图1 展青霉素的化学结构式
Fig.1 Chemical structure of patulin
郭彩霞，张生万，李美萍
（山西大学生命科学学院，山西 太原 030006）
摘 要：展青霉素是一种由真菌产生的次级代谢产物，普遍存在于腐烂的蔬菜、水果中，特别是苹果及其制品中。展青霉素具有广泛的生理及细胞毒性，对人的健康和安全构成了严重的威胁。近年来，采用生物防治方法控制苹果及其制品中展青霉素的污染已成为国际学术界研究的热点。本文综述生物防治方法控制苹果及其制品中展青霉素的研究进展，并论述展青霉素的生物防治机制，为推动生物防治方法在展青霉素控制方面的应用提供参考。
关键词：展青霉素；生物降解；生物吸附；拮抗作用；作用机理
展青霉素（patulin），又叫棒曲霉素，是一种由青霉属、曲霉属及丝衣霉属中多种霉菌或真菌产生的真菌毒素，能致癌、致畸、致突变且具有广泛的生理及细胞毒性[1-2]。展青霉素普遍存在于腐烂的蔬菜、水果中，特别是苹果及其制品中，给苹果产业带来了巨大的经济损失，同时对人的健康和安全构成了严重的威胁。尽管之前已有研究表明很多方法对展青霉素的控制及去除有一定效果，但是这些方法都未能达到既能有效降低展青霉素含量，又能保持苹果及其制品品质不变的商业应用标准。近年来，随着科学技术的发展，采用微生物清除食品中真菌毒素的方法已被科学界所关注，尤其是苹果上的拮抗微生物和利用失活微生物吸附展青霉素已经成为国际学术界研究的热点，本文将对生物防治展青霉素污染的研究进展进行综述，以期为微生物方法在食品工业中展青霉素的控制及应用提供参考。
1.1 结构与性质
展青霉素是一种内酯类化合物，其化学名称为4-羟基-4H-呋喃（3, 2C）骈吡喃-2（6H）酮，分子式为C7H6O4（图1），摩尔质量154.1 g/mol[3]。展青霉素为无色晶体，在酸性环境中稳定，但在碱性溶液中生物活性会受到破坏。其熔点为109～110 ℃，在真空中挥发温度为70～100 ℃；易溶于水、氯仿、丙酮、乙醇及乙酸乙酯等有机溶剂，微溶于乙醚、苯，不溶于石油醚[4]。
图1 展青霉素的化学结构式
Fig.1 Chemical structure of patulin
1.2 毒性
展青霉素对人类健康的危害主要体现在可以引发一系列急症、慢性病症以及细胞水平的病变（表1）。
啮齿动物展青霉素急性及亚急性中毒常伴有痉挛、肺出血、皮下组织水肿、肾淤血变性、无尿直至死亡。人摄入展青霉素后可引起呕吐和胃刺激症状。1953年日本发生的奶牛中毒事件，正是由于奶牛饲料受到了展青霉素污染造成的。中毒奶牛的症状包括神经麻痹、中枢神经系统水肿及灶性出血。小鼠注射展青霉素后出现皮下组织水肿、腹腔和胸腔积液、肾淤血及变性、明显肺水肿、呼吸困难、尿量减少，注射处出现水肿、感染、组织坏死。
表1 展青霉素对健康的影响
Table 1 Effects of patulin on human health
展青霉素还具有致癌性、致畸性和致突变性。研究人员在进行内酯类化合物致癌性实验时发现展青霉素具有致癌性，将展青霉素溶解在生油中，给两个月的雄性大白鼠皮下注射，最终引起皮下注射部分发生局部肉瘤。展青霉素对鸡胚有明显的致畸作用，使出壳后的小鸡表现外张爪、颅裂、喙畸形、突眼等症状。同时，展青霉素还能抑制植物和动物细胞的有丝分裂，有时伴有双核细胞的形成和染色体紊乱。
展青霉素的细胞毒性作用主要表现在改变细胞膜的通透性，有利于K＋外流，可抑制细胞中大分子物质合成，并能造成细胞中非蛋白质巯基耗竭，导致细胞活性丧失。Riley等[10]研究表明使用展青霉素对LLC-PK1细胞进行短暂的处理，其毒性作用是不可逆的。
1.3 展青霉素的污染
展青霉素在霉烂的杏、李、桃、梨、香蕉、菠萝、青梅[14]、蜜瓜、蕃茄、樱桃、辣椒、葡萄、柿子、黄瓜、胡萝卜、蕃茄酱、苹果汁、苹果酱、葡萄汁[15]、苹果制品、谷物、糕点及豆科植物[16]、陈的火腿、干香肠等[17]食品中均有发现。但它对水果及其制品的污染较为严重，尤其是苹果及其制品[18]。
