图 1 甲壳素的化学结构式
Fig.1 Chemical structural formula of chitin
林智威，王艳花，卢珩俊，陈梅兰*
（浙江树人大学生物与环境工程学院，浙江 杭州 310015）
摘 要：建立离子色谱-电导法测定甲壳素发酵液中乙酸根含量，以确定甲壳素脱乙酰化过程中脱乙酰度。样品前处理为取发酵液放入无菌离心管中，以10 000 r/min离心15 min，取上清液过0.45 μm醋酸纤维滤膜后进样分析，将检测的乙酸值换算成脱乙酰度。结果表明，该方法达到很好的分离效果，在0.5～25.0 mg/L范围内呈现良好的线性关系，回收率为95.04%～102.25%，相对标准偏差不大于2.99%，与目前常用的酸碱滴定法和电位滴定法相比，具有简单、快捷、数据准确等特点，适用于生产企业对甲壳素脱乙酰化过程的实时监控及甲壳素脱乙酶的优化，可为工业化壳聚糖脱乙酰度的监测以及评价降解酶活性提供一定依据。
关键词：壳聚糖；甲壳素；脱乙酰度；乙酸；离子色谱法
甲壳素又称几丁质，是一种由N-乙酰-D-葡萄糖胺单体通过β-1,4-糖苷键连接而成的直链高分子化合物（图1），其广泛存在于虾、蟹等甲壳动物，以及部分植物、细菌和真菌等生物中，年平均产量接近100亿 t，是仅次于纤维素的第二大类天然高分子化合物。壳聚糖为甲壳素经脱乙酰化的产物，是由β-（1,4）-2-氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖单元和β-（1,4）-2-乙酰胺基-2-脱氧-β-D-葡萄糖单元组成的共聚物（图2），也是迄今发现的唯一天然碱性多糖，具有良好生物相溶性，在生物医学及制药等方面的应用极其广泛，例如在控制胆固醇、抑制细菌活性、预防和控制高血压、吸附和排泄重金属、提高免疫效果等方面具有较好的疗效 [1-2]。
图 1 甲壳素的化学结构式
Fig.1 Chemical structural formula of chitin
目前，国内外甲壳素脱乙酰的方法有化学降解法、物理降解法和脱乙酰酶降解法。其中脱乙酰酶降解法因其特异性和高的选择性、降解过程温和、耗能低等特点而优于其他两种降解方法 [3-5]，具有较大的发展空间。然而目前通过筛选得到的甲壳素脱乙酰酶活性较低，应用于工业化还需要进一步筛选和优化，生产企业还是以碱法降解为主。在脱乙酰酶的优化过程中，甲壳素脱乙酰度是脱乙酰酶活性选择的依据，也是壳聚糖产品质量的重要指标之一。直至目前，国内外没有统一的脱乙酰度的检测方法。国内企业主要采用酸碱滴定法 [6]或胶体滴定法 [7]。这两种方法操作简单、技术要求低，但是酸碱滴定终点判断误差较大，重复性不好 [8]，而胶体滴定法虽然比较稳定，重复性较好，但是误差也很大，有时测定的脱乙酰超过100%。许多学者对脱乙酰度的检测方法进行了研究，如电位滴定法 [9]、酶前处理电位滴定法 [10]、氢溴酸盐法 [11]、光折射率传感法 [12]、热分析法 [13]、元素分析法 [14]、一阶导数紫外光谱法 [15]、红外光谱 [16-18]、核磁共振法 [19-21]、X射线衍射法 [22]和圆二色谱法 [23]等。在这些方法中，电位滴定法的误差较大，氢溴酸盐法和苦味酸分光光度法实验耗时太长，一阶导数紫外光谱法由于乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖的最大吸收峰有重叠引起干扰，影响检测结果。元素分析基于碳氮比的不同，甲壳素中残余氮对检测结果影响很大。核磁共振法准确度虽高，但仪器价格昂贵使用成本高，不易推广。因此，建立一种操作简便、准确度高的甲壳素脱乙酰度的检测方法非常必要。本实验基于甲壳素不论碱法降解或是酶法降解后脱除的乙酰基最后均变成乙酸盐或乙酸的事实，通过测定乙酸根的含量，进而推算甲壳素的脱乙酰度，考虑到该方法简单准确，可监控甲壳素实际生产的脱乙酰度。
图 2 壳聚糖的化学结构式
Fig.2 Chemical structural formula of chitosan
1.1 试剂与仪器
甲壳素 浙江金壳生物化学有限公司；配制淋洗液用碳酸钠、碳酸氢钠为优级纯；发酵液 浙江树人大学活泼教师实验室；发酵使用的培养基由常量营养盐和两种微量元素溶液组成，其中常量营养盐含磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钠、氯化钙、氯化铵、蛋白胨等；微量元素溶液1由盐酸、氯化镁、氯化钴、氯化锌、硼酸、氯化铜、氯化镍和 钼酸钠组成，微量元素溶液2由乙二胺四乙酸二钠（disodium ethylenediaminetetraacetate dihydrate，EDTA-2Na）及氯化亚铁组成；培养基使用的试剂（均为分析纯） 杭州华东医药股份有限公司。实验用水为超纯水由Milli-Q纯水仪纯化（电阻率18.2 MΩ·cm）。
IC-2010离子色谱仪（带自动进样器、抑制方法是胶抑制、检测方法是电导检测） 日本Tosoh公司；高压蒸汽灭菌锅、SKY-2102C型温振荡培养箱、SW-CJ-2FD型净化工作台 苏州净化设备有限公司。
