图1 静电纺丝装置图[[77]]Fig.1 Schematic illustration of traditional electrospinning equipment[7]
张 珍，马美湖，黄 茜*
（蛋品加工技术国家地方联合工程研究中心，国家蛋品加工技术研发分中心，华中农业大学食品科学技术学院，湖北 武汉 430070）
摘 要：禽蛋是蛋白质的天然宝库，其中多种蛋白质具有抑菌、免疫调节、抗肿瘤、抗氧化等生物活性。蛋白质具有良好的生物相容性和可降解性，当其尺度到纳米级后，会导致其纳米材料具有许多理想的性能。静电纺丝是一种简单有效的制备纳米纤维的方法，因此经过静电纺丝将其制成纳米纤维，不但能提高比表面积和多孔率，更能发挥其重要的功能性质。本文对禽蛋中主要蛋白质如卵白蛋白、溶菌酶、卵黄高磷蛋白、可溶性蛋壳膜蛋白等的静电纺丝技术应用做一综述，为活性蛋白质电纺技术的后续研究提供参考。
关键词：静电纺丝；卵白蛋白；溶菌酶；卵黄高磷蛋白；可溶性蛋壳膜
禽蛋中含有丰富的蛋白质，约占禽蛋总质量的12%，大部分分布在蛋白和蛋黄中，小部分在蛋壳和壳膜上，蛋黄中的大部分脂质也是以脂蛋白的形式存在。蛋清中蛋白质含量约为11%，其中卵白蛋白（54%）、卵转铁蛋白（13%）、卵类黏蛋白（11%）、溶菌酶（3.5%）和卵黏蛋白（3.5%）的含量约占总蛋白含量的85%[1-2]；蛋黄中含有17%的蛋白质，大部分为磷蛋白，包括低密度脂蛋白、卵黄球蛋白、卵黄高磷蛋白和高密度脂蛋白等[3]；蛋壳膜中90%的组分为蛋白质，包括胶原蛋白、骨桥蛋白、唾液蛋白和角蛋白等[4]。研究表明，禽蛋中多种蛋白质具有抑菌、免疫调节、抗肿瘤、降压等活性，其开发利用可以极大地提高禽蛋的附加值[5]。
静电纺丝作为一种简便有效的可生产纳米纤维的新型加工技术，而且经过电纺获得的纳米纤维具有比表面积大和孔隙率高、长/径比大等特性，因而在过滤、组织工程支架、生物工程、临床医学、传感器和化妆品等领域将会发挥巨大的作用[6-9]。目前很多研究已经通过静电纺丝技术将胶原蛋白、明胶等天然聚合物蛋白制成极细的纳米纤维，其中不乏将禽蛋中的生物活性物质，特别是蛋白质用于静电纺丝技术的报道。因此本文主要概括静电纺丝技术及其在禽蛋蛋白质中的应用。
静电纺丝技术又称为静电纺或者电纺，是一种通过静电力作为牵引力来制备亚微米和纳米级超细纤维的方法[10]。传统静电纺丝装置如图1所示，主要由高压电源、喷丝头及纺丝液供给容器和纤维收集装置三部分组成[11]。电纺时，聚合物溶液或熔体在高压静电的作用下，在喷丝口处形成Taylor锥（泰勒锥），当电场强度达到一个临界值时，电场力就能克服液体表面张力，在喷丝口处形成一股带电的喷射流。这些喷射流在短距离内经过电场力的高速拉伸、溶剂挥发与固化，最终沉积在收集装置上，形成纳米纤维[12]。在此过程中，外加电压、聚合物溶液的注射速率、喷丝头直径、喷丝口与收集装置之间的距离等参数以及环境条件都对电纺纤维的形貌产生重要影响[13-15]。
图1 静电纺丝装置图[[77]]Fig.1 Schematic illustration of traditional electrospinning equipment[7]
传统静电纺丝方法获得的纤维聚集体通常呈现无序排列的状态，现在许多研究者通过改善传统的静电纺丝装置来制备新型的具有特殊结构的纳米纤维，如多喷头静电纺丝、多层和混合静电纺丝及同轴静电纺丝等方式。多喷头静电纺丝是将不同聚合物溶液装在不同喷丝头里，在高静压下进行纺丝，获得各组分均匀分布的复合纳米纤维。Ding Bin等[15]利用聚乙烯醇和醋酸纤维（cellulose acetate，CA），通过多喷头静电纺丝技术（含有4 个喷头）制备了可生物降解的纳米纤维膜，发现复合膜中两组分分布均匀，并没有发生化学反应。