20世纪50年代首次在苹果中发现展青霉素，之后世界各国均在苹果制品中检出展青霉素[19]。1978年，对芬兰的166 份苹果制品抽样检测发现20%～40%的样品产生展青霉素，其中进口产品中检出展青霉素的含量为50～690 μg/L[20]。随后在1979年，美国在威斯康星州路摊零售的苹果汁40 份中有23 份检出了展青霉素，含量在10～350 μg/L范围内，平均含量为50.7 μg/L；在华盛顿地区检测的13 份样品中有8 份检出展青霉素，含量在44～309 μg/L范围内[21]。1984年从佐治亚州采集的5 份消过毒的苹果汁中均检出展青霉素，含量在244～3 990 μg/L，平均含量1 902 μg/L[22]。之后，澳大利亚、智利、英国、日本、丹麦等国家对水果汁及果酱中展青霉素的污染状况进行调查，发现展青霉素不同程度的污染水果汁及果酱[23]。在我国，中国预防医学科学院等单位曾对我国各地水果制品中展青霉素的污染情况进行过调查，结果显示：76.9%水果制品的原汁、原酱等半成品均检出展青霉素，含量在18～953 μg/kg范围内，19.6%水果制品的成品检出展青霉素，含量在4～262 μg/kg范围内[24]。
1.4 展青霉素的限量标准
由于展青霉素对食品的污染及具有的毒性，相关管理机构对食品中展青霉素的限量进行了严格规定。欧洲国家率先规定食品中展青霉素限量标准为50 μg/L，欧盟除了规定果汁（特别是苹果汁及含苹果汁的酒精饮料）中展青霉素的最高限量为50 μg/L，还规定固体苹果产品及其制品中展青霉素的最高限量为25 µg/L，婴儿及儿童食品中展青霉素的最高限量为10 μg/L（表2）。2004年，美国食品药品监督管理局（U.S. Food and Drug Administration）规定浓缩苹果汁和苹果清汁中展青霉素的限量标准为50 μg/L。表3为我国对苹果及相关产品中展青霉素的限量标准（GB 2761—2011《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》）。与此同时，鉴于展青霉素的毒性及对人类健康的威胁，联合国粮食及农业组织与世界卫生组织联合组成的专家委员会对展青霉素的每天最高摄入量制定了一个0.4 µg/kg（以体质量计）的临时标准来更加严格地保障食品安全[2]。
表2 欧盟规定的食品中展青霉素限量标准
Table 2 Maximum allowable limits of patulin in foods stipulated by the European Commission
表3 我国规定的食品中展青霉素的限量指标
Table 3 Chiinnaa’ s maximum allowable limits of patulin in foods
注：该限量食品仅限于以苹果、山楂为原料制成的产品。
目前，对于展青霉素的控制方法，主要有物理方法、化学方法以及生物方法。其中，物理方法主要采用拣选、清洗、澄清、过滤、吸附、电磁辐射、微波处理以及紫外照射等措施对原料果及受展青霉素污染的苹果汁进行处理[25-28]。这些方法虽然能够有效降低展青霉素的含量，但不能完全杜绝。澄清、过滤等方法在去除展青霉素的同时，会引起果汁感官品质和理化性质的变化；而电磁辐射、微波处理以及紫外照射等手段，剂量低不足以完全降解展青霉素，剂量过高会引起果汁营养成分的损失。常用的化学去除方法有氨化作用、高锰酸钾氧化法、硫化处理、添加有机酸和维生素以及臭氧处理法等措施[29-32]。同样，这些方法在一定程度上能够实现对展青霉素的降解，但存在效果不稳定，化学物质与展青霉素反应机理和反应后的降解产物不确定等缺点。而且在食品中添加化学添加剂是不被提倡的，在一定程度上影响了食品的天然性。
为了寻求一种安全、有效的真菌毒素清除方法，20世纪60年代，人们开始尝试着用生物学资源进行真菌毒素的清除。采用微生物清除食品中真菌毒素的方法已被科学界所关注，清除过程包括微生物将毒素代谢为低毒或无毒产物和微生物菌体吸附毒素。因此，微生物去除展青霉素的方法被认为是最有希望取代物理、化学法去除展青霉素的措施。
2.1 降解微生物对展青霉素的控制
