图 1 检测过程原理图
Fig.1 Principle schematic of E. coli O157∶H7 detection
杨 阳，李荣卓，毛禄刚，刘 霞*
（湖南农业大学食品科学技术学院，食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128）
摘 要：基于双通道表面等离子共振（surface plasmon resonance，SPR）传感器，结合不同粒径的金纳米粒子（Au nanoparticle，AuNPs）标记多克隆抗体（polyclonal antibody，PAb）作为第二抗体，采用氨基偶联的方法将PAb固定在传感器表面作为第一抗体，采用三明治夹心法进行了检测大肠杆菌O157∶H7（E. coli O157∶H7）的研究。考察3 种粒径的AuNPs作为标记物，增强SPR响应信号检测E. coli O157∶H7的能力。结果表明，增强效果最佳的AuNPs粒径为17.79 nm，其可检测到的E. coli O157∶H7的最低浓度为10 CFU/mL。
关键词：金纳米粒子；E. coli O157∶H7；表面等离子共振传感器；标记；不同粒径
随着食品产业飞速的发展，食品安全问题越来越得到消费者的关注。据统计，在各种食物中毒事件中，以细菌引起的食物中毒最多。其中大肠杆菌O15 7∶H7（E. coli O157∶H7）是最常见的细菌致病菌 [1-2]。目前，检测E. coli O157∶H7常用的方法有聚合酶链式反应（poly merase chain reaction，PCR） [3]、酶联免疫（enzyme-linked immune sorbent assay，ELISA）法 [4]、生物传感器法 [5]等。其中，免疫生物传感器由于其特异性强、快速简便的优点，已广泛应用于E. coli O157∶H7的检测。特别是表面等离子共振（surface plasmon resonance，SPR）传感器 [6]具有无需标记，能实时监测反应动态过程，操作简单、灵敏度高，已被广泛应用于各个研究领域 [7-9]。国内外已有关于SPR生物传感器检测E. coli O157∶H7的报道，Si Chengyan等 [10]将抗体固定在传感器表面，基于SPR直接法检测E. coli O157∶H7，检测限为10 5CFU/mL。应用纳米材料可大幅度提高SPR传感器的检测灵敏度 [11]，尤其是金纳米粒子（Au nanoparticles，AuNPs），由于具有微弱的带电配体的结合层，具有特殊的稳定性，可以与生物分子发生非共价键的静电吸附 [12]，且生物分子活性基本不发生改变，标记用量少等优点而被广泛应用于生物检测。AuNPs标记抗原或抗体的三明治法检测E. coli O157∶H7已有报道，刘霞等 [13]应用AuNPs标记抗体的方法检测了补体C4，与直接法检测相比，灵敏度提高了20 倍。Eum等 [14]基于AuNPs的增强响应信号作用，应用三明治夹心法，将AuNPs-抗体作为二抗，原抗体为一抗检测E. coli O157∶H7，结果表明在标记AuNPs的前提下响应信号比没有标记的高3.8 倍。
本实验分别将不同粒径的AuNPs标记E. coli O157∶H7 PAb作为第二抗体，以固定在SPR传感器芯片表面的PAb作为第一抗体，应用三明治夹心法 [15]对E. coli O157∶H7进行检测，比较了3 种不同粒径的AuNPs增强SPR响应信号的能力，筛选出最佳尺寸的AuNPs，并应用筛选出的AuNPs进行实际样品的加标回收率实验。此方法简单快速，为SPR传感器在实际样品中的检验提供技术参考。
1.1 试剂与仪器
无水乙醇、营养肉汤（nutrient broth，NB）、柠檬酸三钠、四氯金酸（HAuCl 4·H 2O）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 国药集团化学试剂有限公司；3-巯基丙酸（3-mercapto propionic acid，MPA）、N-羟基琥珀酰亚胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）、乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺（1-ethyl-3-(3-dimethylami-nopropyl) carbodiimide hydrochloride，EDC）美国Sigma-Aldrichg公司；E. coli O157∶H7由湖南省食品药品检验研究院提供（出血性大肠埃希氏菌二代菌株，编号为CICC21530，中国工业菌种保藏中心）；羊抗O157∶H7 PAb 美国International Lab公司；实验所用试剂均为分析纯。
