准的动物房中,动物的使用严格遵守我国实验动物管理条例。小鼠适应性喂养7 d后,随机分成18 组(每组10 只):对照组、模型组、阳性对照组、粗多糖及其4 个多糖组分测试组(每种多糖分别设50、100、200 mg/kg 3 个质量浓度组)。水飞蓟素是一种常见的保肝药物,实验中被用做阳性对照药物(25 mg/kg)。水飞蓟素和多糖组分分别溶于双蒸水中,配成相应质量浓度的溶液,利用无菌注射器按10 mL/kg剂量对小鼠进行灌胃。对照组和模型组小鼠用等量的双蒸水代替。小鼠每天灌胃1 次,连续处理14 d。最后一次灌胃后4 h时,用1.5 g/L的CCl4溶液(CCl4溶解于橄榄油中)按照10 mL/kg对小鼠进行腹腔注射,诱发肝损伤模型。其中对照组小鼠注射等剂量的橄榄油。

CCl4注射24 h后,采用眼球摘除法收集血液,室温下放置4 h,在3 000 r/min和4 ℃条件下离心10 min,收集血清保存在-78 ℃冰箱中,备用。采用颈椎脱臼法处死小鼠后进行解剖,迅速取出肝,在生理盐水中洗去血液,滤纸吸去水分。肝的左小叶用10%福尔马林固定液浸泡,其余部分迅速用液氮冷冻,置于-78 ℃冰箱中,备用。

1.3.5 血清中ALT和AST活性的测定

利用生化试剂盒中说明书的方法测定血清中ALT和AST的活性。

1.3.6 肝组织中MDA含量和SOD、CAT活性的测定

取1.0 g小鼠的肝组织,置于匀浆机中,加入9 mL的预冷匀浆溶液(0.01 mol/L蔗糖、0.01 mol/L Tris-HCl、0.000 1 mol/L乙二胺四乙酸二钠(ethylene diaminetetraacetic acid disodiumsalt,EDTA-2Na)溶液,pH 7.4),充分研磨。在4 ℃和3 000 r/min条件下离心10 min,用移液枪吸取上清液,保存在低温冰箱中。按照试剂盒说明书的操作方法测定上清液中MDA含量和SOD、CAT活性。

1.3.7 肝组织病理学观察

取出固定液中的肝组织,自来水冲洗后依次在体积分数为50%、60%、70%、80%和95%的乙醇溶液中进行脱水,二甲苯透明化后,石蜡包埋切片(5 μm),伊红-苏木精(hematoxylin-eosin,HE)染色后,在光学显微镜下观察和拍照。

1.4 统计分析

实验结果表示为±s,组间两两比较采用Student’stest方法,P<0.05时认为有统计学意义。SPSS13.0用于数据的整理和分析。

2 结果与分析

2.1 霍山石斛粗多糖的分离

采用水提醇沉的方法提取出霍山石斛中的粗多糖(DHP),其得率为干霍山石斛质量的4.25%。利用DEAE-纤维素阴离子交换树脂将DHP进一步分成了4 种不同的组分,其中DHP1为中性多糖(水洗组分),呈白色粉末状,得率为3.17%;DHP2、DHP3和DHP4为弱酸性多糖(盐洗),呈浅褐色,得率分别为0.51%、0.24%和0.21%。

利用苯酚-硫酸法测定了不同多糖组分的总糖质量分数。其中DHP1中总糖质量分数为94.5%,而DHP2、DHP3和DHP4的总糖质量分数分别为42%、45%和42%,表明中性多糖是霍山石斛粗多糖中的主要多糖组分,而其他3 种酸性多糖则含有大量的杂质。

2.2 不同多糖组分的红外波谱分析

图1 不同霍山石斛多糖组分的红外波谱
Fig.1 Infrared spectra of different polysaccharides from D. huoshanense

A. DHP1;B. DHP2;C. DHP3;D. DHP4。

利用红外波谱验证4 种多糖组分的特征。由图1可知,4 种组分在3 380 cm-1和2 925 cm-1处均存在明显的吸收峰,分别表示羟基O—H键的伸缩振动和C—H的吸收峰。此外,1 640 cm-1处的吸收峰表明组分中含有一定量的结合水[13]。红外波谱中850~1 200 cm-1处的吸收峰被认为是多糖的“指纹区”,多糖间的差异很大。DHP1 在850 cm-1和930 cm-1处存在着吸收峰,表明它具有α构型的葡萄糖;而DHP2、DHP3和DHP4在890 cm-1处具有吸收峰,这说明它们的单糖为β构型[14]。DHP3和DHP4红外波谱1 730 cm-1和1 245 cm-1处的吸收峰分别对应着酯键中C=O和C—O键的伸缩振动,表明可能存在羧基。

2.3 不同多糖组分的保肝活性

图2 不同霍山石斛多糖的保肝作用
Fig.2 Hepatoprotective effects of different polysaccharides from D. huoshanense