早在1977年，就有实验证实酵母发酵过程中大约有90%的展青霉素被降解[33]。1998年Devegowda等[34]首先发现酿酒酵母在体外能够清除大量真菌毒素。随后Stinson 等[35]研究结果表明受试的8 株酵母菌种有6 株对展青霉素的降解达到了检测极限以下，所有8 株菌种对展青霉素的降解率都能达到99%以上。实验还得出酵母发酵在将果汁中的展青霉素降解到检测极限以下的同时，未经酵母处理的果汁中的展青霉素只下降了10%。Coelho等[36]研究发现酿酒酵母菌（Saccharomy cescerevisiae）在25 ℃条件下培养143 h后，可以降解96%的展青霉素。Moss等[37]研究发现酿酒酵母菌在无氧发酵过程中能够降解展青霉素，而在有氧的环境中在酵母增殖阶段对展青霉素没有降解作用。Ricelli等[38]从苹果上分离得到了一株对展青霉素具有生物降解作用的氧化葡萄糖酸杆菌。Fuchs等[30]研究了30 种不同来源的乳酸菌对展青霉素的降解作用，并筛选出一株双歧杆菌（Bifidobacterium animalis），对展青霉素的去除率可以达到80%。Raffaello等[39]研究发现酵母菌Rhodosporidium kratochvilovae strain LS11能够降解展青霉素，并证明这个过程是微生物降解过程。
2.2 拮抗微生物对展青霉素的控制
研究发现酿酒酵母菌和乳酸菌对展青霉素的降解作用只适合于发酵产品中，并不适用于水果上展青霉素的控制，具有一定的局限性。近年来，拮抗微生物作为一种有效控制水果上真菌毒素的技术手段日益受到关注。
Levy等[40]研究发现毕赤酵母（Pichia membranifaciens）和掷孢酵母（Sporobolomyces roseus）在体外能够降解展青霉素。Castoria等[41]也发现粘红酵母（Rhodotorula glutinis）和罗伦隐球酵母（Cryptococcus laurentii）等生物防治酵母能够在体外培养环境下降解展青霉素。国外还将上述拮抗酵母的研究成功应用于水果上展青霉素的控制。例如，Morales等[42]研究在冷藏条件下（1 ℃）清酒假丝酵母菌（Candida sake）能够降低苹果上青霉病的发生率，同时还能抑制展青霉素的积累；Tolaini等[43]报道罗伦隐球酵母菌（Cryptococcus laurentii）在实验室条件及半商业贮藏条件下能够抑制扩展青霉素的生长以及展青霉素的产生。可见近年来拮抗酵母菌对于控制采后水果病害及展青霉素的发生取得了巨大的成就，拮抗酵母菌不仅能够抑制病原菌的生产，同时还能分解真菌毒素和抑制毒素的产生。
2.3 失活微生物对展青霉素的控制
目前，能够用于发酵降解展青霉素的产品非常有限，微生物降解展青霉素在苹果汁体系中的推广应用受到极大的限制。而失活微生物细胞吸附剂因其吸附效果好、潜在生物危害小、使用更安全等优点，具有非常广阔的应用前景和工业化利用价值[44-45]。因此，有学者研究利用失活微生物去除苹果汁中展青霉素的污染。
2011 年，Yue Tianli等[46]研究发现利用失活的苹果酒酿酒酵母能够成功降低苹果汁中展青霉素的含量，最大吸附量可以达到70.28%，并且保证苹果汁的基本理化指标不变。随后Guo Caixia等[47]比较了实验室筛选的具有最高吸附率的失活菌粉和商业失活酵母菌粉对苹果汁中展青霉素的吸附性能，结果发现实验室自制的失活菌粉吸附性能要优于商业失活酵母粉。同时该团队的另外一个博士Hatab[48]研究表明失活乳酸菌能够去除苹果汁中的展青霉素，并且保证苹果汁的基本理化指标不变。以上研究将失活微生物成功地应用于苹果汁中展青霉素的去除过程中，试图利用生物资源解决食品中真菌毒素污染，以及建立一套消除液体食品中毒素污染的处理方法。
3.1 微生物的降解作用
微生物能够改变毒素分子结构将毒素降解成无毒或者毒性较低的产物，从而达到降低展青霉素含量和毒性的目的。对于微生物对展青霉素的降解机理，国外有很多学者进行了相关的研究。Coelho等[49]在奥默毕赤酵母体外降解展青霉素的研究中发现，展青霉素含量降低的同时pH值也发生了改变，从初始pH 4.0降低至pH 3.3，因为展青霉素在pH 2.5～5.5范围内性质稳定不容易分解。由此推断，展青霉素含量降低不是本身分解的原因，也不是细胞壁的吸附作用所致，而是奥默毕赤酵母的代谢作用[49]。Castoria等[41]研究发现活酵母菌体能够具有清除展青霉素的能力，而经高压蒸汽灭菌的失活菌体却丧失了清除展青霉素的能力，这说明活体酵母清除展青霉素是通过生物降解作用的，而不是酵母壁的吸附作用。Reddy等[50]研究了美极梅奇酵母菌株（MACH1和GS9）对展青霉素的降解作用，之后采用超声波破碎酵母细胞后用乙酸乙酯提取，在提取液中未检测出展青霉素，结果表明展青霉素是被美极梅奇酵母彻底降解了，而不是通过酵母细胞吸收清除的。以上研究排除了微生物细胞对展青霉素的吸附作用，证实活体微生物对展青霉素的去除作用主要是通过代谢降解实现的。