多层静电纺丝是将不同聚合物依次进行电纺，这些材料层层沉积形成具有多层结构的复合纤维膜；而混合电纺是不同的聚合物利用多个喷嘴同时电纺，通过移动收集器获得复合纳米纤维。Kidoaki等[16]将Ⅰ型胶原蛋白、苯乙烯化明胶和聚氨酯通过多层电纺制备了3 层纳米纤维膜；通过混合电纺，聚氨酯和聚氧乙烯从两个喷嘴同时沉积到一个水平运动的收集装置上，获得了两种材料交织的复合纳米纤维膜。同轴静电纺丝是利用同轴复合喷嘴产生同轴射流而进行电纺，获得具有两种聚合物性质的核-壳结构的纳米纤维，若仅在外层加入纺丝液，则可获得中空的管状纤维[17]。有研究分别将溶菌酶、牛血清白蛋白和明胶溶液作为核溶液，聚乳酸作为壳溶液进行同轴静电纺丝，获得了无珠粒核壳结构的纤维膜；其活性实验表明，同轴静电纺丝能保护核层蛋白质不受电场力和作为壳溶液有机溶剂的影响[18]。Sun Liangkui等[19]用聚丙烯腈作为壳纺丝液、甲基硅油作为核纺丝液，用同轴静电纺丝技术制备了外径为3 μm的同轴聚丙烯腈复合纤维，再经预氧化、炭化得到中空结构的纤维。
静电纺丝技术所使用的原料多为具有较大分子质量的聚合物。聚合物分子链在溶液中形成缠结，并且溶解后有一定的黏度[20]。目前，用于静电纺丝制备纳米纤维的材料有合成聚合物、天然聚合物以及二者的混合物[21]。其中合成聚合物主要有聚氧乙烯（poly（ethylene oxide），PEO）、聚乙烯醇（poly（vinyl alcohol），PVA）、聚丙烯酸（polyacrylic acid，PAA）、聚丙烯腈（polyacrylonitrile，PAN）、聚乳酸（poly（lactic acid），PLA）、聚己内酯（poly（ε-caprolactone），PCL）、聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯、聚偏氟乙烯、聚羟丁酸等。关于此类聚合物的纺丝，很多研究者对其进行了比较分析[11,21]。天然聚合物多为聚电解质，目前制备电纺纳米纤维的天然聚合物主要有多糖、蛋白质、DNA和一些脂类，其中用于电纺的多糖主要有纤维素、壳聚糖、透明质酸等[22-24]；蛋白质主要是丝素蛋白、胶原蛋白、明胶、弹性蛋白、纤维蛋白原等[25-29]。通过静电纺丝制备天然高分子纳米纤维比合成高分子困难，可以通过与其他聚合物溶液共混，来制备纳米纤维。有机聚合物与蛋白质共混应用在电纺中，不仅可以加强电纺纤维的机械性能，而且可以保持电纺材料的生物功能与活性。
近年来的研究表明，禽蛋蛋白质等生物活性物质具有抗菌活性、抗病毒活性、抗黏附性、抗癌、抗肿瘤特性、免疫调节活性、降压活性、抗氧化活性等生理功能，Kovacs-Nolan等[5]具体概括了禽蛋中生物活性物质对上述功能的贡献。卵白蛋白具有一定的免疫调节性；溶菌酶能溶解细菌细胞壁而起到抑菌作用；卵转铁蛋白不仅具有光谱抑菌性、抗病毒性，还能作为铁的运输工具；卵黏蛋白能维持蛋白的结构和黏度，防止微生物扩散；卵黄免疫球蛋白具有免疫调节特性，能作为抗癌载体；卵黄高磷蛋白具有良好的抗氧化性、抑菌性等[5]。
蛋白质电纺材料具有良好的生物降解性和生物相容性，因此如果利用静电纺丝技术将禽蛋蛋白质等生物活性成分做成纳米材料，必将在生物医药、食品等领域发挥重要作用。
3.1 蛋清蛋白
蛋清蛋白（egg albumin，EA）是一种良好的天然功能性食品蛋白质，能形成凝胶网络结构，提高溶液黏度，具有良好的乳化稳定性，因此经常将其用于食品基质设计[30]。EA具有球状结构、较高的表面张力，导致其聚合物溶液缺乏足够的缠绕性，因此采用传统的单一成分静电纺丝技术不容易形成连续的纳米纤维，而是其微粒沉降在收集板上[31]。