A. 与模型组相比差异显著(P<0.05);B. 与模型组相比差异极显著(P<0.01)。图4、5同。

ALT和AST是肝细胞内两种重要的转氨酶,常用做评价肝细胞损伤的生物标志[15-16]。研究发现,与正常小鼠相比,CCl4的注入使小鼠血清中ALT和AST的水平分别增加了8.0、2.2 倍,表明肝损伤模型的成功建立。实验证实了霍山石斛粗多糖(DHP)的保肝活性,并进一步对4 种多糖组分的保肝活性进行了评价。由图2可知,DHP1的预处理有效地削弱了CCl4诱导的小鼠血清中ALT和AST水平的升高,而其他3 种多糖组分的效果则不明显。

图3 小鼠肝组织的病理变化
Fig.3 Pathological changes of liver tissues

A. 空白组;B. 模型组;C. 水飞蓟素+CCl4组;D~F分别为50、100、200 mg/kg DHP+CCl4组;G~I分别为50、100、200 mg/kg DHP1+CCl4组;J~L分别为50、100、200 mg/kg DHP2+CCl4组;M~O分别为50、100、200 mg/kg DHP3+CCl4组;P~R分别为50、100 、200 mg/kg DHP4+CCl4组。

图3是不同处理组小鼠肝组织的切片,CCl4的处理造成了肝组织大面积的空泡化和坏死,而DHP和DHP1的预处理则显著降低了这种病理的改变,进一步证明了它们的保肝功效。

CCl4诱导的肝损伤是一种典型的氧化型组织损伤,其进入体内后会被细胞色素P450酶代谢生成三氯甲基自由基(·CCl3)和三氯甲基过氧自由基(·OOCCl3),从而导致细胞的氧化应激[17]。MDA是一种脂质过氧化产物,它一定程度上反映了肝细胞的氧化损伤程度[18-19]。研究发现,DHP和DHP1可以有效地降低CCl4诱导的小鼠肝组织中MDA含量的升高,且呈现出一定的量效关系(图4)。

图4 不同处理组小鼠肝组织中的MDA水平
Fig.4 MDA levels in liver tissues from different treatment groups

图5 不同处理组小鼠肝组织中SOD和CAT活力
Fig.5 Levels of SOD and CAT in liver tissues from different treatment groups

SOD和CAT是生物体内两种重要的抗氧化酶,在清除动、植物体内自由基过程中发挥着重要的作用[20-22]。由图5可知,在CCl4诱导的肝损伤模型中,肝组织中SOD和CAT的活性显著低于正常水平,间接加剧了组织的氧化应激。DHP1(200 mg/kg)的预处理使SOD 和CAT的活力分别增至(259.10±15.88) U/mg pro和(135.38±25.81) U/g pro,显著高于模型组。

3 结 论

本研究重点比较了霍山石斛中不同多糖组分的保肝活性,结果表明:霍山石斛粗多糖中含有大量的中性多糖(DHP1)和一定量的酸性多糖。DHP1中总糖的质量分数为94.5%,口服DHP1可以有效抑制CCl4诱导的小鼠血清中转氨酶水平的升高,降低肝组织中丙二醛的产生,同时恢复了肝细胞中SOD和CAT的活性,是霍山石斛中一种有效的保肝多糖成分。之前的研究发现,DHP1中富含甘露糖、葡萄糖和半乳糖[23-24],它的这种保肝活性可能与其结构有着密切的联系。

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Hepatoprotective Effects of Different Polysaccharides from Dendrobium huoshanense

TIAN Changcheng1,2, LUO Jianping1,*
(1. School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China; 2. Department of Biology and Food Engineering, Bengbu University, Bengbu 233030, China)

Abstract: Four polysaccharides (DHP1, DHP2, DHP3 and DHP4) were isolated and purified from young seedlings of Dendrobium huoshanense by hot water extraction and DEAE cellulose anion exchange chromatography. The objective of this study was to investigate the protective e ffects of the four polysaccharides on carbon tetrachloride (CCl4)-induced acute liver injury in mice. The results showed that oral administration of DHP1 significantly decreased the levels of serum alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST), reduced the content of hepatic malondialdehyde (MDA) and restored the activities of superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) in the CCl4-treated mice, suggesting that DHP1 is a potential hepatoprotective compound in D. huoshanense.

Key words: Dendrobium huoshanense; polysaccharide; carbon tetrachloride; liver injury

doi:10.7506/spkx1002-6630-201507030

中图分类号:TS202.3

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2015)07-0162-05

*通信作者:罗建平(1966—),男,教授,博士,研究方向为天然产物化学。E-mail:jianpingluo@hfut.edu.cn

作者简介:田长城(1980—),男,讲师,博士,研究方向为农产品加工及贮藏。E-mail:tianchangcheng2006@126.com

基金项目:国家自然科学基金青年科学基金项目(21006019);安徽省科技攻关计划项目(12010402088 )

收稿日期:2014-06-22