莲子磨皮粉中蛋白质的提取、组成及性质

李向红,刘永乐*,俞 健,王发祥,王建辉,刘美宏

(长沙理工大学食品与生物工程系,湖南省水生资源食品加工工程技术研究中心,湖南 长沙 410114)

摘 要:采用碱溶酸沉法提取莲子磨皮粉中的蛋白质,并以莲子中提取的蛋白质作对照,采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、体积排阻色谱法测定了两种蛋白质的组成差异,采用差示扫描量热仪及傅里叶红外光谱对两种蛋白质的部分性质和结构进行了表征。结果显示:碱溶酸沉法提取莲子磨皮粉和莲子蛋白质的提取率分别为72.24%和78.93%;凝胶电泳图谱显示,莲子磨皮粉蛋白质亚基分子质量分布在15~70 kD,而莲子蛋白质亚基分子质量分布在10~45 kD;体积排阻色谱图谱也显示莲子磨皮粉蛋白质中包含有更多的不同分子质量的蛋白质组分;差示扫描量热仪分析显示,莲子磨皮粉蛋白质的变性峰值温度为118.28 ℃,莲子蛋白质为108.05 ℃,且莲子磨皮粉蛋白质变性焓值更高,因而蛋白质空间结构有序性较高;傅里叶红外光谱分析也揭示莲子磨皮粉蛋白质相比于莲子蛋白质构象更为有序。

关键词:莲子;莲子磨皮粉蛋白质;分子性质

莲是我国特产,全国种植面积达2.1344×10 5hm 2;2012年我国莲子总产量达120万 t以上,占国际贸易量的90%以上 [1]。莲的籽、壳、皮、芯、蓬等均具有较高的食或药用价值 [2-4],然而,我国莲子加工产品85%以上为初加工品,主要利用部分为莲子肉,如通芯白莲、开边湘莲、圆粒湘莲、钻心湘莲等。工业上通常采用机械磨皮的方式去掉莲子的种皮得到白净细滑的莲子肉出售,加工中会产生约占原料质量15%的磨皮粉,其中包含了丰富的蛋白质、淀粉及其他功能物质。目前这些副产物多被用作低值的肥料和动物饲料,或者当作垃圾被丢弃,造成了严重的资源浪费和环境污染 [5-6]。目前,有些研究仅是针对莲子中蛋白质提取工艺的优化 [2,5],或者对莲子磨皮粉中功能性成分进行综合提取 [6],鲜少有研究对莲子磨皮粉中蛋白质进行提取并对其性质进行表征。而对莲子磨皮粉中蛋白质进行回收利用可能显著提高莲子加工的产值。本研究对莲子磨皮粉中的蛋白质进行了提取,并对其组分、性质和结构进行了一定研究,可为莲子加工副产物的高值化利用提供理论依据。

1 1 材料与方法

1.1 材料与试剂

莲子磨皮粉由湖南粒粒珍湘莲有限公司提供。

十二烷基磺酸钠、标准牛血清蛋白、丙烯酰胺、N,N’-亚甲基双丙烯酰胺、β-巯基乙醇 国药集团化学试剂有限公司;溴酚蓝 汕头市西陇化工厂有限公司。实验用水为蒸馏水,所有化学试剂均为市售分析纯级。

1.2 仪器与设备

FW100型高速万能粉碎机 天津泰斯特仪器有限公司;DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 巩义市予华仪器有限责任公司;DELTA 320 pH计 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;SK-1型快速混匀器 金坛市医疗仪器厂;LG10-24A高速离心机 北京金立离心机有限公司;FD-1真空冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司;UV2600紫外-可见分光光度计 上海舜宇恒平科学仪器有限公司;迷你型垂直电泳槽、YY-5型稳压稳流电泳仪 北京市六一仪器厂;LC-20A高效液相系统 日本岛津公司;Q2000型差示扫描量热仪(differential scanning calorimetry,DSC) 美国TA仪器公司;6700型傅里叶变换红外光谱仪 美国Nicolet公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白质的提取

在前期研究 [7]的基础上,采用碱溶酸沉法提取莲子磨皮粉及莲子中的蛋白质。称取一定量过200 目筛的干燥粉末,以1∶20的料液比加入提取液(蒸馏水),调节pH值达11.0,40 ℃条件下搅拌提取2 h后以 8 000 r/min转速离心15 min,取上清液,弃去残渣,调节上清液pH值为4.5,再以8 000 r/min离心15 min后得到沉淀,用蒸馏水将沉淀洗涤几次,将溶液回调pH值到7.0,进行冷冻干燥,得到干燥蛋白粉,4 ℃贮藏备用。

