环孢子虫食源性感染及其检测技术研究进展

李俊强,孙芳芳,王荣军,张龙现*

(河南农业大学牧医工程学院,河南省人兽共患病国际联合实验室,河南 郑州 450002)

摘 要:环孢子虫(Cyclospora)是一种新发现的细胞内寄生的肠道寄生性原虫,食入被环孢子虫卵囊污染的蔬菜或水果会引起感染发病,环孢子虫主要寄生于人类和啮齿类、爬行类、哺乳类、非人灵长类等动物体内。环孢子虫病在世界范围内散在感染或暴发流行,主要引起人和动物的胃肠炎和腹泻等症状,甚至导致死亡,造成严重的健康威胁和经济损失。本文概述近几年来环孢子虫的分类情况、遗传特性研究、流行病学现状以及常用检测技术等方面的研究进展。

关键词:环孢子虫;食源性感染;流行性;检测技术

环孢子虫(Cyclospora)是一种新发现的细胞内寄生的肠道寄生性原虫,引起人和动物的胃肠炎和腹泻,同时还伴随有食欲减退、乏力、腹胀、腹痛、恶心、呕吐、体质量减轻等症状,严重的甚至导致死亡[1]。光学显微镜下,环孢子虫卵囊是一个近球形的折射体,中间是桑葚胚,卵囊直径为8.6 μm(7.7~9.9 μm)[2],经改良抗酸染色多呈深红色或不着色[3]。紫外激发光照射下,其卵囊壁在330~380 nm波长范围光谱下发蓝色荧光,在450~490 nm波长范围光谱下发绿色荧光[4]。环孢子虫的生活史是单宿主型,可以分为无性生殖和有性生殖阶段[2,5]。具有感染性的孢子化卵囊含有两个孢子囊,且每个孢子囊含有两个子孢子[2,6]

自Ashford[7]于1979年在巴布亚新几内亚的腹泻患者粪便中首次检测到环孢子虫卵囊,到目前包括非洲在内[8]的世界各地陆续有环孢子虫感染的报道。最初,环孢子虫被认为是球虫样或蓝藻样小体,随后到1994年才确定其分类地位[6]。1990年之前环孢子虫感染仅为散在的报道[1],自1996—1997年期间美国和加拿大有大规模环孢子虫病的暴发,对其传播来源追踪调查发现,此次暴发主要是由于误食从危地马拉进口的木莓而引起[1-2];2000年德国环孢子虫病暴发与法国和意大利南部农场出产的莴苣有关[9],这是欧洲首次对于环孢子虫病暴发的报道;再到2013年环孢子虫病在美国25 个州的暴发,造成了严重的危害[10],因此环孢子虫病越来越受到重视和研究。

1 环孢子虫的分类及遗传特性

1.1 分类

在分类上,环孢子虫属于顶复门孢子虫纲球虫亚纲艾美耳科环孢子虫属[2,6]。到目前为止,环孢子虫已报道的有19 个种[11](Cyclospora glomericola、C. caryolytica、C. viperae、C. babaulti、C. scinci、C. tropidonoti、C. zamenis、Cyclospra sp.、C. niniae、C. talpae、C. megacephali、C. ashtabulensis、C. parascalopi、C. angimurinensis、C. cayetanensis、C. cercopitheci、C. colobi、C. papionis、C. schneideri n. sp),宿主包括啮齿类、爬行类、非人灵长类和人类等,还发现哺乳动物的一些未定种[12-13]

1.2 遗传特性研究

微生物基因组中的保守区和高变区域的特征已经被广泛研究,进行相关的遗传特性研究。利用分子生物学工具研究的环孢子虫种只有从哺乳动物中获得的5 种,包括寄生于人体的C. cayetanensis[2]、寄生于非人灵长类的C. cercopitheci、C. colobi、C. papionis[14-16]和寄生于奶牛的环孢子虫[12]