1.2 方法
1.2.1 发酵
根据前期培养基优化实验的结果，在超净台上将彻底灭菌的足量培养基分别分装至已灭菌的三角瓶中，用接种环接入足量已培养好的菌株，再向其中加入适量甲壳素，16 层纱布封口，在恒温振荡培养箱中振荡培养。
1.2.2 样品前处理
取发酵液2 mL放入无菌离心管中，10 000 r/min离心15 min，去除样品中的菌体，取上清液过0.45 μm醋酸纤维滤膜，再取0.5 mL定容至25 mL容量瓶，摇匀后放入样品瓶进样分析。将检测的乙酸换算成脱乙酰度。
1.2.3 色谱条件
离子交换柱：保护柱TOSOH TSKguardcolumn SuperIC-AZ（4.6 mm×1 cm），分析柱TOSOH TSKgel SuperIC-AZ （4.6 mm×15 cm，4 μm）；柱温：40 ℃；进样量：30 μL；淋洗液：1.9 mmol/L NaHCO 3＋3.2 mmol/L Na 2CO 3；流速：0.5 mL/min；胶抑制电导检测。
1.3 脱乙酰度的计算 [24]
式中：Q为样品质量/g；n为发酵过程中脱去乙酰基的糖残基的物质的量，以检测出发酵液中乙酸的物质的量代替；
N为样品总的糖残基的物质的量；161为脱乙酰度为100%时壳聚糖残基的平均相对分子质量；203为脱乙酰度为0时壳聚糖残基的平均相对分子质量。
2.1 淋洗液的选择
通过多次实验，淋洗液为1.9 mmol/L NaHCO 3＋3.2 mmol/L Na 2CO 3，流速：0.5 mL/min时，发酵液中阴离子能完全分离，具体见图3。
在1.2.3节的色谱条件下，乙酸的线性范围由标准溶液0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、25.0 mg/L制得。重复性由0.5 mg/L的标准溶液重复进样6 次求得，相对标准偏差为0.18%。检出限（R SN=3）为0.48μg/L，如表1所示。
图 3 发酵液中7 种阴离子标准色谱图
Fig.3 Standard chromatogram of seven anions in the fermented fluid
表 1 线性范围、重复性及检出限
Table 1 Linear range, reproducibility and limits of detection
注：Y为峰面积；X为质量浓度/（mg/L）。
分析物线性范围/相对标准偏差/%（n=6）乙酸0.5～25.0Y=3.087 6X＋0.873 11.000 00.480.18（mg/L） 线性 方程 相关系数（R 2）检出限/（μg/L）
为了进一步考察基体对结果的影响，在最佳实验条件下，对一个发酵48 h的甲壳素发酵液样品进行分析，测得乙酸质量浓度为5.13 mg/L，并按样品测定值的20%、50%和80%即1.0、2.5、4.0 mg/L进行加标测定，测定结果见表2，回收率为95. 04%～102.25%。发酵液样品按照1∶10稀释的谱图见图4。
Table 2 Recoveries of spiked samples (n=3）
表 2 加标回收率实验结果（n = 3)
加标量/（mg/L）回收率/%相对标准偏差/% 123 1.0100.9895.5199.882.90 2.595.0498.81100.932.99 4.097.1998.17102.252.68
图 4 样品稀释色谱图
Fig.4 Chromatogram of 10-fold diluted sample
2.2 EDTA的影响
考虑到发酵液中使用了EDTA，而EDTA由4 个乙酸基组成，在发酵过程中可能生成乙酸会对测定结果产生影响，因此在其他培养条件相同的条件下，不添加甲壳素进行发酵，对发酵液进行处理后进样检测，发现在乙酸保留时间位置不出峰。可见，乙酸对方法不产生影响。
2.3 乳酸的影响
考虑到甲壳素在酶的作用下可能生成乳酸或生成的乙酸在酶的作用下转换成乳酸，进而对测定结果产生影响，因为乳酸和乙酸两峰有一些重叠。实验检测了100 个发酵液样品，发现有2 个样品检测到很小的乳酸峰。因此可认为甲壳素发酵基本不会生成乳酸，也不会对测定结果产生影响。
2.4 脱乙酰度的计算
脱乙酰度为甲壳素转换成壳聚糖的转换率，或是 其脱乙酰基率。目前酸碱滴定法计算公式见式（2）或（3） [25]：
式（2）、（3）中：C 1和C 2分别为盐酸和氢氧化钠的浓度；V 1为加入盐酸的体积；V 2为滴定耗用的氢氧化钠的体积；m为被测溶液壳聚糖产品的质量；M为壳聚糖的平均相对分子质量（161）。
由公式（2）和（3）可知，只有纯品（100%）甲壳素脱去乙酰基，用上式公式得到的壳聚糖含量可以看作是脱乙 酰度的百分率，严格来讲是壳聚糖的质量百分率。当不纯的甲壳素即在总链节上既有壳聚糖分子链，也有甲壳素分子链时上述公式计算都会出现误差，而在公式（1）中，发酵液中生成乙酸的量是真实甲壳素脱乙酰基后产生的，因此测定发酵液中乙酸的含量计算脱乙酰度是正确的。生产企业在用甲壳素作为原料生产壳聚糖时，可直接测定发酵液中的乙酸按公式（1）计算脱乙酰度作为控制生产工艺质量标准，脱乙酰度越大，甲壳素转换为壳聚糖的得率越高。厂方对最终壳聚糖质量指标的确定一般按公式（2）、（3）进行计算。因此在实际生产中，脱乙酰度指标，可用作生产过程中工艺内控标准，壳聚糖含量可作为壳聚糖质量指标。