HJ-1型恒温磁力搅拌器 江苏医疗仪器厂；双通道2000 SPR传感器和芯片 美国Biosensing Instrument公司；UV-2450型紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；JSM-6380LV型透射电子显微镜 日本电子株式会社；磷酸盐缓冲液（150 mmol/L NaCl＋20 mmol/L Na 2HPO 4·12H 2O，pH 7.4）；实验用水为去离子水；实验所用玻璃器皿、磷酸盐缓冲液、去离子水及枪头均经高压灭菌。
1.2 方法
1.2.1 AuNPs合成及表征
采用柠檬酸三钠还原法制备AuNPs [16]，具体步骤如下：分别取0.5 mL质量分数为1%氯金酸溶液于三角瓶中，加入49.5 mL去离子水，在磁力搅拌器200 r/min搅拌并加热至沸腾，沸腾后分别快速加入新配制的1、1.5、2 mL质量分数为1%的柠檬酸三钠溶液，继续加热搅拌10 min。溶液颜色由灰色变成黑色，最后变成透亮的红色后停止加热，再搅拌10 min。室温冷却后分装到离心管中并分别采用透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）和紫外-可见分光光度计（ultravioletvisible spectrophotometer，UV-Vis）进行表征。
1.2.2 AuNPs-PAb复合物的制备及表征
应用目测法测定PAb最适标记量，将PAb逐级稀释后，各取等体积分别加入到一系列装有1 mL AuNPs的离心管中，离心5 min后，在上述各管内再分别加入0.1 mL质量分数为10%的NaCl溶液调节pH值至7.4，混匀静置2 h以上观察结果。若加入PAb不足以稳定AuNPs的离心管，即呈现由红变蓝的聚沉现象，而加入PAb达到或超过最低稳定量的离心管则AuNPs的红颜色不变。其中含PAb最低的离心管即含稳定1 mL AuNPs的必需蛋白量 [17]。根据用已标记的AuNPs的总量计算出所需要的待标记PAb的总量（实际实验中增加20%的量），然后在电磁搅拌器的搅拌下，将PAb溶液逐滴加入AuNPs溶液中（pH 7.4），1 mg的PAb大约5 min加完；在磁性搅拌器的搅拌下，加入pH 7.4的BSA作为封闭剂，并使其最终质量分数为1%。得到的混合液用2 000 r/min离心20 min，去除沉淀，即除去部分大颗粒的AuNPs。所得上清液用10 000 r/min离心60 min后小心除去上清液，即除去未结合的PAb。所得沉淀（AuNPs-PAb复合物）用磷酸盐稀释并用TEM进行表征。
1.2.3 PAb在传感器表面的固定
室温条件下，采用滴加的方法，将浓度为10 mmol/L的MPA乙醇溶液滴加在裸露的芯片表面，室温孵育过夜，次日芯片用乙醇以及二次水反复冲洗，再用氮气吹干，使MPA在芯片上形成稳定的单分子膜，然后将芯片组装在SPR传感器上。通入新配制的EDC/NHS（0.4 mol/L∶0.1 mol/L）活化MPA中的羧基，流速为40 μL/min；再通入的质量浓度为111.2 µg/mL的PAb（磷酸盐缓冲液配制）溶液，流速为5 μL/min，将其固定在传感器芯片表面，最后通入1% BSA封闭芯片表面的非特异性吸附位点。
1.2.4 SPR检测
通入一定浓度的E. coli O157∶H7标准菌液，流速为10 μL/min，使其与芯片表面的PAb充分反应，然后再分别通入3 种粒径的AuNPs-PAb复合物进行检测，检测过程原理图如图1所示。每次反应完毕后以20 μL/min的流速通入10 mmol/L的NaOH溶液，将传感器表面AuNPs-PAb与E. coli O157∶H7的结合物冲掉至基线稳定后，然后通入其他浓度的E. coli O157∶H7，重复上述步骤，每个浓度的E. coli O157∶H7至少重复检测3 次。
图 1 检测过程原理图
Fig.1 Principle schematic of E. coli O157∶H7 detection
1.2.5 实际样品的制备及加标回收率实验
购买自湖南农业大学红旗市场的凉菜，烘箱烘48 h，用灭菌后的研钵研碎，称取2.5 g加入22.5 mL无菌水混合均匀，过滤后4 ℃冰箱备用。
稀释样液加入E. coli O157∶H7标准菌液，加标后E. coli O157∶H7的最终浓度为10 6CFU/mL。调节流速为10 µL/min，通入实际样品加标溶液，进行3次重复检测，计算回收率。每次检测后采用10 mmo l/L的NaOH溶液使传感器表面再生。
2.1 AuNPs的表征
应用柠檬酸钠还原法成功制备了3 种不同粒径的AuNPs，图2A分别为3 种粒径AuNPs的TEM图，AuNPs粒子形状较统一，分散也较均匀，并且随着还原剂柠檬酸三钠量的不同，粒子粒径逐渐增大，粒子数量减少。通过使用粒径分布计算软件分析了3 种粒子的粒径，可知此次实验制备的AuNPs平均粒径分别为17.79、28.22 nm和34.05 nm（图2B）。图3为AuNPs的UV-Vis光谱，3种粒径的AuNPs在520 nm左右均出现了其紫外特征吸收峰，而且紫外吸收峰随着颗粒尺寸的增大而出现了红移，与文献[18]报道相一致。
图 2 AuNPs TEM图（A）和粒径分布图（B）