应当注意的是18S rRNA基因具有高度保守性,因此,18S rRNA基因对区分人环孢子虫(C. cayetanensis)或其他环孢子虫种的不同分离株之间的亲缘关系十分有用。已经有研究者利用环孢子虫18S rRNA基因区分环孢子虫和其他的顶复门寄生虫[17]。另外,分析来源于人和狒狒的环孢子虫分离株的18S rRNA基因显示有1.6%~1.7%的差异,然而人和狒狒环孢子虫的分离株之间的差异分别有0.78%和0.73%[18]。在另一项研究中显示,C. papionis、C. colobi和C. cercopitheci的18S rRNA基因与人分离株有0.3%~0.6%的序列差异[14]。针对其他哺乳动物的环孢子虫的18S rRNA基因的研究也在进行,主要集中在非人灵长类和奶牛。高振永等[19]根据猴源环孢子虫18S rRNA基因序列,设计保守引物,并进行了特异性和敏感性实验。随后,Li Wei等[20]对从肯尼亚捕获的狒狒样品中,扩增了18S rRNA基因的部分序列,并对其进行了分子种系发育分析。

由于18S rRNA基因的高度保守性,限制了其区分亲缘关系较近物种的能力,因此要进行环孢子虫属内的鉴定,需要相对多态的序列作为靶基因。已经有运用高变异的ITS-1 基因区分了人环孢子虫(C. cayetanensis)和狒狒环孢子虫(C. papionis)。Olivier等[21]运用高变异的ITS-1区域序列区分人环孢子虫(C. cayetanensis)和狒狒环孢子虫(C. papionis),发现ITS-1序列为高度变异的区域,人环孢子虫和狒狒环孢子虫的ITS-1基因序列存在差异。考虑到C. cayetanensis分离株的ITS-1序列的变异性(0%~6.5%),内部转录间隔区(ITS)美国分离株(8.3%)比危地马拉分离株(3.8%)序列变异大,但是序列和地理差异没有相关性。从没有国外旅游历史的美国人获得的样品观察到序列有高变异性显示,环孢子虫主要呈地方流行性。5 份1996年在美国暴发时获得的分离株ITS-1序列相同,然而与在危地马拉和秘鲁分离株的ITS-1序列有差异。在所有的ITS-1基因序列中,共感染或多拷贝也许能解释ITS-1区域的变异性较大的原因。人环孢子虫(C. cayetanensis)和狒狒环孢子虫(C. papionis)的5.8S rRNA基因已经测序完成,经过校正以后的序列显示其高度的保守性。2013年,Sulaiman等[22]建立了一种基于HSP 70蛋白基因的快速检测人环孢子虫(C. cayetanensis)的方法,结果显示HSP 70蛋白基因在不同分离株之间未发现存在多态性。

环孢子虫卵囊需要在外界适当的条件下分化一段时间,才能发育为含有两个子孢子的具有感染性的孢子化卵囊。在食物或是水中的环孢子虫卵囊是否具有感染性,对于环孢子虫的传播感染是十分重要的。虽然聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)能有效地在不同样品中检测环孢子虫,但是不能区分孢子化和未孢子化卵囊。

2 环孢子虫的流行性

2.1 流行地区

表1 旅游者感染环孢子虫的报道[[22]]
Table 1 Case reports of Cyclossppoorraa infection in returning travelers[[22]]

注:小写字母表示该发病人员曾经去过多个国家和地区:a. 印度、柬埔寨、墨西哥、所罗门群岛、澳大利亚;b. 印度尼西亚、尼泊尔、所罗门群岛、英国、柬埔寨、泰国、远东、东南亚、印度、东南亚、摩洛哥、尼日利亚、坦桑尼亚、土耳其、墨西哥、孟加拉国、印度、墨西哥、保加利亚、印度尼西亚、尼泊尔;c. 巴布亚新几内亚、澳大利亚、巴厘岛;d. 越南、土耳其、黎巴嫩、哥伦比亚、东欧;e. 斯里兰卡、泰国、巴基斯坦、秘鲁、印度尼西亚、印度、南非;f. 越南、印度、巴厘岛、爪哇岛、巴基斯坦、多米尼加;g. 土耳其、印度、印度尼西亚、马达加斯加岛;h. 多米尼加、墨西哥、危地马拉、印度、马来西亚、印度尼西亚、斯里兰卡、土耳其、加蓬。

