贺 伟，刘永乐*，王发祥
（长沙理工大学化学与生物工程学院，湖南 长沙 410 114）
摘 要：磨皮粉是红莲子加工时机械磨皮的副产物，不仅产量很大，而且营养成分丰富，若不综合利用会导致严重的资源浪费。通过Plackett-Burman试验→最陡爬坡试验→响应面试验的模式设计方法，考察温度、时间等因素对磨皮粉蛋白质提取率的影响，获得磨皮粉蛋白质提取的最优条件是Na 2CO 3-NaHCO 3缓冲液浓度0.03 mol/L、液固比17.5∶1（mL/g）、pH 10.5、提取温度20 ℃、提取时间1 h、搅拌间隔时间10 min、超声时间7.5 min，此时蛋白质提取率达93.38%。
关键词：莲子；莲子磨皮粉；蛋白质；响应面法
莲子是我国特有的种质资源，属睡莲科多年水生草本植物莲的成熟种子。我国莲子种植面积150多万亩，主要集中在湖南、湖北、江苏、浙江、江西、福建等地区省市 [1-5]。莲子自古以来就是我国及东亚、东南亚人民所喜爱的珍贵营品，其味道清香，营养丰富，滋补疗效显著，而且蛋白质、维生素、糖及钙、磷等多种人体必需的基础营养物质含量也较高 [6-12]。因此，莲子相关产品深受消费者喜爱，市场前景广阔，莲子的加工率和加工水平也在逐年提高。
在干莲子加工过程中，为避免相关产品的外观和口感受到影响，常常需要经过机械处理去掉莲子表面棕红色的种皮，机械磨皮过程会产生约占莲子总质量1/5的莲子磨皮粉，其不仅产量巨大，而且营养丰富，其中蛋白质含量为18%～19%，淀粉含量更是高达40.00%。然而，在实际生产中，磨皮粉大多成了低值废弃物，主要用于生产饲料甚至直接扔掉，造成了严重的资源浪费和环境污染 [13-14]。因此研究莲子磨皮粉的高值化利用技术，对提高莲子的综合价值和保护环境都有着重要的实际意义。
近年来，莲子磨皮粉的综合利用开始受到关注，研究人员也开展了一些相关的研究，如陈轩等 [15]对莲子皮的化学成分进行了初步分析，徐虹等 [16-17]采用微波盐提法优化了莲子皮蛋白质提取工艺，但研究仍不够深入。本研究创新采用Na 2CO 3-NaHCO 3缓冲液 [18]代替传统的盐或碱提取液，通过Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验、响应面试验优化磨皮粉蛋白质提取条件，为将莲子磨皮粉用于生产莲子蛋白粉或其他含莲蛋白食品及实现莲子磨皮粉的综合利用提供理论依据。
1.1 材料与试剂
莲子磨皮粉由湖南粒粒珍湘莲有限公司提供。
无水Na 2CO 3、NaHCO 3、浓硫酸、硫酸钾、硫酸铜、甲基红、溴甲酚绿等均为分析纯。
1.2 仪器与设备
ATN-300全自动凯氏定氮仪 上海洪纪仪器设备有限公司；BL-620S岛津电子天平 日本岛津公司；LG10-2.4A型高速离心机 北京京立离心机有限公司；高速万能粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 莲子磨皮粉的制备
莲子磨皮粉经高速粉碎机粉碎后过80 目筛，分装，置于干燥器中备用。
1.3.2 蛋白质含量及提取率的测定
参考GB/T 5009.5—2003《食品中蛋白质的测定》 [19]，测定磨皮粉中蛋白质含量。准确称取一定量的磨皮粉，在一定条件下提取蛋白质后离心，将上液定容至100 mL，再取5 mL进行消化，以凯氏定氮法测定提取液中的蛋白质含量。按下式计算蛋白质提取率。
1.3.3 提取液的筛选
分别以蒸馏水、0.5 mol/L NaCl溶液、0.1 mol/L Na 2CO 3-NaHCO 3缓冲液（pH 9.15）、0.2 mol/L NaH 2PO 4-Na 2HPO 4缓冲液（pH 7.0）对莲子磨皮粉的蛋白质进行提取，以蛋白质提取率为指标，选择合适的提取液。
1.3.4 Plackett-Burman筛选显著因子
根据经验及前期实验摸索，选取Na 2CO 3-NaHCO 3缓冲液作为蛋白质提取剂，对缓冲液浓度、pH值、液固比、提取温度、提取时间、超声时间、搅拌间隔时间这7 个影响蛋白质提取效果的因素进行考察，以莲子磨皮粉蛋白质提取率为响应值，根据试验结果对因素进行显著性评价（P＜0.05），筛选出显著性因子。试验因素及水平见表1。
表 1 Plaekett-Burman试验因素及水平
Table 1 Factors and levels used in Plackett-Burman design
编号因素水平-11 X 1Na 2CO 3-NaHCO 3缓冲液浓度/（mol/L）0.050.1 X 2pH9.1510.00 X 3液固比（mL/g）10∶115∶1 X 4空列1-11 X 5提取温度/℃2037 X 6提取时间/h0.51 X 7空列2-11 X 8超声时间/min57.5 X 9搅拌间隔时间/min1015
1.3.5 最陡爬坡试验确定中心点
根据Plackett-Burman试验结果，选取Na 2CO 3-NaHCO 3缓冲液浓度、液固比、pH值3 个显著因素进行最陡爬坡试验，其他各因素则根据效应系数正负选择相应的水平，从而快速地接近最大响应区域。
1.3.6 Box-Behnken试验设计
