金黄色葡萄球菌标准物质的研制

薛 蕾 1,2,隋志伟 1,*,张 玲 1,王 晶 1,傅博强 1,刘瑛颖 1,郝 林 2

(1.中国计量科学研究院,北京 100029;2.山西农业大学食品科学与工程学院,山西 太谷 030800)

摘 要:将金黄色葡萄球菌添加到复合保护剂中,经冻干制备成干粉状标准物质,通过比较冻干前后活菌数来验证保护剂保护效果,并研究标准物质的均匀性和稳定性。结果表明复合保护剂的保护率达到51.74%,可以在冻干过程中有效保护菌体,制备的金黄色葡萄球菌标准物质均匀性良好,可以稳定保存半年。该标准物质可用于食品检测实验室质量控制和食品中金黄色葡萄球菌检测结果的评价。

关键词:金黄色葡萄球菌;冷冻干燥;保护剂;标准物质

世界卫生组织曾公告,食源性疾病和食品污染已成为世界性公共卫生问题,保证食品中低于致病量的致病性微生物是食品安全工作的重要方面 [1]。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是引起细菌性食物中毒的重要病原菌之一。

美国疾病控制与预防中心报告显示,由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒占第2位,仅次于大肠杆菌,占整个细菌性食物中毒的33% [2]。近年来,我国每年由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒已居第四位 [3]。2011年我国新出台的GB 19295—2011《速冻面米制品》和2014年7月1日即将实施的GB 29921—2013《食品中致病菌限量》都对金黄色葡萄球菌检测作出了明确规定,不仅加大了对金黄色葡萄球菌的监测力度,也改变了过去“不得检出”的定性判断,体现了我国食品安全微生物检验国家标准向限量测量发展的方向。因此,针对金黄色葡萄球菌的准确测量,越来越受到有关专家和学者的关注 [4]

在食品安全领域,国际、国内针对微生物标准物质的研制才刚刚起步,相关标准物质极其匮乏,在研制金黄色葡萄球菌的标准物质方面甚至是空白 [5-7]。因此有必要研制金黄色葡萄球菌标准物质,以保证金黄色葡萄球菌定量检测结果的准确和可靠。本研究目的是要建立金黄色葡萄球菌标准物质的制作方法,并研制得到稳定性较好、重复性较高的金黄色葡萄球菌标准物质,符合我国国情、也符合国际微生物计量发展的需要。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

金黄色葡萄球菌(Staphlyococcus aureus)标准菌株(ATCC,菌株编号10384)由中国计量科学研究院保存;Baird-Parker培养基、亚碲酸钾卵黄增菌液、磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)、无菌生理盐水(0.85%) 北京陆桥技术有限责任公司;脱脂奶粉雀巢有限公司;海藻糖、可溶性淀粉、谷氨酸钠、麦芽糊精、抗坏血酸钠 美国Sigma公司;棕色西林瓶(经高压灭菌处理后使用) 深圳市宝安区沙井博海玻璃制品厂。

1.2 仪器与设备

Beta1-8 LD plus冷冻干燥机 德国Christ公司;HWS-400恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司;HZQ-X160恒温双层振荡培养箱 苏州培英实验设备有限公司;CR21G高速冷冻离心机 日本Hitachi公司;HVE-50高压灭菌锅 日本Hirayama公司;Milli-Q Advantage纯水仪 美国Millipore公司;DensiChek麦氏比浊仪 法国梅里埃公司;CP225D电子天平 德国Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种复活、鉴定与培养

将冷冻保存的标准菌株在营养琼脂上划线复活,37 ℃,培养18~24 h。从平板上挑取单个金黄色葡萄球菌菌落接种到营养肉汤中,37 ℃,培养18~24 h,取菌液接种到Baird-Parker培养基上,37 ℃至长出菌落后,随机挑取10 个菌落进行革兰氏染色后在显微镜观察,细菌排列呈葡萄球状,无芽胞,无荚膜,直径约为0.5~1 µm则初步鉴定为金黄色葡萄球菌,再接着做血浆凝固酶实验,如呈现凝固或凝固体积大于原体积一半者则最终确定为金黄色葡萄球菌 [8]