Fig.2 TEM images (A) and size distribution histograms (B) of AuNPs
图 3 AuNPs的UV-Vis光谱
Fig.3 UV-visible absorption spectra of AuNPs
2.2 AuNPs-PAb的表征
图 4 AuNPs标记前后以及抗体的UV-Vis光谱
Fig.4 UV-visible absorption spectra of PAb, AuNPs and AuNPs-PAb
由图4中曲线c可看出，PAb没有特征峰，而图4中曲线b可以明显看出，3 种粒径的AuNPs分别在波长520 nm左右处都出现了特征吸收峰，但PAb被AuNPs标记后（图4中曲线a），AuNPs-PAb复合物在525 nm左右出现了吸收峰，AuNPs-PAb复合物的特征吸收峰与AuNPs的特征吸收峰相比，出现了红移现象，这是因为AuNPs-PAb复合物形成之后，粒子粒径变大所致，与文献[18]报道相一致。另外，也可看出AuNPs-PAb复合物的吸光度明显下降，PAb被AuNPs成功标记。
2.3 SPR检测结果
图 5 3种粒径的AuNPs增强三明治夹心法检测E. coli O157∶H7的动力学曲线
Fig.5 SPR dynamics curves of AuNPs of three different sizes enhanced sandwich assay for E. coli O157∶H7 detection
PAb在SPR芯片表面自组装成稳定的抗体分子膜后，分别向流通池中通入不同菌液浓度的E. coli O157∶H7，然后通入AuNPs-PAb复合物进行检测，整个实验的SPR动力学曲线如图5所示（以菌液浓度为10 8CFU/mL E. coli O157∶H7为例）。从图5可明显看出，通入PAb后立刻引起了SPR的响应信号，1 200 s基本达到平衡，SPR响应信号的变化（Δθ）值为82 mDeg，说明PAb已经被成功的固定在传感器表面。当传感器表面被PBS冲洗后，注入BSA也引起了SPR响应信号的变化，说明传感器芯片表面的空位点已被BSA封闭。此时，注入E. coli O157∶H7引起的SPR响应信号的变化并不是很明显，当E. coli O157∶H7完全与一抗结合后，再注入AuNPs-PAb的复合物时，引起了明显的SPR响应信号的变化（注入AuNPs-PAb前的基线与注入AuNPs-PAb后响应信号经过高峰平台期后下降并稳定的基线的差值），可明显看出粒径为17.79 nm的AuNPs标记二抗产生的SPR响应信号改变值最大，其次分别为粒径34.05 nm和28.22 nm的AuNPs，这主要是由于AuNPs的比表面积增大了PAb的承载量，使复合物的折射率明显增大及AuNPs的表面等离子体子（surface plasmons，SP）与金膜本身的SP发生了耦合的原因。待反应完成之后通入10 mmol/L NaOH使传感器表面再生。
图 6 3种粒径检测不同浓度E. coli O157∶H7的工作曲线
Fig.6 Working curves for detecting different concentrations of E. coli O157∶H7 based on different sizes of AuNPs
如图6所示，随着E. coli O157∶H7浓度的增加，SPR响应的变化值也随之增加，17.79 nm AuNPs增加SPR响应信号的变化值最为明显，其次为34.05 nm，最后为28.22 nm，与图5所示结果一致。当E. coli O157∶H7的浓度为10 8CFU/mL，粒径分别为17.79、28.22 nm和34.05 nm的AuNPs标记二抗所引起的SPR响应信号的变化值分别为17.415、7.2373 mDeg和9.9403 mDeg，相对标准偏差分别为8.019%、7.723%和9.306%。这表明，检测相同浓度的E. coli O157∶H7，17.79 nm AuNPs增强SPR的效果几乎是28.22 nm和34.05 nm的AuNPs的2 倍。而且E. coli O157∶H7的浓度越大，17.79 nm AuNPs增强SPR的效果越强，而28.22 nm和34.05 nm的增强效果趋于平缓，当E. coli O157∶H7的浓度为10 15CFU/mL时，两者产生的SPR信号基本差不多。
图 7 17.79 nm AuNPs检测不同浓度E. coli O157∶H7的线性关系曲线
Fig.7 Linear relationship curve of SPR assay for detection of E. coli O157∶H7 at different concentrations using 17.79 nm AuNPs
