响应面法优化菊芋渣酶解制备抗氧化肽工艺

范三红,胡雅喃,何 亚

(山西大学生命科学学院,山西 太原 030006)

摘 要:以菊芋渣蛋白为原料,在单因素试验基础上,采用Plackett-Burman设计选出最显著的因素,即底物质量浓度、酶解时间、pH值,再用响应面分析法对其进行考察,以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除率为评价指标,优化菊芋渣抗氧化肽酶解工艺。结果表明,最佳酶解条件为加酶量8 000 U/g、酶解温度50 ℃、pH 5.0、酶解时间3.5 h、底物质量浓度0.16 g/mL,在此条件下DPPH自由基清除率实测平均值达88.10%,与预测值88.08%相近。

关键词:响应面;菊芋渣蛋白;酶解工艺;抗氧化肽

自由基是机体氧化反应中产生的有害化合物,具有强氧化性,对机体的组织和细胞可造成损害。抗氧化剂作为一类重要的生物活性物质,可清除人体代谢过程中产生的自由基,具有延缓机体衰老的功效。但研究表明,一些人工的合成抗氧化剂,如2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚和丁基羟基茴香醚等,能够抑制人体的呼吸酶活性,使用过量甚至可致畸、致癌,因此研究低毒、高效的天然抗氧化剂变成了重点。

目前,制备抗氧化肽的原料来源广泛,如大豆蛋白 [1]、乳蛋白 [2]、菜籽 [3]、大米 [4]等植物蛋白原料中均有抗氧化作用的活性肽。我国有大量的蛋白资源,但利用率都不高,常常作为废料丢弃,因此如何有效利用蛋白原料,具有重要的现实意义。

目前对于菊芋的研究主要集中在菊粉的开发应用 [5-6],而对脱糖后菊芋渣中蛋白质 [7]的研究较少,特别是菊芋渣多肽的开发仍处于空白阶段,故有很大的研究空间。菊芋渣是菊芋生产菊粉后的主要副产物,其中粗蛋白含量达9.6%,且氨基酸的利用率相对较高,属于一种优质植物蛋白质。1 t菊芋块茎加工后可得650 kg菊芋渣 [7],产量巨大,直接废弃造成资源的浪费。本实验旨在利用酸性蛋白酶酶解菊芋渣蛋白制备抗氧化肽,同时应用响应面法 [8-9]优化酶解工艺,为菊芋渣蛋白的充分利用及菊芋渣多肽深入研究提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菊芋渣分离蛋白(总蛋白含量85.19%) 实验室自制;酸性蛋白酶(50 000 U/g) 北京奥博星生物技术有限责任公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH) 美国Sigma公司;其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

TG16A-WS型高速离心机 湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司;BS 124 S型电子天平 上海良平仪器仪表有限公司;SP-2000UV型紫外-可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司;HH4型数显恒温水浴锅 杭州仪表电机有限公司;868型酸度计 美国奥利龙公司。

1.3 方法

1.3.1 DPPH自由基清除率的测定

采用比色法 [10-11],各溶液混匀,避光反应30 min,517 nm波长处测定吸光度,公式如下:

式中:A 1为2 mL 0.2 mmol/L DPPH无水乙醇溶液+2 mL蛋白酶解液(稀释100 倍)吸光度;A 2为2 mL无水乙醇+2 mL蛋白酶解液(稀释100倍)吸光度;A 3为2 mL 0.2 mmol/L DPPH无水乙醇溶液+2 mL无水乙醇吸光度。

1.3.2 菊芋渣蛋白酶解工艺流程

一定质量浓度的蛋白液→沸水浴10 min→冷却后调pH值,按一定比例加入蛋白酶,酶解一定时间→沸水浴灭酶10 min→5 000 r/min离心15 min→上清液待测

1.3.3 单因素试验

pH值的确定:取0.08 g/mL菊芋渣蛋白液,在pH值分别为2、3、4、5、6条件下,加酶量4 000 U/g、酶解温度50℃、酶解时间2 h,测定DPPH自由基清除率;酶解时间的确定:取0.08 g/mL菊芋渣蛋白液,酶解时间分别为2、4、6、8、10 h,加酶量4 000 U/g、酶解温度50 ℃、pH 4,测定DPPH自由基清除率;酶解温度的确定:取0.08 g/mL菊芋渣蛋白液,酶解温度分别为40、45、50、55、60 ℃,加酶量4 000 U/g、pH 4、酶解时间2 h,测定DPPH自由基清除率;底物质量浓度的确定:取质量浓度分别为0.08、0.1、0.12、0.14、0.16 g/mL的菊芋渣蛋白液,加酶量4 000 U/g、酶解温度50 ℃、酶解时间2 h、pH 4,测定DPPH自由基清除率;加酶量的确定:取0.08 g/mL菊芋渣蛋白液、pH 4、酶解温度50 ℃、酶解时间2 h,加酶量分别为2 000、4 000、6 000、8 000、10 000 U/g,测定DPPH自由基清除率。