为了进一步衡量该方法的可行性，与传统滴定法的比较。取按1.2.1节方法发酵后发酵液进行乙酸含量的检测，最按公式（1）计算得到的脱乙酰度为44.62%，以得到的壳寡糖产品，用滴定法按公式（2）计算，得出的脱乙酰度为48.01%，两者有一定的差异，这可能是甲壳素本身含有壳聚糖分子链有关。
通过离子色谱测定经脱乙酰酶作用后甲壳素中乙酸根含量的测定，以便评估甲壳素的脱乙酰度以及脱乙酰酶的活性。该方法达到了很好的分离效果，回收率为95.04%～102.25%，在0.5～25.0 mg/L范围内呈现良好的线性效果，相对标准偏差不大于2.99%，该方法简单准确，即使样品的发酵液中含Mo
，整个分析时间只需要30 min即可完成，可以用于甲壳素工业化中脱乙酰度的实时监测。
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Determination of Degree of Deacetylation of Chitosan by Ion Chromatographic Quantitation of Acetic Acid
LIN Zhiwei, WANG Yanhua, LU Hengjun, CHEN Meilan*
(College of Biological and Environmental Engineering, Zhejiang Shuren University, Hangzhou 310015, China)
Abstract：Chitosan is the product of chitin deacetylation. Therefore, the degree of deacetylation can be obtained by determining the content of acetic acid. In this paper, a method was developed to assess the degree of deacetylation of chitosan by quantitating acetic acid concentration using ion chromatography. The fermented liquid was centrifuged in sterile centrifuge tubes at 10 000 r/min for 15 min to remove the bacterial cells. Then the supernatant fluid was filtered through a 0.45 μm cellulose acetate membrane and injected into ion chromatography system. Good chromatographic separation was achieved. This method had good linearity in the range of 0.5–25.0 mg/L and its recoveries ranged from 95.04% to 102.25%, with relative standard deviation (RSD) lower than 2.99%. It is simple, quick and more accurate as compared with the traditional titration method and can be used to monitor deacetylation of chitin and optimize deacetylase activity.
Key words：chitosan； chitin； degree of deacetylation； acetic acid； ion chromatography
中图分类号：TS201.2
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2015）08-0171-04
doi：10.7506/spkx1002-6630-201508031
收稿日期：2014-04-21
基金项目：浙江省自然科学重点基金项目（Z14B070002）；国家国际科技合作专项（CB10-06）
作者简介：林智威（1995—），男，本科生，研究方向为食品分离与分析。E-mail：mxt644143284@163.com
*通信作者：陈梅兰（1964—），女，教授，本科，研究方向为色谱分离分析。E-mail：rain-lake@163.com