同样地，Harwig等[51]发现酿酒酵母在苹果汁中发酵14 d后能够将展青霉素完全降解。如果将酿酒酵母滤除，并在滤液中添加展青霉素，之后苹果汁中展青霉素的含量没有明显变化，结果显示降低展青霉素的是活体酿酒酵母，而不是酵母发酵的代谢产物。Sumbu等[52]报道酿酒酵母发酵可在2 周之内将苹果汁中的展青霉素降解到检测极限以下，而未经酿酒酵母处理的苹果汁中的展青霉素在同样时间内只下降了10%，如果将已发酵果汁中的酵母过滤掉，展青霉素含量在该苹果汁中得不到明显降低，说明对展青霉素起降解作用的是活体酵母，而不是酵母发酵后的代谢产物。如果进一步在酵母发酵的过程当中添加一种酵母蛋白质合成阻滞剂——环己酰胺（cyclohexamide），将完全阻止酵母蛋白质的合成并影响展青霉素的降解。在展青霉素添加3 h之后再添加环己酰胺，尽管展青霉素还能继续被酵母降解，但是其降解速率呈下降趋势，说明在这3 h内合成的蛋白对展青霉素具有酶催化活性，而不是合成了简单参与化学反应的反应底物。说明展青霉素的降解是通过活体细胞在发酵过程中进行的，展青霉素的降解都需要活体酵母，展青霉素的降解是酵母细胞对展青霉素产生的诱导酶的酶促反应作用的结果。
对于微生物降解展青霉素的降解产物，Moss等[37]实验采用3 株酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）对展青霉素进行降解，经高效液相色谱、薄层层析和核磁共振光谱分析，结果发现降解过程中会产生两种主要物质：一种是E-ascladiol，展青霉素合成的直接前体物质；另一种则是它的异构体Z-ascladiol。Ricelli等[38]发现植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）在降解展青霉素的过程，4 h之内80%的展青霉素转化成E/Z-ascladiol，随着时间的延长E/Z-ascladiol量不断减少，形成一种新的产物Hydroascladiol。Raffaello等[39]研究发现酵母菌Rhodosporidium kratochvilovae strain LS11在降解展青霉素的过程中形成另外一种低毒性的产物Desoxypatulinic acid（图2）。并推断，菌种之间的差异导致降解途径存在一定的差异性，其降解产物也不相同。
图2 展青霉素降解产物
Fig.2 Degradation products of patulin
3.2 微生物的拮抗作用
目前研究发现，粘红酵母、毕赤酵母和罗伦隐球酵母等酵母在水果采后病害生物防治上已经表现出良好的生物防治效果，并能够有效降低苹果上展青霉素积累量。对于其防治机理，研究人员普遍认为是通过与病原菌的营养和空间竞争，分泌抗菌性物质来抑制病害的发生，通过抑制病原菌来降低展青霉素的产生及积累。Sharma等[53]研究发现酵母拮抗菌能够迅速生长，与病原菌争夺如碳水化合物、氮源等营养物质，同时占领全部空间，使得病原菌得不到合适的营养与空间，从而抑制病原菌的生长以及病害的发生。Chan Zhulong等[54]研究白色隐球酵母（Cryptococcus albidus）和拮抗菌膜醭毕赤酵母（Pichia membranefaciens）对采后苹果3 种病害的防治效果，结果发现酵母拮抗菌分泌细胞壁水解酶活性与酵母菌对该种病原菌在果实上的抑菌效果呈正相关。酵母拮抗菌还能诱导产生相关蛋白（pathogenesis related protein）如几丁酶和β-1,3-葡聚糖酶的表达及抗性酶的生成，从而增强了酵母拮抗菌对病原菌的抗性机制。例如异常毕赤酵母（Pichia anomala）和膜醭毕赤酵母（Pichia membranifaciens）能产生毒性蛋白对病原真菌进行抑制[55-56]。
3.3 细胞壁的物理吸附作用