1.3.2 常规成分检测

蛋白质含量的测定:采用GB 5009.5—2010《食品中蛋白质的测定》 [8]凯氏定氮法,氮换算为蛋白质的系数为6.25;水分含量的测定:采用GB 5009.3—2010《食品中水分的测定》 [9]直接干燥法;灰分含量的测定:采用GB 5009.4—2010《食品中灰分的测定》 [10]干法灰化法。

1.3.3 莲子及其磨皮粉蛋白质提取率的测定

将干燥后的莲子及其磨皮粉蛋白质分别称质量,结合凯氏定氮法测得这些提取物和所投原料中蛋白质的质量,然后按如下公式计算其提取率:

1.3.4 蛋白质等电点的测定

准确称取蛋白粉5 g,溶于50 mL水中,并用0.5 mol/L HCl(和/或NaOH)溶液调节pH值分别为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0,放置1 h,再以4 000 r/min转速离心20 min后收集上清液。在波长280 nm处进行紫外检测,测得最小吸光度处的pH值即为蛋白质等电点。

1.3.5 蛋白质亚基分子质量的测定

采用Laemmli垂直板十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfonate-polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)法 [11]测定蛋白质亚基分子质量,分离胶质量分数为12% ,浓缩胶质量分数为5%;以分子质量64×10 4~14×10 4kD的标准蛋白为标准。1.3.6 蛋白质组分的分子质量测定

将蛋白质用磷酸盐缓冲液(2% SDS,pH 7.0)溶解配制成5 mg/mL的分散液,8 000 r/min离心15 min后取上清液用0.45 μm微孔滤膜过滤,使用Shodex KW-804蛋白柱分析蛋白样品的分子质量分布。流动相为200 mmol/L的磷酸盐缓冲溶液(2% SDS,pH 7.0),洗脱速率1 mL/min,在280 nm波长处检测洗脱液,柱温为20 ℃。

1.3.7 蛋白质分子热力学性质分析 [12]

采用DSC对蛋白质样品进行热力学性质分析:氮气流速20 mL/min、扫描温度范围30~120 ℃、升温速率10 ℃/min。另取一个空样品盘,作为标准物,试样及标准的称量误差控制在0.2 mg范围内。

将待测物和标准物放入仪器中,盖上盖子和玻璃罩,开始加热,并用计算机绘制图形。

1.3.8 蛋白质分子结构的傅里叶红外光谱(Fourier transform infrared spectrometer,FT-IR)分析 [13]

采用红外吸收光谱测定蛋白质分子结构方法如下:取一定量的干燥蛋白样品与干燥的溴化钾在玛瑙研钵中充分研磨后混匀压片,采用纯溴化钾片为本底,4 000~400 cm -1扫描样品晶片,测定得到红外吸收光谱。

2 结果与分析

2.1 莲子及其磨皮粉蛋白质提取物的常规成分含量

表 1 常规成分含量检测结果(干基)
Table 1 Proximate composition of protein samples (dry base) %

样品水分蛋白质灰分莲子磨皮粉蛋白质莲子蛋白质7.37 7.67 83.23 87.51 4.11 3.83

从表1可见,采用碱溶酸沉法所提的莲子蛋白质提取物的蛋白含量略高,灰分含量较低。

2.2 莲子及其磨皮粉蛋白质的提取率

采用碱溶酸沉法测定的莲子蛋白质提取率为78.93%,莲子磨皮粉蛋白质提取率为72.24%。提取率均不高,所以此次实验所设置的提取条件还没有达到最佳,提取工艺有待进一步优化。

2.3 莲子及其磨皮粉蛋白质等电点

蛋白质是一种两性物质,等电点时分子间的静电斥力理论上为零,实际上蛋白质间静电排斥作用最低,从而促使蛋白质聚集、沉淀,导致蛋白质溶液的吸光度降为最小。蛋白质的等电点常作为提取操作pH值的选取参考。