以最陡爬坡试验确定的提取率响应值最大的条件为中心点，以Design-Expert 8.0.5b软件进行Box-Behnken试验设计，试验因素与水平见表2。
表 2 Box-Behnken试验因素水平
Table 2 Factors and levels used in Box-Benhnken design
变量水平-101 A Na 2CO 3-NaHCO 3缓冲液浓度/（mol/L）0.010.030.05 B液固比（mL/g）16∶118∶120∶1 C pH9.710.110.5
2.1 最佳提取液选择结果
表 3 不同提取液提取效果
Table 3 Effect of different extract solvents on the extraction efficiency of protein
测定序号提取液提取率/% 1蒸馏水56.93 2 0.5 mol/L NaCl溶液62.11 30.1 mol/L Na 2CO 3-NaHCO 3缓冲液（pH 9.15）70.09 40.2 mol/L NaH 2PO 4-Na 2HPO 4缓冲液（pH 7.0）60.81
采用不同提取液对莲子磨皮粉蛋白质进行提取，结果如表3所示。根据提取率的结果可知，0.1 mol/L Na 2CO 3-NaHCO 3缓冲液（pH 9.15）对磨皮粉蛋白质的提取率最高，以其为最佳提取液，进行下一步实验。
2.2 Plackett-Burman试验结果
表 4 Plaekett-Burman试验设计与结果
Table 4 Plackett-Burman design and experimental results
Table 4 Plackett-Burman design and experimental results
试验号X 1Na 2CO 3-NaHCO 3提取率/% 1-111-11﹣1-1﹣1193.32 2-1-1-1-1-1-1-1-1-187.65 3 11-111-11-1-181.91 4 11-11-1-1-11186.27 5 1-111-11-1-1-190.17 6-1-1-1111-11186.04 7 1-1-1-1111-1182.19 8-1-1111-111-189.61 9-1111-111-1192.94 101-11-1-1-111185.81 11-11-1-1-1111-190.20 12111-111-11191.13缓冲液浓度X 2pHX 3液固比X4空列1 X 5提取温度X 6提取时间X 7空列2X 8超声时间X 9搅拌间隔时间
Plackett-Burman法是一种近饱和的二水平试验设计方法。它能用最少试验次数估计出因素的主效应，以便快速有效地从众多考察因素中筛选出最为重要的几个因素供进行下一步研究 [20-23]。采用N=12的Plackett-Burman试验设计，结果如表4所示。
表 5 Plackett-Burman试验结果的估计效应和系数
Table 5 Analysis of variance (AVONA) of Plackett-Burman experimental results
效应系数T值P值常数项0.881 03223.100.000 X 1Na 2CO 3-NaHCO 3缓冲液浓度-0.037 13-0.018 57-4.700.042 X 2 pH0.023 830.011 923.020.095 X 3液固比0.047 870.023 936.060.026 X 5提取温度-0.014 73-0.007 37-1.870.203 X 6提取时间0.013 500.006 751.710.230 X 8超声时间0.001 470.000 730.190.870 X 9搅拌间隔时间-0.006 83-0.003 42-0.870.478项
图 1 标准化效应的Pareto图（响应为提取率，α=0.01，临界值2.920）
Fig.1 Pareto chart of the standardized effects (response for the extraction yield, α = 0.01)
用Minitab 16软件对表4中的Plackett-Burman试验结果进行分析，得到各因素的方差分析结果（表5）以及标准化效应的Pareto图（图1）。经分析可知Na 2CO 3-NaHCO 3缓冲液浓度、提取温度、搅拌间隔时间对磨皮粉蛋白质提取率显示出负效应，而pH值、液固比、提取时间、超声时间显示为正效应。标准化效应的Pareto图则显示在90%的置信水平内，液固比、Na 2CO 3-NaHCO 3缓冲液浓度以及pH值的效应最大，对提取率响应值影响显著。
2.3 最陡爬坡试验结果
最陡爬坡试验是一种通过连续增加或减少显著因素的试验值以使响应值快速逼近最佳值区域的程序，其爬坡的方向由各因素效应系数的正负决定，变化步长则根据经验及相关效应值的大小来确定。最陡爬坡试验确定的显著因素的变化幅度分别为Na 2CO 3-NaHCO 3缓冲液浓度0.01 mol/L、pH 0.2、液固比2∶1，提取时间和搅拌间隔时间取Plackett-Burman试验时的高水平，其余因素取值Plackett-Burman试验时的低水平。分析最陡爬坡试验结果（表6）可知：0＋3Δ号试验组的提取率响应值达93.30%，为最大值，之后响应值开始下降。选取此试验条件作为Box-Behnken响应面设计的中心点。