发病国家 旅游国家 发病人数 报道年份英国数个a 10 1992多米尼加 2 2000数个b 60 2005澳大利亚(昆士兰)数个c 5 1993印度尼西亚 1 1993美国墨西哥 2 1993海地 1 1995泰国 1 2007墨西哥 4 2007瑞典 数个d 5 1993荷兰 数个e 9 1993印度尼西亚 4 2003法国巴基斯坦 1 1993尼泊尔 2 1993数个f 13 1994印度尼西亚 1 2001数个g 6 2004比利时 印度尼西亚 2 1995加拿大 印度尼西亚 1 1995西班牙 数个h 20 1995危地马拉 7 2006澳大利亚 印度尼西亚 1 1996爱尔兰尼泊尔 2 1996巴基斯坦 1 1996尼泊尔 1 1998印度尼西亚 1 1998秘鲁 1 1998新西兰 越南 1 1997德国 新加坡 2 1997智利 古巴 1 1998希腊 摩洛哥 1 2005土耳其 希腊 1 2006墨西哥 秘鲁 1 2013

环孢子虫的感染主要集中在旅游者(表1)、艾滋病人和呈地方流行(无旅游史)地区的居民(表2)。1995年之前仅有散在环孢子虫感染的报道。1996—1997年间,美国和加拿大有大规模的环孢子虫病暴发,共有2 944 个环孢子虫感染病例[1]。自2000年以来,在美国、加拿大、英国、土耳其、哥伦比亚、南非等国家和地区相继暴发,总共超过550 例确诊环孢子虫病病例[2,23]。2014年墨西哥又报道了一例从秘鲁飞行回来的航空飞行员感染环孢子虫的病例[24],环孢子虫病越来越受到人们的重视。特别是2013年6月以来,截止9月20日,在美国包括纽约州在内的爱荷华州、内布拉斯加州和德克萨斯州等25 个州的643 例感染环孢子虫的确诊病例,有近8%的病例(49 例)由于严重腹泻而住院,目前还没有死亡的报道[10]。我国于1995年首次报道环孢子虫感染病例,随后浙江、安徽、云南等地均有环孢子虫感染病例报告[23,25]。2011年,Zhou Yang等[3]报道了河南省住院病人的环孢子虫感染情况。环孢子虫的流行性越来越受到国内外学者的重视。可见,环孢子虫病在世界范围内流行,在无论是像我国一样的发展中国家还是欧美发达国家都造成了严重的经济损失,甚至危及人们的生命健康。

表2 无旅游史的环孢子虫感染情况[[22]]
Table 2 Case reports of individuals with Cyclossppoorraa infection and without traveling history[[22]]

注:HIV+表示HIV阳性。

发病国家(地区) 发病人数 报道年份南非 3 1993美国 4 1993巴布亚新几内亚 3 1994马来西亚 4 HIV+ 1994危地马拉 4 感染有AIDS 1994意大利 2 感染有AIDS 1995孟加拉国(达卡) 6 感染有AIDS 1995美国 3 1995墨西哥 2 1996巴西 1 HIV+ 1997古巴 2 HIV+ 2000阿根廷(布宜诺斯艾利斯) 1 HIV+ 2000意大利 1 HIV+ 2000阿根廷 2 HIV+ 2004土耳其 6 2004土耳其 5 2006意大利 1 2008埃及 39 患者免疫缺陷 2012美国 1 2013

2.2 流行季节

环孢子虫病的暴发具有明显的季节性,多发生于温暖多雨的夏秋季节,这可能与感染性的孢子化卵囊需要一定的温度才能孢子化有关,又由于夏秋季节与水接触频繁而且有生食蔬菜和水果的习惯,同样为环孢子虫的传播创造了条件。经过5 年在秘鲁的调查结果表明,环孢子虫病多发于1—7月,而发病高峰集中在4—6月。同样有学者统计1995—1999年间美国和加拿大环孢子虫病的暴发,其中97.8%的感染集中在晚春和初夏季节,而4—7月为发病高峰期[1]。Hoge等[26]调查发现尼泊尔的环孢子虫感染主要发生在雨季,在危地马拉Bern等[27]通过对粪便样品的监测证实环 孢子虫病流行高峰期在7月份。2006—2009年期间,Ozdamar等[28]在土耳其伊斯坦布尔进行了人环孢子虫(C. cayetanensis)病流行病学调查,使用光学、荧光显微镜和改良抗酸染色的方法来检查环孢子虫卵囊,阳性样品扩增基因组的ITS-1区域进行确认,调查发现环孢子虫病集中发病于7月份的15 d内。2009—2010年,Zhou Yang等[3]对河南郑州和开封地区的临床住院病人进行了为期一年的肠道寄生虫调查,发现环孢子虫感染率为0.70%(81/11 554),并且感染具有明显的季节性,主要集中于夏秋季节(7—11月)。同样,2013年美国环孢子虫病的暴发,其感染者主要集中于6月中旬和7月中旬[10]