1.3.2 制备方法

在冷冻干燥的过程中,温度降低和水分蒸发(冰晶体的形成)对菌种活性会造成很大的影响,为了提高菌种在喷雾过程中的存活率,向菌液中加入保护剂是一种非常有效的方法,保护剂的种类繁多,一般分为4大类:渗透型抗冻剂、非渗透型抗冻剂、抗氧化剂、胶体 [9]。不同比例的保护剂,对样品的作用也有很大的影响 [10]

本实验通过参考前人 [11-15]研究的细菌保护剂配方,最终选择可溶性淀粉、脱脂奶粉、海藻糖、麦芽糊精、谷氨酸钠、抗坏血酸钠、磷酸盐缓冲液作为菌种复方冷冻干燥保护剂。保护剂材料经辐射剂量为4 kGy的 60Co进行辐照灭菌。冷冻干燥机和配件在使用前经消毒灭菌处理。

将金黄色葡萄球菌添加到保护剂(0.1 mol/L磷酸盐缓冲液100 mL+可溶性淀粉20 g+海藻糖5 g+脱脂奶粉5 g+谷氨酸钠1.5 g+麦芽糊精7 g+抗坏血酸钠0.05 g)中混合均匀,用移液器分装至棕色西林瓶中,37 ℃条件下孵育7 h。将隔板与分装好的金黄色葡萄球菌标准物质在-70 ℃冰箱中预冻4 h [16]以上后,选择隔板最终温度20 ℃,0.370 mbar上机冷冻干燥36~48 h。充氮气后,将冻干好的金黄色葡萄球菌标准物质压盖密封。随机抽取8 瓶样品,对冷冻干燥前后的活菌数进行测定,得出存活率(存活率/%=冷冻干燥后活菌数/冷冻干燥前活菌数×100)。

1.3.3 标准物质的水分测定

经冻干后的金黄色葡萄球菌标准物质随机抽取8 瓶样品,采用称重法进行水分测定。

1.3.4 标准物质的均匀性检验

随机抽取15 瓶金黄色葡萄球菌标准物质,每瓶重复检测3 次,采用平板计数方法进行均匀性测定,并采用方差分析法对标准物质进行均匀性检验。

1.3.5 标准物质的稳定性考察

稳定性考察主要涉及标准物质在运输过程中的稳定性、客户端的贮存条件和使用有效期。稳定性考察温度设置为-20 ℃,分别在0、7、14、21、30、60、90、120、150、180 d随机选取3 瓶采用平板计数测定标准物质菌活菌数的变化情况,描绘出特性量值Y与时间X的关系,拟合成一条直线,通过公式(1)计算斜率b 1,通过公式(2)计算斜率b 1不确定度s(b 1)。

式(1)和(2)中:为时间平均值; 为稳定性检验时测定数据的平均值;b 0为拟合直线的截距。通过查表得置信水平0.95的t分布因子,同计算斜率b 1不确定度s(b 1)相乘后与斜率b 1的绝对值比较,若|b 1|<t 0.95(n-2)×s(b 1)则表明斜率不显著,标准物质稳定性良好。

1.3.6 标准物质特性量值的定值

随机抽取9 瓶标准物质,平均分成3 组,分别由3 个人独立完成平板计数。每瓶标准物质用2 mL无菌生理盐水充分溶解冻干标准物质,将每瓶溶解后的标准物质取1 mL,沿管壁缓慢注入盛有9 mL无菌磷酸盐缓冲液的无菌试管中,换用1 支无菌吸管反复吹打使其混合均匀,制备成1∶10的样品匀液,依次按照1∶10比例系列稀释。选择3 个适宜稀释度的样品匀液,每个稀释度分别吸取样品匀液以0.3、0.3、0.4 mL的接种量分别加入3 块Baird-Parker平板,然后用无菌L棒涂布整个平板,注意不要触及平板边缘 [17]。涂布后,将平板平放在培养箱,37 ℃培养1 h后,倒置于培养箱,37 ℃培养45~48 h。选择典型的金黄色葡萄球菌菌落的平板进行计数 [5]。每瓶标准物质重复3 次,计算平板计数平均值作为标准物质定值结果。