表 6 最陡爬坡试验设计及结果
Table 6 Steepest ascent design and experimental results
试验号Na 2CO 3-NaHCO 3缓冲液浓度/（mol/L）pH液固比（mL/g）提取率/% 0 0.069.512∶182.25 0＋1Δ0.059.714∶185.75 0＋2Δ0.049.916∶190.63 0＋3Δ0.0310.118∶193.30 0＋4Δ0.0210.320∶189.33
2.4 Box-Behnken试验结果
表 7 Box-Behnken试验设计及结果
Table 7 Box-Behnken design and experimental results
Table 7 Box-Behnken design and experimental results
试验号A Na 2CO 3-NaHCO 3缓冲液浓度/（mol/L）（mL/g）C pH Y 提取率/% 1 0.0318∶110.192.18 2 0.0318∶110.193.32 3 0.0518∶19.789.74 4 0.0120∶110.185.18 5 0.0118∶110.589.21 6 0.0516∶110.189.09 7 0.0520∶110.186.91 8 0.0316∶19.788.63 9 0.0320∶110.589.76 100.0320∶19.788.58 110.0318∶110.192.93 120.0116∶110.187.11 130.0316∶110.592.17 140.0518∶110.591.01 150.0118∶19.789.44 B液固比
表 8 Box-Behnken试验结果方差分析
Table 8 ANOVA of Box-Behnken experimental results
来源自由度平方和均方F值P值显著性模型972.848.0513.300.005 4显著A Na 2CO 3-NaHCO 3缓冲液浓度14.224.226.970.046 0显著B液固比15.405.408.910.030 6显著C pH14.154.156.850.407 3 AB10.0160.0160.0260.878 7 AC10.560.560.930.379 5 BC11.391.392.300.189 9 A 2129.7029.7049.040.000 9显著B 2131.0831.0851.310.000 8显著C 210.0570.0570.0930.772 3残差53.030.61失拟项32.360.792.340.313 4不显著纯误差20.670.34总变异1475.51
响应面试验的设计及结果分析见表7。利用Design-Expert 8.0.5b软件对试验结果进行二次多元回归拟合 [24-26]，编码回归方程Y=92.81＋0.73A-0.82B＋0.72C-0.062AB＋0.38AC-0.59BC-2.84A 2-2.90B 2-0.12C 2，而实际因素的回归方程为：莲子磨皮粉蛋白质提取率=-360.067 42＋16.437 50A＋33.196 25B＋29.292 19C-1.562 50AB＋46.875 00AC-0.737 50BC-7090.625 00A 2-0.725 31B 2-0.773 44C 2，为了验证模型的有效性，进行了方差分析（表8）。如表8所示，A、B、A 2、B 2为显著性影响因素，其他变量的影响均不显著（P＞0.05）。该回归模型的P值为0.005 4（小于0.01），即模型显著拟合程度好。同时失拟项P值为0.313 4（大于0.05），即失拟项不显著，说明该响应面能够较真实地反映试验结果，有实际应用意义，可用此模型对莲子磨皮粉蛋白质的提取效果进行分析预测。
图 2 Na
2CO
3-NaHCO
3缓冲液浓度和液固比对提取率的影响
Fig.2 Effect of Na
2CO
3-NaHCO
3concentration and solvent-to-solid ratio on the extraction efficiency of protein
图 3 Na
2CO
3-NaHCO
3缓冲液浓度和pH值对提取率的影响
Fig.3 Effect of Na
2CO
3-NaHCO
3concentration and pH on the extraction efficiency of protein
图 4 液固比和pH值对提取率的影响
Fig.4 Effect of solvent-to-solid ratio and pH on the extraction efficiency of protein