2.3 传播途径

目前尽管对环孢子虫的传播途径仍不是很清楚,但有不少研究报告认为环孢子虫主要通过食源性蔬菜或水果进行传播。1996—1997年之间,美国和加拿大的环孢子虫病暴发是由于食用从危地马拉进口的木莓引起[1]。1999年夏天,美国密苏里州环孢子虫病暴发是通过食用受环孢子虫卵囊污染的蔬菜沙拉而传播[1]。2000年欧洲首次环孢子虫病的暴发与从法国和意大利南部农场进口的莴苣有关[9]。2013年美国25 个州的环孢子虫病暴发,到目前为止还没有确定其感染来源,但存在以下可能,1)从墨西哥进口的农产品受到环孢子卵囊虫污染,从德克萨斯州货运到北部的爱荷华州、内布拉斯加州造成传播;2)由泰勒农场的农作物受到环孢子虫卵囊污染造成;3)大范围的水源污染也可能导致农产品的污染[10]。其中,2003年,Dowd等[29]在危地马拉市周围的乡村居民水源地检测到人环孢子虫的存在,这是首次在饮用水中发现环孢子虫,表明环孢子虫可能通过水源传播。之后,无论是用于灌溉或是蔬菜加工的水中都检测到了环孢子虫卵囊[30]

环孢子虫感染者的粪便中含有大量卵囊,因而粪便为该病的传染源[31]。然而大量的证据表明,环孢子虫卵囊可能是直接污染蔬菜类草本植物或是通过含有环孢子虫卵囊的水体被误食而引起人体的感染。环孢子虫卵囊在23~30 ℃的条件下贮藏7~15 d分化为含有两个孢子囊的具有感染性的孢子化卵囊才具有传染性,所以人与人之间是否能直接传播还有待进一步研究。表3列出了1990年至今环孢子虫食源性和水源性暴发流行的国家及地区、发病人数、发病传播媒介及可能来源,显示美国和加拿大的多个地区环孢子虫病的暴发与蔬菜、水果、食物或水源有直接关系。

表3 食源性和水源性暴发的环孢子虫感染情况[[22]]
Table 3 Reported food- and water-borne Cyclossppoorraa outbreaks[[22]]

暴发时间 发病国家(地区) 发病人数 传播媒介 传播媒介的来源1990年7月 美国(伊利诺伊州) 21 自来水 美国1994年6月 尼泊尔(博卡拉) 12 湖水和市政用水 尼泊尔1995年6月 美国(佛罗里达州) 38 草莓 危地马拉、智利1995年5—6月 美国(纽约) 32 食物 未知1995年9月 美国(佛罗里达) 38 未知 未知1996年5月 美国(波士顿) 57 甜点 浆果类1996年5—7月 美国/加拿大 1 465 草莓 未知1997年4—6月 美国/加拿大 1 012 草莓 危地马拉1997年12月 美国(佛罗里达州) 12 沙拉 秘鲁1997年7月 美国(弗吉尼亚北部、华盛顿州) 48 沙拉 未知1997年6—7月 美国(华盛顿州) 341 沙拉 多种蔬菜1997年3—5月 美国(佛罗里达) 220 草莓 危地马拉1997年9月 美国(弗吉尼亚) 21 蔬菜 未知1998年5月 美国(乔治亚州) 17 可能蔬菜沙拉 未知1998年5—6月 加拿大(安大略省) 221 草莓 危地马拉1999年8月 美国(密苏里州) 62 番茄罗勒沙拉 墨西哥1999年5月 加拿大(安大略省) 104 浆果甜点 未知1999年5月 美国(佛罗里达) 94 蔬菜、浆果 未知2000年12月—2001年6月 德国西南部 34 沙拉、草本植物 法国2000年6月 美国(宾夕法尼亚州) 54 草莓、蛋糕 危地马拉2001年4月 墨西哥(蒙特雷) 70 西洋菜 未知2001年9月 印尼(班格尔) 14 未知 未知2002年 中国(云南) 15 未知 未知2002年 中国(温州) 42 未知 未知2002年4月 哥伦比亚(麦德林) 31 沙拉和果汁 未知2003年 中国(安徽) 14 未知 未知2004年2月 美国(德克萨斯、伊利诺伊州) 95 未知 未知2004年6—7月 美国(宾夕法尼亚) 96 雪梨 危地马拉2004年11月 秘鲁(利马) 127 未知 食物2005年4月 美国(佛罗里达) 592 罗勒 餐厅2005年3月 秘鲁(利马) 45 未知 食物2005年9月 土耳其(伊兹密尔) 35 水 水2007年7—8月 土耳其(伊斯坦布尔) 286 未知 未知2009年1—6月 加拿大(不列颠哥伦比亚省) 17 罗勒 美国2009年4月 数个国家 160 未知 未知2011年 印度 9 未知 未知2013年6—9月 美国数个州 643 部分地区与沙拉有关 墨西哥