2 结果与分析

2.1 标准物质候选物菌种的鉴定和冻干存活率

随机挑取活化后接种到Baird-Parker培养基的10 个菌落,结果表明标准物质候选物菌种均为金黄色葡萄球菌的,其纯度为100%。金黄色葡萄球菌标准物质冻干后测其活含菌量,结果如表1所示。

表 1 金黄色葡萄球菌冻干存活率结果
Table 1 Freeze-drying survival results of Staphylococcus aurreeuuss

冻干前活菌数/(CFU/mL)冻干后活菌数/(CFU/mL)存活率/% 8.16×10 44.22×10 451.74

从表1可以看出,复合保护剂对金黄色葡萄球菌冻干前后的保护率为51.74%。

2.2 标准物质的水分

采用称重法对冷冻干燥后的金黄色葡萄球菌标准物质进行水分测定,测定结果表明金黄色葡萄球菌标准物质的水分含量平均值为1.40%,含水量低于3%。

2.3 标准物质的均匀性检验

采用F检验 [18]对金黄色葡萄球菌标准物质进行均匀性检验。以每瓶3 个重复,共获得45 个数据。从表2可以看出,组内均匀性的F检验均落在95%置信区间内,证明标准物质在组内不存在显著性差异。由样品的不均匀性所引起的误差与测定误差相比,可以忽略不计,表明样品均匀性良好。

表 2 金黄色葡萄球菌标准物质均匀性实验数据
Table 2 Homogeneity of the reference material of Staphylococcus aureus eus

标准物质序号活菌数/(CFU/mL)重复1重复2重复3 1 17 33314 66714 500 2 16 00014 00014 500 3 15 33316 66713 750 4 16 33316 33312 000 5 14 33315 33316 000 6 12 33313 66714 500 7 13 66714 33312 000 8 12 00016 00013 500 9 10 33314 00015 000 1011 66714 00012 667 1113 66714 33313 333 1211 66714 00013 000 1313 66714 66713 333 1411 66714 00013 000 1513 66714 66713 333平均值13 972 F值1.42 F 临界值F 0.05(14,30)=2.04结果F=1.42<F 0.05(14,30)=2.04

2.4 标准物质的稳定性考察

将标准物质保存在4 ℃,每次任取3 瓶,按1.3.6节中的定值方法测定活菌数。根据标准物质活菌数随时间的变化确定标准物质的稳定性,结果见图1。

图 1 金黄色葡萄球菌活菌数随时间的变化
Fig.1 Change in the number of viable Staphylococcus aureus during storage

由图1可知,金黄色葡萄球菌标准物质在前21 d内不稳定,从0 d的42 222 CFU/mL下降到16 666 CFU/mL,从第21天后稳定在13 000 CFU/mL左右。将第30~180天的活菌数进行拟合直线,通过计算发现|b 1|<t 0.95(n-2)×s(b 1),表明斜率是不显著的,金黄色葡萄球菌标准物质从30~180 d稳定性良好。金黄色葡萄球菌在冻干过程中较大多数的菌受到机械损伤和化学损伤在短时间内出现死亡,从而导致在稳定性实验初期会出现活菌数的明显下降过程。而没有受到损伤或损伤较小的菌则能够长期保存下来,并在半年的时间内保持稳定,因此冻干后的金黄色葡萄球菌会出现稳定性曲线先抑后平稳的现象 [19-20]