图 1 莲子及其磨皮粉蛋白质等电点测定结果
Fig.1 Isoelectric pointsof LSP and LSPP

由图1可以看出,莲子蛋白质溶液经不同pH值沉淀后,在pH 4.5处的吸光度最小,即得到的沉淀最多,上清液最澄清,而在其他pH值处的吸光度均比pH 4.5处的大,因此,可以判定莲子蛋白质的等电点pI为4.5。同理,莲子磨皮粉蛋白质等电点pI为5.0。与之前进行酸沉时选取的等电点相比,莲子蛋白质提取选取pH 4.5较为恰当,而莲子磨皮粉蛋白质选取pH 4.5作为酸沉处理的pH值,导致蛋白质沉淀不完全,这可部分说明2.2节中所述结果中莲子磨皮粉蛋白质提取率低于莲子蛋白质提取率的原因。因此,在以后莲子磨皮粉蛋白质的提取中,酸法沉淀时取pH 5.0较佳。

2.4 莲子及其磨皮粉蛋白质的分子质量

2.4.1 莲子及其磨皮粉蛋白质的SDS-PAGE分析

图 2 莲子蛋白质及莲子磨皮粉蛋白质的SDS-PAGE图谱
Fig.2 SDS-PAGE profiles of LSPP and LSP

由莲子及其磨皮粉蛋白质SDS-PAGE图谱(图2)结合Gel-Pro Analyzer软件分析图谱结果可知,莲子蛋白质主要显示出5 条亚基,分子质量分布在10~45 kD范围内,其中分子质量24.7 kD泳带较粗,分子质量在39.6 kD的蛋白质亚基次之,可推知这两种分子质量的亚基是莲子蛋白质主要亚基;莲子磨皮粉蛋白质主要显示出7 条亚基,分子质量分布在15~70 kD范围内,分子质量在23 kD为该蛋白主要亚基。莲子及其磨皮粉蛋白质的主要亚基都集中在25 kD附近。

2.4.2 莲子及其磨皮粉蛋白质的体积排阻色谱分析

图 3 莲子蛋白质(a)及莲子磨皮粉蛋白质(b)体积排阻色谱
Fig.3 SEC-HPLC chromatograms of LSP and LSPP

采用体积排阻色谱进一步测定了两种蛋白的分子质量分布,见图3。通过对照Shodex KW-804蛋白柱的标准曲线,可发现莲子蛋白质主要为分子质量158 kD的部分(保留时间为9.7min左右);莲子磨皮粉蛋白质中存在有约6%的分子质量大于10 6D部分(保留时间为6.0 min左右),而主要包含的是出峰时间为9.6 min左右(对应分子质量162 kD)的一个宽峰,说明莲子磨皮粉中包含有更多不同分子质量的蛋白质部分,一定程度上与电泳结果相呼应。

2.5 莲子及其磨皮粉蛋白质的热力学性质通过对两种蛋白的DSC图谱分析得到莲子及其磨皮粉蛋白质的变性温度及变性焓值,结果见表2。莲子蛋白质开始变性温度和峰值温度分别为64.79 ℃和108.05 ℃,莲子磨皮粉蛋白质两个温度为64.79 ℃和118.28 ℃。两种蛋白在100~120℃范围内的焓变比较明显,说明此温度条件下变性的蛋白为样品的主要蛋白组分。莲子蛋白质DSC图谱中出现的峰值温度108.05 ℃比莲子磨皮粉蛋白质的峰值温度118.28 ℃低,莲子磨皮粉蛋白质的焓变

表 2 莲子蛋白质及莲子磨皮粉蛋白质的开始变性温度(T 0)、峰值温度(T m)及变性焓值(△ H)
Table 2 Onset (T 0) and maximum (T m) temperatures for endothermic transitions and net heat energy (enthalpy, △H ) required for these transitions for LSP and LSPP

注:T 0、T m和ΔH来源于DSC扫描图谱(原图没有显示),报告数据是6次扫描数据的平均值。

样品T 0/℃T m/℃ΔH/(J/g)莲子蛋白质 64.79±2.29108.05±5.153.35±1.27莲子磨皮粉蛋白质64.79±5.64118.28±2.676.49±1.68

6.49 J/g比莲子蛋白质的焓变值3.35 J/g高,表明莲子磨皮粉蛋白质空间结构有序性较高于莲子蛋白质空间结构。已有有关研究 [14-15]说明,ΔH值的增加反映了蛋白质在升温过程中的综合吸热效应,例如氢键的断裂等,其值的高低与蛋白质内部空间结构的有序性有关。