2.4 易感年龄

2006 年,Sancak等[32]报道了土耳其5 例年龄在27~67 岁之间,免疫功能正常的住院病人粪便中检测到环孢子虫卵囊;而王克霞等[33]对安徽省不同地区的环孢子虫感染情况进行的调查发现,有腹泻症状儿童的感染率为5.62%;2013年,Tandukar等[34]对尼泊尔的在校儿童的肠道寄生虫的调查发现,环孢子虫的感染率为1.6%,高于其他年龄段的环孢子虫感染情况。2011年进行的在对河南省郑州和开封两地为期两年的住院病人的肠道寄生虫的感染情况调查显示,环孢子虫的感染率为0.70%,其中7~17 岁年龄组的环孢子虫的检出率最高为1.47%[3]。2013年美国环孢子虫病大暴发,其感染年龄从不到1 岁至94 岁,平均年龄为52 岁[10]。可见环孢子虫的感染主要集中在免疫力低下的小孩和老人,但是环孢子虫在不同地区具有不同的流行传播特点,其易感人群也有所不同。

3 检 测技术

目前,研究者普遍怀疑环孢子虫的感染是由于患者食入被环孢子虫卵囊污染的罗勒、香菜、生菜、马郁兰和薄荷等草本植物类食物,或饮用被环孢子虫卵囊污染的水源,但随粪便排出的卵囊需在适宜的环境中数天至数周孢子化后才具有感染性。环孢子虫的检测对于环孢子虫病的流行病学研究有着特殊而重要的意义,是环孢子虫病防控的主要依据。

3.1 常规检测技术

环孢子虫的常规检测技术包括显微镜检测、改良抗酸染色和孢子化实验等方法。环孢子虫在光学显微镜下卵囊是一个近似球形的折射体,中间是桑葚胚,卵囊直径为8~10 μm,经改良抗酸染色多呈深红色,孢子化卵囊含有两个孢子囊,且每个孢子囊含有两个子孢子(图1)[3]。由于环孢子虫卵囊通常在草本植物和饮水中的含有量较少,在使用常规显微镜检测和改良抗酸染色检测时,需要将植物或是水体中的环孢子虫卵囊浓集,另外,传统的卵囊检测方法敏感性低、检测时间长、易造成检测人员眼疲劳、受到检测人员知识水平限制,以及粪便中的杂质会造成假阳性或假阴性等影响检测结果。

图1 环孢子虫卵囊形态结构(1 000×)[[33]]
Fig.1 Cyclospora cayetanensis oocysts examined by microscope (1 000 ×)[3]

a. 光学显微镜下粪便涂片中的卡耶坦环孢子虫卵囊经改良抗酸染色呈深红色或不着色;b. 微分干涉显微镜下湿片中的卡耶坦环孢子虫卵囊形态;c. 330~380 nm波长范围紫外激发滤镜表面荧光显微镜下卡耶坦环孢子虫卵囊形态。