2007 年Wongsasulak等[30]发现PEO的存在能提高EA的可电纺性，但是二者混合物的水溶液在任意电纺条件下，得到的均是无规律、不一致的微粒；而用甲酸作溶剂时，EA与EA/PEO混合液容易进行电纺。随后Wongsasulak等[32]利用溶解在85%的醋酸溶液中CA和溶解在50%甲酸溶液中EA的混合溶液进行静电纺丝，表面活性剂吐温-40的添加改变了溶液的性质，解决了由于混合液表面张力过大、电导率过高造成的不易制备电纺纤维的问题，成功制备了可食性纳米纤维薄膜。随着混合物中EA的比例增高，所制得纤维的表面更加光滑、连续性更强，而直径却有所增大。
3.2 卵白蛋白
卵白蛋白（ovalbumin，OVA）是蛋清中主要蛋白质组分，约占蛋白质含量的54%，为单体磷酸糖蛋白，分子质量为45.0 kD。OVA是蛋清中唯一含有埋藏于疏水核心内部的自由巯基的蛋白质。分子相互缠绕折叠成具有高度二级结构的球形结构，结构中的二硫键和巯基导致卵白蛋白分子的聚集[33]。OVA具有胶凝作用、起泡作用、乳化特性、部分免疫调节的特性以及较高的生物相容性，可以作为生物医药材料和活性物质控制释放的载体。
Song Ruikun等[34]通过静电纺丝技术首先制备了PAN纤维膜，然后用银离子和OVA进行表面修饰通过层层自组装技术得到复合材料薄层。PAN的—CN基与Ag之间的相互作用以及Ag与OVA之间的静电相互作用是层层自组装技术的主要驱动力。X射线光电子能谱（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）与X射线衍射（X-ray diffraction，XRD）图表明Ag和OVA成功地沉积在PVA纳米纤维的表面，场发射扫描电子显微镜（field emission scanning electron microscopy，FE-SEM）表明Ag/OVA层数的增加导致了纤维直径的增大。随着Ag/OVA双分子层数的增多（不超过10 层），所得层层自组装纤维膜的细胞毒性有所减少；对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有很明显的抑菌活性，而且Ag在复合材料最外层时比OVA在最外层时具有更强的抑菌性，但是抑菌性并不随Ag层数的增多而增强[34]。因此，可以将卵白蛋白应用于抗菌材料，另外探究其作为电纺纳米纤维后的乳化性、起泡性、免疫调节性等功能性质将更加有意义。
3.3 溶菌酶
溶菌酶（lysozyme，LZ）是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，在选择性地分解微生物细胞壁的同时，而不破坏其他组织，本身无毒无害、无体内残留。鸡蛋清中溶菌酶的含量约为2%～4%。游离的溶菌酶不稳定，容易失去活性，因此Charernsriwilaiwat等[35]将溶菌酶加入壳聚糖（chiston，CS）-EDTA/PVA的混合液中，在15 kV的电压、0.25 mL/h的流速、喷丝头到收集板的距离为20 cm等条件下进行电纺，制得了无珠粒的光滑纳米纤维，其直径随着LZ浓度的增大而减小。研究发现，负载30% LZ的CS-EDTA/PVA的纳米纤维直径在143 nm左右，无毒性，而且能快速释放并保持LZ的活性，加速伤口的愈合。
与此同时，有研究者将静电纺丝和层层自组装技术相结合，研究了LZ的抑菌性。Huang Weijuan等[36]首先通过静电纺丝制备了直径在134 nm左右的CA纤维膜，然后通过层层自组装技术将多层带有正电荷的LZ-CS-OREC（有机累托石（organic rectorite））复合物与带负电荷的海藻酸钠（alginate，ALG）交替沉积在电纺CA纤维膜上，最终形成复合纳米纤维膜，用（LZ-CS-OREC/ALG）n表示，其中n是指LZ-CS-OREC/ALG双分子层的数目。随着CA纤维膜表面沉积的双分子层增多，所得到的纳米复合膜表面的突起增多，平均直径增大；对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用也增强，而且ALG在最外层时的抑菌性低于LZ-CS-OREC在最外层时的抑菌性，对金黄色葡萄球菌的抑菌性稍强于大肠杆菌。