一般来说，在一定的粒径范围内，随着AuNPs粒径的增加，SPR响应信号也随之增强。Zeng Shuwen等 [19]系统地研究了AuNPs粒径对于SPR响应信号的影响规律，研究表明当AuNPs的粒径小于40 nm时，SPR响应信号随着粒径的增大而增加；当AuNPs粒径大于40 nm时，SPR响应信号随着粒径的增大反而减小。而本实验获得的AuNPs标记二抗增强SPR响应信号的最佳粒径为17.79 nm，其次是34.05 nm，最后为28.22 nm。这或许是以下两个原因导致的综合效应，一是由于粒径较大的AuNPs被PAb包被后，导致AuNPs-PAb复合物粒径更大，当AuNPs-PAb复合物与芯片表面的E. coli O157∶H7结合时，导致空间位阻的效应更明显；二是由于E. coli O157∶H7本身也比较大（0.5～1.5 µm），当粒径较大的AuNPs-PAb复合物与其结合后，使得传感器表面的介质膜厚度比较大，导致SPR灵敏度下降 [20]。图7是增强效果最佳粒径的AuNPs（17.79 nm）检测E. coli O157∶H7的线性关系曲线，其最低可检测到的浓度为10 CFU/mL，线性范围为10～10 10CFU/mL，相关系数为0.991 4，线性回归方程为Y=2.037 17X＋1.652 22。
2.4 实际样品加标回收率
应用17.79 nm的AuNPs采用同样的方法进行了实际样品的加标回收率实验。为了保证检测的准确性，样品经长时间的烘干处理，确认其无微生物存活后，进行加标实验。实际样品中的E. coli O157∶H7加标量是10 6CFU/mL，SPR响应信号的变化值是18.284 mDeg，同浓度的E. coli O157∶H7标准品的SPR响应信号的变化值为16.603 mDeg，其加标回收率为110.12%，相对标准偏差为1.37%，说明该方法的准确度高、重复性好。
本实验采用柠檬酸三钠还原法合成了3 种不同粒径（17.79、28.22、34.05 nm）的AuNPs，并将不同粒径的AuNPs标记E. coli O157∶H7的PAb制备的AuNPs-PAb复合物作为二抗，利用氨基偶联的方法将PAb固定在传感器表明作为一抗，采用三明治夹心法，应用双通道SPR传感器（一个通道作为参比通道）对E. coli O157∶H7进行了高灵敏的检测，考察3 种粒径的增强能力，筛选出增强效应最佳的粒径为17.79 nm。此方法可明显增强SPR的检测灵敏度，且操作时间短、试剂用量少、灵敏度高。
参考文献：
[1] AHN K C, KLEIN E, TARR I P. Isolation of patients acutely infected with Escherichia coli O157:H7: low-tech, highly effective prevention of hemolytic uremic syndrome[J]. Clinical Infectious Diseases, 2008, 46(8): 1197-1199.
[2] PHILLIPS C A. The epidemiology, detection and control of Escherichia coli O157[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 1999, 79(11): 1367-1381.
[3] 巢强国, 杨学明, 葛宇, 等. PCR法检测食品中大肠杆菌O157:H7[J].食品科学, 2010, 31(8): 212-215.
[4] SUNWOO H H, WANG W W, SIM J S. Detection of Escherichia coli O157:H7 using chicken immunoglobulin Y[J]. Immunology Letters, 2006, 106(2): 191-193.
[5] XU Lijian, DU Jingjing, DENG Yan, et al. Electrochemical detection of E. coli O157:H7 using porous pseudo-carbon paste electrode modified with carboxylic multi-walled carbon nanotubes, glutaraldehyde and 3-aminopropyltriethoxysilane[J]. Journal of Biomedical Nanotechnology, 2012, 8(6): 1006-1011.
[6] FERNÁNDEZ F, SÁNCHEZ-BAEZA F, MARCO M P. Nanogold probe enhanced surface plasmon resonance immunosensor for improved detection of antibiotic residues[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2012, 34(1): 151-158.