3.2 流式细胞仪检测技术

近年来出现了一种新的检测环境中和临床样品中环孢子虫卵囊的方法,即流式细胞术。在荧光显微镜下使用330~380 nm波长范围的滤光器,环孢子虫卵囊发蓝光荧光[3],利用这个特性可以用于环孢子虫的检测和流行病学的调查。Dixon等[35]利用流式细胞计量术检测人粪便中的环孢子虫卵囊,李俊强等[36]建立了卡耶坦环孢子虫的流式细胞仪检测方法,结果显示该方法的敏感性比显微镜检查法高。由于粪便样品的时间和贮藏条件会影响卵囊荧光的强度,可能会影响检测结果。血清学筛选实验同样也可以用于环孢子虫的检测,有利于大范围的环孢子虫流行病学调查,但是由于目前还没有针对环孢子虫的特异性抗体,限制了其广泛应用。

3.3 分子生物学技术

分子生物学技术具有灵敏度高和特异性强的优点,微生物的基因组中的多变区域的特征已经被广泛的研究,以了解它们在流行病学中的地位,环孢子虫不同分离株之间的基因组学可以追踪其传染来源,在环孢子虫病的分子流行病学调查和检测研究中有重要的意义。

3.3.1 巢式PCR(nest-PCR)

2006 年,Helmy等[37]对显微镜镜检和nest-PCR检测环孢子虫卵囊这两种方法比较,结果显示nest-PCR方法具有更高的特异性和敏感性。Orlandi等[38]基于18S rRNA基因部分序列成功扩增了木莓样品中的环孢子虫,灵敏度可达30 个卵囊/100 g;同样利用PCR方法检测木莓、罗勒、莴苣中的环孢子虫(C. cayetsanensis)卵囊,灵敏度可分别达到40~100 个/100 g。针对其他哺乳动物的环孢子虫的18S rRNA基因的研究也在进行,主要为奶牛环孢子虫[12]和非人灵长类环孢子虫[14-16]的感染报道和分子鉴定等方面。

由 于ITS基因转录但不编码蛋白,因此它不具有结构功能的限制。长期以来,ITS基因已经用于植物基因组和进化的研究,同样ITS基因也可以作为环孢子虫分子鉴定的靶基因。针对ITS-1靶基因,许多学者扩增了多种环孢子虫的ITS-1基因序列。2000年,Adam等[39]研究了与木霉进口有关的环孢子虫暴发的病例分离株、危地马拉和秘鲁环孢子虫病的分离株进行ITS-1基因序列比较分析,结果发现单克隆基因组的ITS-1区域存在多样性。Ozdamar 等[28]在土耳其伊斯坦布尔进行了人环孢子虫阳性样品的ITS-1基因进行了扩增。ITS-1基因具有高的拷贝数,序列多变和长度适中等优点,致使这个基因成为基因分型的理想靶基因。

3.3.2 PCR-限制性片段长度多态性(PCR-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)

近年来,PCR-RFLP方法已被广泛用于各类寄生虫的分类与鉴定,该方法可有效地区分种间和种内差异,是研究亲缘关系较近 物种之间和物种内遗传结构的重要工具。2003年,Shields等[40]以18S rRNA基因为靶基因,并使用限制性内切酶AluⅠ,建立了一种检测环境水中环孢子虫卵囊的巢式PCR-RFLP方法,可以将环孢子虫的目的基因序列与可能发生交叉反应的其他序列区别。2006年,肖淑敏等[12]以进化速度相对较慢的18S rRNA基因为靶基因,设计了两对相对保守的引物利用巢式PCR进行扩增,并以KpnⅠ酶对PCR产物进行RFLP分析,结果显示扩增的18S rRNA基因片段为501 bp,不具有KpnⅠ酶切位点,与反刍兽的艾美耳球虫的酶切图谱具有明显的差别,进而将环孢子虫与艾美耳球虫区分。

3.3.3 PCR-寡核苷酸连接分析(PCR-oligonucleotide ligation assay,PCR-OLA)

Xiao Shumin等[41]建立了一种检测临床样品中环孢子虫卵囊的PCR-OLA,对牛源环孢子虫进行了检测,并且将PCR-OLA与常规PCR进行了比较,结果显示该方法比常规的PCR方法敏感度高,并且能够准确地检测单个核苷酸的不同,而且PCR-OLA在对临床上牛源环孢子虫卵囊的检测上,具有快速、简单、准确及灵敏度高等优点。