结果发现（LZ-CS-OREC/ALG）10.5涂膜具有最好的抑菌效果，用于猪肉的保鲜可以延长货架期。近来Xin Shangjing等[37]开发了一种新型的层层披覆技术，将丝素蛋白和溶菌酶通过静电相互作用披覆在电纺纤维素模板上制成纤维膜，结果发现这一膜能有效抑制细菌，而且具有很好的生物相容性，通过对人表皮细胞培养发现其还能促进伤口愈合、避免伤口感染，将其应用于真皮再生材料很有发展前景。
Li Wei等[38]将静电纺丝和静电雾化技术结合，首先利用静电纺丝制备了醋酸纤维膜，然后将溶菌酶和累托石（rectorite，REC）通过静电雾化披覆至其表面，并研究了该复合物纳米纤维的抑菌活性；从纤维膜上移除未结合的溶菌酶后，通过测定蛋白质的传递性质和酶活性发现静电雾化技术非常适应于酶的固定。Park等[39]之前也将溶菌酶-交联酶聚集体固定于电纺壳聚糖纳米纤维的表面作为有效的抗菌剂应用。因此将禽蛋中的溶菌酶作为电纺材料，应用于肉类保鲜防腐、伤口敷料、伤口愈合等方面具有重要的意义。
3.4 卵黄高磷蛋白
卵黄高磷蛋白（phosvitin，PV）是卵黄中一种主要的磷酸化糖蛋白，含量约占卵黄蛋白的11%或蛋黄干物质的3%～4%，其磷酸根几乎都是以N-磷酰丝氨酸形式存在，是目前已知的自然界中磷酸化程度最高的蛋白质，而且具有较高的热稳定性、超强的金属螯合能力、良好的抗氧化性能和乳化性能等[40]。Zhou Bin等[41]首先通过静电纺丝制备了CA纳米纤维膜，其水解后生成表面粗糙多孔的纤维素纳米纤维膜，PV和CS由于静电相互作用和氢键作用通过层层自组装技术选择性吸附在纤维素膜表面，形成了一薄膜，而且随着披覆层数的增多，复合纳米纤维膜表面更加粗糙。通过抑菌圈实验发现复合膜表现出很强的抑菌性，而且随着双分子层的增多，抑菌性增强。目前国内外很多研究都集中在卵黄高磷蛋白的生物矿化功能，如果将其制成纳米纤维膜用于生物矿化研究将会具有非常重要的意义。
3.5 蛋壳膜蛋白质
蛋壳膜是蛋壳与蛋清之间纤维状的薄膜，由壳内膜和壳外膜组成双层结构，壳外膜是由相互交织、黏附的纤维组成的多孔网络结构[42]。蛋壳膜中90%的组分为蛋白质，包括胶原蛋白（Ⅰ、Ⅴ、Ⅹ型）、骨桥蛋白、唾液蛋白和角蛋白等，其中胶原蛋白的含量约占10%[43]。基于蛋壳膜独特的结构和组成，目前已将其用于金属离子的吸收、生物敷料、酶固定的平板等[44]。
蛋壳膜分子结构中含有许多二硫键，导致了其水不溶性，这一点限制了蛋壳膜的应用，因此清华大学的Yi Feng等[45]在乙酸存在的条件下用3-巯基丙酸通过还原裂解反应从蛋壳膜中提取了可溶性蛋壳膜蛋白（soluble eggshell membrane protein，SEP） 。SEP分子质量较小、溶液黏度比较低因而自身不容易进行静电纺丝。Yi Feng 等[44]将PEO与SEP混合，通过提高电纺溶液的黏度来进行共混纺丝，由于溶液浓度和SEP/PEO的比例不同，纤维直径在0.3～20 μm，随PEO含量的增加、溶液浓度的增大，纤维直径有所增大。由于PEO在水溶液中极易溶解，作为SEP/PEO电纺纤维的基质材料不能应用在细胞培养，因此他们研究了甲醇浸泡法和二环己基碳二亚胺（1,3-dicyclohexylcarbodiimide，DCC）浸泡法对其抗水性的影响，结果发现用DCC处理后的电纺纤维具有更好的抗水性，在水溶液中浸泡3 d仍能较好地保持其纤维结构。
另外PCL既可以提高溶液的电纺性而且在水中溶解度低，因此后来很多研究者将PCL与SEP混合进行电纺研究。Jia Jun等[46]通过静电纺丝技术制备了非纺织布的PCL纳米纤维，经过等离子体表面修饰后将SEP固定于纳米纤维表面，提高了PCL纳米纤维的亲水性，提高了人皮肤成纤维细胞的黏附、分散以及增殖。Kim等[47]利用SEP和PCL成功进行了同轴电纺，制得了可应用于组织工程的生物复合材料，这一材料同样具有较高的比表面积、亲水性和良好的拉伸性，利于细胞黏附和增殖。