微生物能够将展青霉素吸附到细胞壁上形成复合物，从而达到降低毒素的目的，研究表明这种物理吸附作用与细胞壁成分有密切关系。Guo Caixia等[57]研究发现酵母菌有去除展青霉素的能力，并且利用物理、化学、酶等不同手段处理细胞壁上的多糖、脂质和蛋白质，结果发现经过处理多糖和蛋白质后的菌体能够增加吸附能力。由此推断，细胞壁上的多糖和糖蛋白是细胞壁上起主要作用的成分。同时发现该吸附是一个可逆过程，经不同洗脱剂对菌体洗脱后，分析发现不同洗脱剂能不同程度地从吸附毒素的菌体上解析展青霉素，并且乙酸乙酯可以解析近50%的毒素，这个结果再次说明酵母菌对展青霉素的去除作用是物理吸附。Hatab等[48]利用乳酸菌对展青霉素进行去除，并且利用红外光谱仪分析其机理，研究发现乳酸菌是通过细胞壁上的肽聚糖对展青霉素进行吸附的。
近年来，国内外食品安全负面事件的频繁发生导致全社会对食品安全的关注程度不断提升。其中苹果及其制品中展青霉素的污染不仅对人的身体健康产生严重的威胁，而且也成为我国水果及其制品出口创汇的技术壁垒。因此，安全有效地将展青霉素降低到对人体有害的极限以下，已成为当今世界苹果产业快速、健康发展的关键问题之一。传统控制展青霉素的方法，如物理、化学方法，不仅不能完全杜绝展青霉素的污染，而且还会引起苹果及其制品感官品质和理化性质的变化。与传统方法相比，生物防治方法由于采用特定微生物对展青霉素进行去除，成本低、操作简单、效果显著，是一种发展前景十分广阔的新型污染物处理方法。目前国内外对有关微生物去除展青霉素的研究，大多集中在微生物对展青霉素降解的体外实验，关于利用拮抗微生物以及失活微生物去除展青霉素的研究在近几年刚刚起步。而且有关微生物去除展青霉素机理方面的研究较少，不能系统全面地解读微生物清除展青霉素的作用方式，从而制约了生物防治技术在水果及其制品中展青霉素控制上的应用。因此，未来的研究工作应该主要集中在生物防治机理方面的研究，用分子生物学手段获得降解展青霉素的酶等物质的表达基因，寻找对展青霉素具有吸附作用的物质，并通过纯化或化学合成得到高效吸附展青霉素的物质，最终将其应用于食品生产过程中，有效控制食品中真菌毒素的污染。
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GUO Caixia, ZHANG Shengwan, LI Meiping
(College of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030006, China)
Abstract: Patulin, a secondary metabolite produced by fungi, frequently occurs in rotten vegetables and fruits, especially in apple and apple products. Patulin has extensive physiological and cytological toxicity, and constitutes a serious threat to people’s health and safety. In recent years, biological control of patulin in apple and its products has become a hot topic among international researchers. In this article, the methods and mechanisms for biological control of patulin contamination are reviewed.
Key words: patulin; biodegradation; bioadsorption; antagonism; mechanism
doi:10.7506/spkx1002-6630-201507051
中图分类号：TS201.6
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2015）07-0283-06
作者简介：郭彩霞（1984—），女，讲师，博士，研究方向为食品安全与生物技术。E-mail：guocx@sxu.edu.cn
基金项目：山西大学引进人才建设项目（011351801001）
收稿日期：2014-04-16