3.3.4 多重PCR(multiplex PCR)

Orlandi等[42]于2003年利用多重PCR,根据18S rRNA基因的单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphisms)设计了一系列种属特异性引物,对环孢子虫与艾美耳球虫进行了区分。2006年,Hussein[43]利用多重PCR对人环孢子虫(C. cayetanensis)、长尾猴环孢子虫(C. cercopitheci)、疣猴环孢子虫(C. colobi)和狒狒环孢子虫(C. papionis)进行了分子鉴定,与常规检测方法和Nest-PCR进行比较,并对来自35 个患者体内环孢子虫的18S rRNA基因的单核苷酸多态性进行分析,结果显示多重PCR具有较高的特异性和灵敏性。2010年,Lee等[44]建立了一种简单、快速、高效的多重PCR方法用于环孢子虫的检测,检测限为101~102 个卵囊。随后,Taniuchi等[45]检测了多重PCR的特异性,表明其对于环孢子虫暴发是有效的快速检测方法。

3.3.5 实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)

2003 年,Varma等[46]首次报道了qPCR技术在环孢子虫卵囊检测上的应用,其根据环孢子虫18S rRNA基因序列设计了一对特异性引物和两个荧光标记的杂交探针,结果显示qPCR最少可检测到5 μL反应体系中相当于单个环孢子虫卵囊的DNA。此外,针对环孢子虫的卵囊壁难于溶解和样品中存在较多影响PCR结果的制约因素,新的改进方法不断出现。2008年,Lalonde等[47]建立了一种敏感性高和特异性强的检测环孢子虫卵囊的PCR方法,该方法对水和罗勒洗涤液中不同数量级(分别为1 000、100、10、1)的卵囊进行DNA的反复提取,结果显示水和罗勒洗涤液中的卵囊数量级越高,用于环孢子虫PCR成功扩增所要提取的DNA次数就越少。

4 结 语

环孢子虫病例经常在世界各地散发感染,但是1996年美国和加拿大的大规模暴发、2000年欧洲的首次暴发、以及2013年美国环孢子虫的暴发,引起越来越多研究者的重视。我国有关环孢子虫感染的报道也时有发生,但其来源还未完全清楚,其流行病学和检测研究有待更进一步。因此,通过严格控制水源和食物源,避免环孢子虫的污染;加强检疫,建立方便可靠的检测方法,避免 随食品进口或长途运输而传播环孢子虫,成为防治的重点。另一方面,根据环孢子虫的流行病学特点和分子生物学手段追溯其来源也成为研究的热点和防治的基础。

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Advances in Research on Food-Borne Infection and Detection Methods of Cyclospora

LI Junqiang, SUN Fangfang, WANG Rongjun, ZHANG Longxian*

(International Joint Research Laboratory for Zoonotic Diseases of Henan, College of Animal Science and Veterinary Medicine, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

Abstract: Cyclospora is a newly discovered protozoan parasite that can infect intestinal epithelial cells. The pathogen can be transmitted by consumption of vegetables or fruits contaminated with oocysts. It mainly parasitizes humans and rodents, reptiles, mammals including non-human primates, and other animals. Cyclosporiasis as a sporadic infection or outb reak can cause human and animal gastroenteritis and diarrhea, and even lead to death along with serious economic loss. This article summarizes Cyclospora classification, genetic characteristics, epidemiological status and commonly used detection techniques in recent years.

Key words: Cyclospora; food-borne infection; epidemiology; detection techniques

doi:10.7506/spkx1002-6630-201507048

中图分类号:R382.3

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2015)07-0261-07

*通信作者:张龙现(1965—),男,教授,博士,研究方向为人兽共患原虫生物学。E-mail:zhanglx8999@gmail.com

作者简介:李俊强(1987—),男,博士研究生,研究方向为食源性病原生物学。E-mail:lijunqiangcool@126.com

基金项目:河南省高校人兽共患病病原生物学科研创新团队项目(012IRTSTHN005);“十二五”国家科技重大专项(2012ZX10004-220;2008ZX10004-011)

收稿日期:2014-07-02