随后日本学者Kang Jian等[48]使用PEO和PVA来提高水溶性蛋壳膜（water-soluble eggshell membrane，S-ESM）在水溶液介质中的可电纺性，制备了平均直径分别为240 nm和335 nm结构均一的纳米纤维；并且经过儿茶素处理后获得了不溶性的S-ESM/PEO和S-ESM/PVA纳米纤维，通过傅里叶红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）表明S-ESM与儿茶素之间形成的氢键是提高纳米纤维水不溶性的主要作用力。之后Kang Jian等[49]将儿茶素和PCL混合液进行电纺，通过更有效的氢键作用将S-ESM加入到电纺PCL纳米纤维中，制得纳米纤维膜；结果发现S-ESM与儿茶素形成纳米颗粒，分布在PCL纳米纤维网上；而且儿茶素和S-ESM提高了PCL纳米纤维的湿润性。
SEP是具有良好生物相容性的天然高分子，于建等[50]申请专利将禽蛋蛋壳膜蛋白和生物可降解高分子材料溶解在共溶剂中，制备共混电纺纤维膜。解放军医学院朱雅亭[51]将SEP与PLA共纺制备电纺膜，通过交联法负载凝血酶来制备止血材料，材料的多孔性会结合孔周纤维负载凝血酶，有助于血液聚集并迅速凝结，制备高效快速止血材料。经过研究者的努力研究，壳膜蛋白势必在医学、生物组织工程支架等领域广泛应用。
近年来随着禽蛋蛋白质生物活性研究的不断深入，发现禽蛋中含有卵转铁蛋白、卵黏蛋白、卵黄免疫球蛋白和卵黄高磷蛋白等多种生物活性物质，另外禽蛋蛋壳膜中还含有约10%的胶原蛋白，而且蛋壳源胶原蛋白具有较高的热稳定性和低免疫原性，是替代哺乳动物源胶原蛋白的理想材料。由于超细纤维的优良性能，使得纳米材料成为研究热点，而静电纺丝技术作为制备纳米纤维的一种新型技术吸引了众多的研究。静电纺丝制备聚合物纳米纤维具有操作简单、可控性强、效率高等优点。另外蛋白质经过静电纺丝制成纳米纤维，不但能提高比表面积，也可以获得理想的化学性质；因此将其应用在禽蛋蛋白质的活性研究，可以更充分发挥天然蛋白质的功能性质。比如，卵黏蛋白电纺纳米纤维的直径很小，比表面积高，表面黏合性高，可以作为高效低阻的过滤材料，很容易捕获0.5 μm的小颗粒、拦截病毒和细菌等。卵黄高磷蛋白电纺纤维膜可以作为良好的矿化材料，应用在医学领域。
目前静电纺丝在禽蛋蛋白质中的应用主要是通过电纺技术制备纳米纤维膜基质，然后通过静电相互作用进行层层自组装，将蛋白质披覆在纤维膜上，进而对蛋白质的功能性质进行研究，其中电纺纤维膜只是作为吸附蛋白质的载体，如果直接用蛋白质来进行静电纺丝，使纳米纤维膜本身组分为蛋白质，这将对提高电纺纤维膜的功能化有着重要意义。而且研究仅报道了卵白蛋白、溶菌酶、卵黄高磷蛋白等少数几种成分的静电纺丝，种类过于单一，如果能对其种类进行拓宽，将其他功能性蛋白质比如转铁蛋白、卵黏蛋白、卵黄高磷蛋白等列入研究，并对其电纺膜的功能性质进行研究，将是对禽蛋蛋白质材料领域的重大贡献。另外针对禽蛋蛋白质分子可纺性比较差、机械强度低等局限，后期研究应调整电纺过程中各种因素的协同关系以实现纤维尺寸、取向方向及形貌的可控性，寻求更好的溶剂以避免电纺纤维由于有机溶剂带来的毒性。未来研究应更加关注传统电纺与其他技术如层层自组装、等离子体表面修饰等结合，赋予电纺纤维新的表面性能，拓展其应用范围，并最终实现大范围的工业化生产。
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ZHANG Zhen, MA Meihu, HUANG Xi*