从图2 Na 2CO 3-NaHCO 3缓冲液浓度与液固比的交互作用显示，在液固比17∶1～18∶1、Na 2CO 3-NaHCO 3缓冲液浓度0.02～0.04 mol/L范围内，莲子磨皮粉蛋白质提取率响应值可达最佳区域。且提取率随着液固比及Na 2CO 3-NaHCO 3缓冲液浓度的增加先升高后降低。图3和图4显示莲子磨皮粉蛋白质提取率随pH值的升高而增大，但是幅度不大。从以上3个图可知提取液浓度和液固比对应的曲面比较陡峭，说明这两个因素相对结果影响显著，这与方差分析的结果一致。结合响应面及等高线图可知，莲子磨皮粉蛋白质提取率的最佳取值范围位于Na 2CO 3-NaHCO 3缓冲液浓度0.02～0.04 mol/L、液固比17∶1～18∶1、pH 10.1～10.5。为了进一步确定变量的最佳取值点，通过Design-Expert 8.0.5b软件的Optimization功能，计算得到蛋白质提取率有最大响应值时3 个因素的取值，即Na 2CO 3-NaHCO 3缓冲液浓度0.03mol/L、液固比17.51∶1、pH 10.5，该条件预测条件下的莲子磨皮粉蛋白质提取率为93.687 7%。
在修正后的最优条件Na 2CO 3-NaHCO 3缓冲液浓度0.03 mol/L、液固比17.5∶1、pH 10.5、提取温度20 ℃、提取时间1 h、搅拌间隔时间10 min、超声时间7.5 min条件下进行3 次验证实验，测得蛋白质的提取率为93.38%，比预测值略低，说明用该回归方程分析所获得的优化提取条件是可信的。
通过Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验、响应面试验获得磨皮粉蛋白质提取的最优条件是Na 2CO 3-NaHCO 3缓冲液浓度0.03 mol/L、液固比17.5∶1、pH 10.5、提取温度20 ℃、提取时间1 h、搅拌间隔时间10 min、超声时间7.5 min，此时蛋白质提取率可达93.38%。
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Optimization of Extraction Process for Peel Waste Protein from Lotus Seeds by Response Surface Methodology
HE Wei, LIU Yongle*, WANG Faxiang
(College of Chemical and Biological Engineering, Changsha University of Science and Technology, Changsha 410114, China)
Abstract：A large amount of red lotus peel waste, which contains abundant nutrients, is produced during mechanical peeling of red lotus seeds. Accordingly, insufficient utilization of this byproduct is a serious waste of resource. The present study examined the impact of various factors on the extraction efficiency of protein from lotus seed peel waste by the combined use of Plackett-Burman design, steepest ascent design and response surface methodology. We found that 0.03 mol/L Na 2CO 3-NaHCO 3buffer solution at pH 10.5 was the best solvent for the extraction of lotus seed peel waste protein. A solvent-to-solid ratio of 17.5:1, an extraction temperature of 20 ℃ and 1 h extraction proved optimal, resulting in an extraction yield of 93.38%.
Key words：lotus seed； peel waste； protein； response surface analysis
中图分类号：TS201.6；TS207.4
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2015）08-0024-05
doi：10.7506/spkx1002-6630-201508005
收稿日期：2014-09-26
基金项目：“十二五”国家科技支撑计划项目（2012BAD31B08）
作者简介：贺伟（1989—），女，硕士研究生，研究方向为大宗农产品加工技术。E-mail：583346178@qq.com
*通信作者：刘永乐（1962—），男，教授，博士，研究方向为大宗农产品加工技术。E-mail：1y1e19@163.com