1.3.4 响应面试验设计

在单因素的基础上,以DPPH自由基清除率为指标,确定Plackett-Burman筛选试验 [12-13]的因素和水平,结合Box-Behnken响应面分析法进行三因素三水平试验 [14-15],优化酶解工艺。

1.4 数据分析

数据分析采用软件Minitab 15.0。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 pH值对DPPH自由基清除率的影响

图 1 pH值对DPPH自由基清除率的影响
Fig.1 Effect of initial hydrolysis pH on the DPPH radical scavenging activity of protein hydrolysates

pH值的改变会影响酶与底物的结合情况,影响酶活性部位有关基团的解离状态,每一个催化反应都有最适pH值 [16]。由图1可看出,最适pH值是4.0。pH值小于4.0时,反应速率随pH值升高而增大,酶解液DPPH自由基清除率增大,pH值大于4.0时,酶的结构发生变化,酶活力变差,反应速率下降。因此初步选定pH值为4.0。

2.1.2 酶解时间对DPPH自由基清除率的影响

图 2 酶解时间对DPPH自由基清除率的影响
Fig.2 Effect of hydrolysis time on the DPPH radical scavenging activity of protein hydrolysates

由图2可看出,酶解的最佳时间为4 h,2~4 h范围内DPPH自由基清除率明显上升,之后缓慢下降。可能是随着酶解时间的延长,底物质量浓度逐渐减少,酶和底物的结合位点随之减少,反应越来越慢,达到一定的动态平衡,同时酶的活力也随之降低 [17],随着时间的延长,一些酶解出来的多肽被进一步分解,从而导致氨基酸结构序列发生变化,而多肽的抗氧化性与此有很大的关系 [18-19]。综合考虑,酶解时间为4 h。

2.1.3 酶解温度对DPPH自由基清除率的影响

每一种酶都有其最适温度,在这一温度范围内,随着酶解温度的升高,酶活性增大,温度过高或过低,可能会使酶结构发生变化,酶活性就越小,甚至有可能会失活。由图3可知,酶解温度在50 ℃时效果最好,其余温度条件下清除率均较小。

图 3 酶解温度对DPPH自由基清除率的影响
Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on the DPPH radical scavenging activity of protein hydrolysates

2.1.4 底物质量浓度对DPPH自由基清除率的影响

图 4 底物质量浓度对DPPH自由基清除率的影响
Fig.4 Effect of substrate concentration on the DPPH radical scavenging activity of protein hydrolysates

底物质量浓度的大小影响底物与酶结合位点的多少,底物质量浓度小时,底物与酶结合位点较少,反应速率慢,随着质量浓度增加,反应速率加快,当底物质量浓度达到一定程度时,溶液过于黏稠,影响了底物与酶的结合 [20],且到达一定量时,酶与底物全部结合,虽然质量浓度增加,但没有多余的酶与之结合 [21],DPPH自由基清除能力不再变化。由图4可知,底物质量浓度在0.12、0.14、0.16 g/mL时相差不大,从原料方面考虑,选择最佳质量浓度为0.12 g/mL。

2.1.5 加酶量对DPPH自由基清除率的影响

图 5 加酶量对DPPH自由基清除率的影响
Fig.5 Effect of enzyme dosage on the DPPH radical scavenging activity of protein hydrolysates

底物质量浓度一定时,加酶量对反应速率有极大的影响。加酶量少,则与底物相结合的酶分子少,反应速率慢。随着加酶量的增加,与之相结合的酶分子增加,反应速率加快。当加酶量过多,酶分子过饱和,反应速率不再变化。由图5可知,加酶量为8 000 U/g时DPPH自由基清除率最大,其他条件下则较低,综合考虑,加酶量为8 000 U/g。

2.2 酸性蛋白酶酶解菊芋渣蛋白的响应面分析

2.2.1 响应面试验设计及结果

表 1 响应面试验设计与结果
Table 1 Response surface experimental design and results

试验号A底物质量浓度/(g/mL)时间/hC pHDPPH自由基清除率/%试验值预测值B酶解10(0.12)-1(2)-1(3)79.5979.504 2 2 0 -11(5)84.5685.592 6 3 00(4)0(4)85.6685.592 6 4 0 0 0 86.5685.592 6 5 1(6)-177.2277.277 6 6 0 0 0 84.5685.592 6 0 7-1(0.08)-1080.7280.384 0 81(0.16)-1082.7183.196 4 9 1 0 1 88.3387.904 9 10-11076.6976.201 8 1111080.6981.029 2 12-10179.8680.257 0 1301180.2980.373 7 1410-180.4380.032 6 15-10-179.6280.040 9

表 2 回归方程方差分析Table 2 Analysis of variances for the fitted regression model
Table 2 Analysis of variances for the fitted regression model

来源自由度平方和均方F值P值模型9159.92317.769 226.020.001线性382.05127.350 440.050.001平方361.30420.434 629.930.001交互作用316.5685.522 88.090.023残差误差53.4140.682 8失拟31.4070.469 00.470.735纯误差22.0071.003 6合计14163.337R 2=97.46%R 2 Adj= 92.90%

表 3 回归系数显著性分析
Table 3 Significant test for each regression coefficient of the
Table 3 Significant test for each regression coefficient of the fitted regression model del