2.6 莲子及其磨皮粉蛋白质的FT-IR分析

图 4 莲子蛋白质(a)及莲子磨皮粉蛋白质(b)的FT-IR图
Fig.4 Infrared spectra of LSP and LSPP

蛋白质空间构象是影响其功能性质的关键因素 [16]。因此,对其二级结构等空间构象进行详细研究能较好地了解蛋白质的结构与功能关系。FT-IR是最好的研究蛋白质构象工具之一 [17-18],如图4所示,通过对比可知,二者的吸收峰位置基本一致,但有一定的细微区别。二者在1 300~1 000 cm -1范围内均有两个吸收峰,其中前者和后者分别在1 125.31 cm -1和1 091.03 cm -1处有一个宽的吸收带,这是二者出现相同吸收带的波数差别相对较大之处,该宽吸收带是由于C—O伸缩振动引起;此外,二者均在1 400 cm -1处有一个尖锐的吸收峰,它是由于C—H键弯曲振动引起 [19];谱带范围在1 700~1 600 cm -1的酰胺Ⅰ区用于分析两种蛋白质的二级结构 [20-21],采用高斯曲线拟合酰胺Ⅰ区峰形,采用Origin 7.5根据积分面积计算出各种二级结构的相对含量,结果表明两种蛋白质中无规卷曲(1 641~1 649 cm -1)的相对含量差别显著,莲子蛋白质中无规卷曲的相对含量为52.78%,明显高于莲子磨皮粉蛋白质的无规卷曲的相对含量(34.22%),说明莲子蛋白质的构象更加柔韧及具有更高的延伸性,而莲子磨皮粉蛋白质的构象更为有序,与DSC的结果相呼应。

3 结3 论

本研究采用碱溶酸沉法提取了莲子及其磨皮粉中的蛋白质,并对两种蛋白质组分和部分性质进行了表征。结果表明,在现有提取条件下,莲子蛋白质提取率为78.93%,莲子磨皮粉蛋白质提取率为72.24%;莲子磨皮粉蛋白质等电点pI为5.0左右,莲子蛋白质等电点pI为4.5。SDS-PAGE结果显示莲子蛋白质亚基分布在10~45 kD,莲子磨皮粉蛋白质亚基分布在15~70 kD,体积排阻色谱结果也显示莲子磨皮粉蛋白质中包含有更多不同分子质量的蛋白质组分;DSC和FT-IR分析均揭示莲子磨皮粉蛋白质相比于莲子蛋白质构象更为有序。

参考文献:

[1] 中国市场情报中心. 2011—2015年莲子行业分析报告[R/OL]. (2010-11-25) [2014-05-28]. http://www.ccidreport.com/report/ content/12/201011/241790.html.

[2] 蔡联辉, 曾虹燕, 王亚举, 等. 莲子蛋白质的氨基酸组成及其营养评价[J]. 营养学报, 2010(5): 57-60.

[3] 周德龙, 高建华, 杨祎静, 等. 莲子壳营养成分分析及黄酮类抗氧化活性研究[J]. 安徽农业科学, 2011, 39(7): 3968-3970.

[4] 黄素英, 郑宝东. 莲子多酚的抗氧化活性[J]. 福建农林大学学报: 自然科学版, 2010, 39(1): 74-76.

[5] 徐虹, 王馨仪, 曹杨, 等. 莲子红皮蛋白微波辅助盐提工艺优化[J].食品科学, 2011, 32(4): 87-91.

[6] 李嫦. 莲皮粉的综合利用研究[D]. 长沙: 湖南农业大学, 2012: 6.

[7] 刘永乐, 王发祥, 俞健, 等. 响应曲面法优化莲子蛋白质的提取条件[J].长沙理工大学学报: 自然科学版, 2013, 9(4): 1-4.

[8] 卫生部. GB 5009.5—2010 食品中蛋白质的测定[S]. 北京: 中国标准出版社, 2010.

[9] 卫生部. GB 5009.3—2010 食品中水分的测定[S]. 北京: 中国标准出版社, 2010.

[10] 卫生部. GB 5009.4—2010 食品中灰分的测定[S]. 北京: 中国标准出版社, 2010.

[11] LAEMMLI U K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4[J]. Nature, 1970, 227: 680-685.

[12] LIU Yongle, LI Xianghong, CHEN Zhijun, et al. Characterization of structural and functional properties of fish protein hydrolysates from surimi processing by-products[J]. Food Chemistry, 2014, 151: 459-465.