[7] LANG T, HIRSCH T, FENZL C, et al. Surface plasmon resonance sensor for dissolved and gaseous carbon dioxide[J]. Analytical Chemistry, 2012, 84(21): 9085-9088.
[8] LIU Ying, CHENG Quan. Detection of membrane-binding proteins by surface plasmon resonance with an all-aqueous amplification scheme[J]. Analytical Chemistry, 2012, 84(7): 3179-3186.
[9] NAGATSUKA T, UZAWA H, SATO K. Localized surface plasmon resonance detection of biological toxins using cell surface oligosaccharides on glyco chips[J]. ACS Applied Materials and Interfaces, 2013, 5(10): 4173-4180.
[10] SI Chengyan, YE Zunzhong, WANG Yixian, et al. Rapid detection of Escherichia coli O157:H7 using surface plasmon resonance (SPR) biosensor[J]. Spectroscopy and Spectral Analysis, 2011, 31(10): 2598-2601.
[11] TAYLOR A D, LADD J, YU Qiuming, et al. Quantitative and simultaneous detection of four food borne bacterial pathogens with a multi-channel SPR sensor[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2006, 22(5): 752-758.
[12] LEUNG P T, POLLARD K D, MALAN G P, et al. Modelling of particleenhanced sensitivity of the surface-plasmon-resonance biosensor[J]. Sensors and Actuators B: Chemical, 1994, 22(3): 175-180.
[13] LIU Xia, SUN Ying, SONG Daqian, et al. Sensitivity-enhancement of wavelength-modulation surface plasmon resonance biosensor for human complement factor 4[J]. Analytical Biochemistry, 2004, 333(1): 99-104.
[14] EUM N S, YEOM S H, KWON D H, et al. Enhancement of sensitivity using gold nanorods-antibody conjugator for detection of E. coli O157: H7[J]. Sensors and Actuators B: Chemical, 2010, 143(7): 784-788.
[15] SAFENKOVA I V, ZHERDEV A V, DZANTIEV B B. Correlation between the composition of multivalent antibody conjugates with colloidal gold nanoparticles and their affinity[J]. Journal of Immunological Methods, 2010, 357(1/2): 17-25.
[16] FRENS G. Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions[J]. Nature, 1973, 241: 20-22.
[17] 王凯. 使用SPR生物传感器快速检测微生物的实验研究[D]. 长春:吉林大学, 2003.
[18] 孙秀兰, 张银志, 邵景东, 等. 黄曲霉毒素B 1抗体和纳米金颗粒的相互作用机理[J]. 高等学校化学学报, 2007, 28(8): 1449-1453.
[19] ZENG Shuwen, YU Xia, LAW W C, et al. Size dependence of AuNP-enhanced surface plasmon resonance based on differential phase measurement[J]. Sensors and Actuators B: Chemical, 2013, 176(1): 1128-1133.
[20] 赵晓君. 表面等离子体子共振化学和生物传感器的研究[D]. 长春:吉林大学, 1999.
Detection of E. coli O157:H7 Based on Au Nanoparticles of Different Sizes Labeled Second Antibody Enhanced Surface Plasmon Resonance
YANG Yang, LI Rongzhuo, MAO Lugang, LIU Xia*
(Hunan Province Key Laboratory of Food Science and Biotechnology, College of Fo od Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)
Abstract：Escherichia coli O157:H7 (E. coli O157:H7) was detected by a sandwich method with Au nanoparticles (AuNPs) of different sizes labeled E. col i O157:H7 polyclonal antibody (PAb) as the second antibody and PAb immobilized on the sensor surface as the first anti body using a dual-channel surface plasmon resonance (SPR) sensor. The abil ities of second antibodies labeled with AuNPs of three different sizes to enhance SPR signal were compared. As a result, the optimal AuNPs size was found to be 17.79 nm and the minimum detectable concentration of E. coli O157:H7 was 10 CFU/mL.
Key words：AuNPs； E. coli O157:H7； surface plasmon resonance (SPR)； labeling； different particle sizes
中图分类号：S951.42
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2015）08-0201-05
doi：10.7506/spkx1002-6630-201508037
收稿日期：2014-07-18
基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目（31201375）；公益性行业（农业）科研专项（201303084）
作者简介：杨阳（1990—），女，硕士研究生，研究方向为食品安全与控制。E-mail：769968476@qq.com
*通信作者：刘霞（1976—），女，副教授，博士，研究方向为食品分析、食品营养与安全。E-mail：liuxiaspr@aliyun.com