2.5 标准物质的定值及不确定度评定

2.5.1 标准物质特性量值的确认

按1.3.6节中的定值方法计算平板计数平均值作为标准物质定值结果(表3),金黄色葡萄球菌定值结果平均值为13 259 CFU/mL,相对标准偏差为6.12%。

表 3 金黄色葡萄球菌标准物质定值结果
Table 3 Certified values of the reference material of Staphylococcus aurreeuuss

标准物质序号活菌数/(CFU/mL)重复1重复2重复3平均值1 14 00014 66712 66713 778 2 12 66713 33314 66712 333 3 12 00013 33311 66713 556 4 15 00013 00012 66713 556 5 14 33315 33314 66714 778 6 12 33313 66712 66712 889 7 13 66714 33312 66713 556 8 12 00012 66713 33312 667 9 10 33314 00012 33312 222平均值13 259相对标准偏差6.12%

2.5.2 定值结果的不确定度评定

金黄色葡萄球菌定值结果的总不确定度由3 部分组成。第1部分是通过测量数据的标准偏差、测量次数及所要求的置信水平按统计学方法计算出A类不确定度u A。第2部分是通过对测量影响因素的分析,以非统计分析的方法评定出其大小的B类不确定度u B,它的主要来源包括:吸管带来的不确定度、溶液稀释带来的不确定度等。第3部分是标准物质不均匀性带来的不确定度u bb和标准物质的不稳定性所带来的不确定度u S。将这几部分不确定度合成就构成标准值的合成不确定度u,扩展不确定度U =ku(k=2,置信概率95%)(表4)。金黄色葡萄球菌标准物质的标准值为(13 259±868)CFU/mL。

表 4 金黄色葡萄球菌标准物质定值及不确定度评定结果
Table 4 Certified values and uncertainty evaluation of the reference material of l of Staphylococcus aureus reus CFU/mL

标准物质标准值标准不确定度uU u Au Bu bbu S金黄色葡萄球菌13 2592702422395434868

3 讨 论

随着新国家标准GB 29921—2013 [21]即将实施,针对金黄色葡萄球菌的准确测量,越来越受到有关专家和学者的关注。在食品安全领域,国际、国内针对微生物标准物质的研制才刚刚起步,目前国际上欧洲标准局只研制了用于活菌平板计数的定量微生物标准物质有蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、大肠杆菌(Escherichia coli),国内已经获得国家标准物质批号的只有食品微生物冻干样品菌落总数标准物质(GBW(E)100044)和鱼粉菌落总数标准物质(GBW(E)100045),新近研制的标准物质也只有鸡肉中单核细胞增生李斯特氏菌标准物质和乳粉中阪崎肠杆菌标准物质。因此,微生物活菌定量标准物质极其匮乏,有关金黄色葡萄球菌活菌计数的定量标准物质的研究还是空白。

本实验研制的金黄色葡萄球菌标准物质具有较好的稳定性,多次测试结果无显著差异。由于在冷冻过程中,温度降低和水分蒸发(冰晶体的形成)对菌种活性会造成很大的伤害,为了提高菌种在冷冻干燥过程中的存活率,向菌液中加入保护剂是一种非常有效的方法。通过单因素试验测试,某些单一保护剂的保护率低于10%,因此选择复合保护剂来进行金黄色葡萄球菌标准物质的制备。此外,在研制过程中发现,微生物保护剂在冻干前的孵育尤为重要,保护剂只有与菌体充分融合且均匀分布在细菌细胞壁两侧,才能够在冻干过程中增强菌体对高渗透压和干燥条件下的忍耐力。在鸡肉中单核细胞增生李斯特氏菌标准物质研制 [7]中,复合保护剂的保护率要比单一保护剂保护率提高1 倍;而在乳粉中阪崎肠杆菌标准物质研制 [22]中,冻干前后菌种保护率约为54.7%。恰当的复合冻干保护剂可以使悬浮的微生物冷冻时形成完全或几乎完全玻璃化态,减少物料在冻干及保存过程中的损害,复合保护剂对金黄色葡萄球菌冻干前后的保护率为51.74%,此与鸡肉中单核细胞增生李斯特氏菌标准物质 [7]和乳粉中阪崎肠杆菌标准物质 [22]文献中保护剂的保护率基本一致。