[13] LIU Yongle, LI Xianghong, ZHOU Xiaolin, et al. Effects of glutaminase deamidation on the structure and solubility of rice glutelin[J]. LWT-Food Science and Technology, 2011, 44: 2205-2210.

[14] MURRAY E D, ARNTFIELD S D, ISMOND M A H. The influence of processing parameters on food protein functionality Ⅱ. Factors affecting thermal properties as analyzed by differential scanning calorimetry[J]. Canadian Institute of Food Science and Technology Journal, 1985, 18: 158-162.

[15] ARNTFIELD S D, MURRAY E D. The influence of processing parameters on food protein functionality Ⅰ. Differential scanning calorimetry as an indicator of protein denaturation[J]. Canadian Institute of Food Science and Technology Journal, 1981, 14: 289-294.

[16] SUBIRADE M, GUEGUEN J, PEZOLET M, et al. Molecular basis of film formation from a soybean protein: comparison between the conformation of glycinin in aqueous solution and in films[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 1998, 23: 241-249.

[17] FERRER E G, BOSCH A, YANTORNO O, et al. A spectroscopy approach for the study of the interactions of bioactive vanadium species with bovine serum albumin[J]. Bioorganic and Medicinal Chemistry, 2008, 16(7): 3878-3886.

[18] ZHAO Xiaoyan, CHEN Fusheng, XUE Wentong, et al. FTIR spectra studies on the secondary structures of 7S and 11S globulins from soybean proteins using AOT reverse micellar extraction[J]. Food Hydrocolloids, 2008, 22(4): 568-575.

[19] 宁永成. 有机化合物结构鉴定与有机波谱学[M]. 2版. 北京: 科学出版社, 2000: 322-340.

[20] KONG Jilie, YU Shaoning. Fourier transform infrared spectroscopic analysis of protein secondary structures[J]. Acta Biochimica et Biophysica Sinica, 2007, 39(8): 549-559.

[21] KRIMM S, BANDEKAR J. Vibrational spectroscopy and conformation of peptides, polypeptides, and proteins[J]. Advances in Protein Chemistry, 1986, 38: 181-364.

Extraction, Composition and Molecular Properties of Proteins from Lotus Seed Peel Powder

LI Xianghong, LIU Yongle*, YU Jian, WANG Faxiang, WANG Jianhui, LIU Meihong
(Hunan Provincial Engineering Technology Research Center of Aquatic Food Resources Processing, Department of Food and Biological Engineering, Changsha University of Science and Technology, Changsha 410114, China)

Abstract:In the present study, lotus seed peelpowder protein (LSPP) and lotus seed protein (LSP) were extracted by alkali solubilization and isoelectric precipitation. Sodium dodecyl sulfonate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and size-exclusion high performance liquid chromatography (SEC-HPLC) were used to examine the differences in the composition of the extracted proteins. Differential scanning calorimetry (DSC) and Fourier transform infrared spectrometer (FT-IR) were used to characterize some properties and structures of LSPP and LSP. The results showed that the extraction rates of proteins from lotus seed peel powder and lotus seed were 72.24% and 78.93%, respectively. SDS-PAGE analysis revealed that the molecular weights of LSPP subunits were distributed in the range from 15 to 70 kD, while those of LSP in the range from 10 to 45 kD. SEC-HPLC also revealed that LSPP was composed of a larger number of molecular fractions than LSP. DSC analysis showed that denaturation peak temperatures of LSPP and LSP were 118.28 ℃ and 108.05 ℃, respectively, and the former had a higher enthalpy of denaturation. These results combined with FT-IR analysis results showed that the conformation of LSPP was more regular.

Key words:lotus seed; peel powder protein; molecular property

中图分类号:TS209

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2015)08-0129-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201508023

收稿日期:2014-09-13

基金项目:“十二五”国家科技支撑计划项目(2012BAD31B08);国家自然科学基金青年科学基金项目(31101214;31201427);湖南省自然科学基金项目(13JJ4054;12JJ6028);湖南省教育厅优秀青年项目(14B009)

作者简介:李向红(1979—),女,副教授,博士,研究方向为农产品深加工与蛋白质工程。E-mail:xianghongli@hotmail.com

*通信作者:刘永乐(1962—),男,教授,博士,研究方向为食品生物技术与大宗农产品加工技术。E-mail:lyle19@163.com