(Egg Processing Technology Local Joint National Engineering Research Center, National R&D Center for Egg Processing, College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)
Abstract: Eggs are a natural treasure house of proteins with diverse biological functions such as antimicrobial, immunomodulatory, anticancer, antitumor, and antihypertensive activities. Protein has good biocompatibility and biodegradability. When its scale reaches the nanometer level, protein will have many desirable properties. Electrospinning is recognized as a simple and effective method for fabricating nanofibers. Electrospinning nanofibers can not only improve the specific surface area and porosity of protein materials, but also can retain their important functions in nature. Therefore, the nanomaterials have great development prospects. The main aim of this article is to review electrospinning technology and its applications in biologically active proteins such as ovalbumin, lysozyme, phosvitin and soluble eggshell membrane protein. We expect that this review will provide useful references for further studies on the application of electrospinning technology on active proteins in poultry eggs.
Key words: electrospinning; ovalbumin; lysozyme; phosvitin; soluble eggshell membrane protein
doi:10.7506/spkx1002-6630-201507037
中图分类号：TS253.4
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2015）07-0200-06
*通信作者：黄茜（1984—），女，副教授，博士，研究方向为蛋品科学与工程。E-mail：huangxi@mail.hzau.edu.cn
作者简介：张珍（1989—），女，硕士研究生，研究方向为蛋品科学与工程。E-mail：zhangzhenhzau@163.com
基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目（31101320）；中央高校基本科研业务费专项资金项目（2662014PY050）
收稿日期：2014-05-22