金黄色葡萄球菌在冻干过程中,由于大多数菌受到机械和化学损伤在短时间内出现死亡,极易导致在稳定性实验初期出现活菌数明显下降的过程。在冻结过程中,细菌细胞壁内外的水分固化,所有的流动体都会以固态、晶态或玻璃态存在 [23]。冰晶生长产生的机械力量会引起细菌损伤,一般冰晶越大,细胞壁越易破裂,造成细菌死亡;复水时冰晶会发生重结晶,再次损害细胞壁。为了减少机械损伤,保护剂的添加尤为必要。化学保护剂容易与细菌内外的水分子结合发生水合作用,使溶液黏性增加,弱化了水的结晶过程,达到保护目的。但是水的冻结使细菌细胞壁内的液体逐渐浓缩,从而使电解质的浓度显著增加,细菌内外渗透压的存在导致细菌脱水,细菌内的蛋白质对高浓度的电解质极为敏感,蛋白质发生变性,进而丧失其功能,引起细菌的死亡 [24-25]。因此,冻干粉中的金黄色葡萄球菌在这个冻干过程中不可避免地因为损伤而死亡,其活菌数量在经过3 周的衰减后,那些没有受到损伤或损伤较小的菌则能够长期保存下来,并在半年的时间内保持稳定。因此冻干后的金黄色葡萄球菌会出现稳定性曲线先抑后平稳的现象 [19-20],这与鸡肉中单核细胞增生李斯特氏菌标准物质 [7]和乳粉中阪崎肠杆菌标准物质 [21]中的报道是基本一致的。

该标准物质在金黄色葡萄球菌检测中起着测量标准的作用,有利于食品中金黄色葡萄球菌检测结果的准确和量值统一,更有利于保证食品质量与安全,所做的金黄色葡萄球菌制备研究工作将对食品致病菌检测用基体标准物质的制备以及刚刚开始的微生物计量工作具有一定的参考价值,该标准物质可用于实验室质量控制及室间比对,保证我国食品安全质量检测数据的可靠、可比与国际互认 [26]

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Preparation of Staphylococcus aureus Reference Material

XUE Lei 1,2, SUI Zhiwei 1,*, ZHANG Ling 1, WANG Jing 1, FU Boqiang 1, LIU Yingying 1, HAO Lin 2
(1. National Institute of Metrology, Beijing 100029, China;2. College of Food Science and Engineering, Shanxi Agricultural University, Taigu 030800, China)

Abstract:A reference material of Staphylococcus aureus was prepared by freeze-drying Staphylococcus aureus cells in the presence of a composite cryoprotectant. The efficacy of the cryoprotectant was verified by comparing the numbers of viable bacterial cells before and after the freeze-drying, and the homogeneity and stability of the standard substance were studied. The results showed that the composite protective agent could protect 51.74% of the viable bacterial cells. The homogeneity and stability after six months of storage of the reference material of Staphylococcus aureus were good. The reference material can be used for quality control in food testing laboratories and evaluation of food test results.

Key words:Staphylococcus aureus; freeze-drying; protectant; reference material

中图分类号:TS207.4

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2015)08-0044-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201508008

收稿日期:2014-06-11

基金项目:国家质检总局食品安全专项(ASPAQ1304);“十二五”国家科技支撑计划项目(2013BAK12B05)

作者简介:薛蕾(1989—),女,硕士研究生,研究方向为食品科学生物技术。E-mail:ysqwxl@163.com

*通信作者:隋志伟(1980—),男,副研究员,博士,研究方向为微生物测量方法研究与标准物质研制。E-mail:suizhw@nim.ac.cn