来源系数系数标准误T值P值常量85.592 60.477 1179.4060.000 A底物质量浓度1.909 90.292 26.5370.001 B酶解时间-1.587 40.292 2-5.4330.003 C pH2.022 10.292 26.9210.001 A 2-1.872 00.430 0-4.3530.007 B 2-3.517 80.430 0-8.1800.000 C 2-1.661 80.430 0-3.8640.012 AB0.503 70.413 21.2190.277 AC1.914 00.413 24.6330.006 BC-0.474 00.413 2-1.1470.303

综合单因素和Plackett-Burman试验,应用Box-Behnken试验设计原理 [22],采用不同底物质量浓度、pH值、酶解时间进行15 组试验。使用Minitab 15.0软件对表1进行分析,得到DPPH自由基清除率为响应值的多元二次回归方程:Y=85.592 6+1.909 9A-1.587 4B+2.022 1C-1.872 0A 2-3.517 8B 2-1.661 8C 2+0.503 7AB+1.914 0AC-0.474 0BC。

从表2可看出,该模型回归显著(P<0.01),失拟项不显著(P=0.735>0.05),说明模型较准确。二次项和交互项对该模型具有显著性(P<0.05),说明这两项对响应值的影响很大。复相关系数R 2=97.46%,说明试验值和拟合值高度相关,校正决定系数R 2 Adj=92.90%,说明该模型能解释92.90%响应值的变化,拟合度大于90%,说明方程差异显著。

从表3回归系数显著性分析可得出,C 2响应值影响显著(P<0.05),A、B、C、A 2、B 2、AC这几个因素对响应值的影响极显著(P<0.01),表明在酶解的过程中,底物质量浓度、pH值、酶解时间对清除率有显著的影响,可见,A、B、C、A 2、B 2、C 2、AC对响应值的影响是非线性的。

2.2.2 各因素间交互作用

图 6 底物质量浓度与酶解时间交互作用对DPPH自由基清除率的影响
Fig.6 Response surface plot showing the effect of substrate concentration and hydrolysis time on the DPPH radical scavenging activity of protein hydrolysates

图 7 底物质量浓度与pH值交互作用对DPPH自由基清除率的影响
Fig.7 Response surface plot showing the effect of initial pH and substrate concentration on the DPPH radical scavenging activity of protein hydrolysates

图 8 pH值与酶解时间交互作用对DPPH自由基清除率的影响
Fig.8 Response surface plot showing the effect of initial pH and hydrolysis time on the DPPH radical scavenging activity of protein hydrolysates

由图6~8响应面图和等高线图可以看出该模型存在最大值。利用Minitab 15.0的响应优化器可得出最佳酶解条件是底物质量浓度0.16 g/mL、酶解时间3.57 h、pH 5.0,在此条件下,DPPH自由基清除率的预测值为88.08%。为了验证实验的可靠性,将各参数进行修正为底物质量浓度0.16 g/mL、酶解时间3.5 h、pH 5.0。对上述条件进行验证实验,得到平均清除率为88.10%(重复3 次),与预测值相近,说明所得参数可靠,该模型能较好地预测菊芋渣抗氧化肽酶解工艺,具有实际意义。

3 结 论

本研究在单因素试验的基础上,将Plackett-Burman筛选试验与响应面法结合,确定出显著因素,避免了其他因素可能造成的资源浪费,并对其进行优化得到最佳酶解条件为底物质量浓度0.16 g/mL、加酶量8 000 U/g、酶解温度50 ℃、pH 5.0、酶解时间3.5 h,在此条件下DPPH自由基清除率为88.10%。实验证明,该模型合理。通过实验可以看出,资源利用率较高,菊芋渣有着很大的研究空间。

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Optimization of Enzymatic Hydrolysis of Jerusalem artichoke Residue for Preparing Antioxidant Peptides by Response Surface Methodology

FAN Sanhong, HU Ya’nan, HE Ya
(College of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030006, China)

Abstract:Antioxidant peptides were prepared by enzymatic hydrolysis of Jerusalem artichoke tuber residue protein with an acid protease. Substrate concentration, hydrolysis time and pH were identified by the combined use of single factor method and Plackett-Burman design as the factors with the most significant influence on 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activity of protein hydrolysate. The optimal hydrolysis conditions for enzyme dosage, temperature, pH, time and substrate concentration were determined by response surface methodology to be 8 000 U/g, 50 ℃, pH 5.0, 3.5 h and 0.16 g/mL, respectively. Under these conditions, the predicted DPPH radical-scavenging rate was 88.08%, agreeing with the average experimental value (88.10%).

Key words:response surface methodology; Jerusalem artichoke residue protein; enzymatic hydrolysis; antioxidant peptides

中图分类号:TS209

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2015)08-0049-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201508009

收稿日期:2014-09-11

基金项目:山西省自然科学基金项目(2012011031-4);山西省高等学校高新技术产业化项目(20111003)

作者简介:范三红(1963—),男,副教授,硕士,研究方向为食品科学。E-mail:fsh729@sxu.edu.cn