郭芳芳 1，冯 锋 1,2,*，白云峰 2，陈泽忠 2，刘荔贞 2，李 蓉 2，周 高 2
（1.山西大学化学化工学院，山西 太原 030006；2.山西大同大学化学与环境工程学院，山西 大同 037009）
摘 要：采用高效毛细管电泳-紫外检测法，对雪糕中常见的亮蓝、日落黄、苋菜红、新胭脂红、柠檬黄5 种色素进行检测。电泳条件：缓冲溶液10 mmol/L Na 2B 4O 7-5 mmol/L NaH 2PO 4（浓度为0.7 mmol/L的β-环糊精），pH 11.5，检测波长214 nm，外加电压25 kV。在该条件下，各色素线性范围在10～1 000 μg/mL之间，r在0.997 5～0.999 9之间，检出限在1.2～8.6 μg/mL之间（R SN=3），平均回收率为93.8%～108.5%，相对标准偏差不大于4.19%，结果表明该方法简便、准确可靠，可用于雪糕中合成色素的同时检测。
关键词：高效毛细管电泳；色素；雪糕
食品色泽作为感官质量的重要指标之一，在给人带来美感的同时，也能激发人的购买欲，在食品中添加色素，可以弥补食品因加工、运输等原因造成色泽变差的缺陷。在不同食用色素中，合成色素因价格便宜、稳定性好、色调多等优点，成为商家的首选 [1-3]。但是研究发现，过量合成色素进入体内，会损害人体器官甚至致癌，特别对代谢排毒能力比较弱的老人、孕妇和儿童，危害更加明显，对此，我国GB 2760—2011《食品添加剂使用标准》 [4]对食品中色素的使用进行严格的规定，用来控制食品中色素的含量。
目前对食品中色素的检测方法主要有分光光度法 [5-8]、薄层色谱法 [9-10]、极谱法 [11]、表面等离子体共振法 [12]、高效液相色谱法 [13-22]、毛细管电泳法 [23-26]等。由于雪糕含有乳制品和蛋制品，基体较为复杂，对检测的干扰较大，因而目前对雪糕中色素的检测少有报道。高效液相色谱法和毛细管电泳法都可用于雪糕中色素的检测 [12,21]，但与毛细管电泳法相比，高效液相色谱法存在试剂消耗量大，所需成本高、分析时间长等缺点。相关文献 [27]报道中先加入沉淀剂使雪糕中蛋白质和增稠剂等大分子物质沉淀，再用国标 [28]中聚酰胺吸附法对样液中色素进行提取，色素提取率为74.6%～92.7%，此法操作复杂，试剂消耗量大，需分步完成，所耗时间长；本实验向雪糕中直接加入甲醇进行提取，同时实现了基体的分离和色素的提取，色素提取率为90.6%～98.0%，在提取率略有提高的情况下，简化了操作步骤，缩短了提取时间。所得提取液经微孔膜过滤后直接进样，实现了雪糕中色素的快速提取与检测。
1.1 材料与试剂
5 种伊利牌雪糕（小布丁雪糕、香橙雪糕、香芋雪糕、榴莲雪糕、葡萄雪糕） 市购。
氢氧化钠（NaOH，分析纯） 天津市化学试剂批发公司；硼砂（Na 2B 4O 7，分析纯） 天津化学试剂三厂；磷酸二氢钠（NaH 2PO 4，分析纯） 天津市科密欧化学试剂有限公司；色素（亮蓝、柠檬黄、日落黄、苋菜红、新胭脂红） 阿拉丁试剂公司；甲醇（色谱纯）；实验用水均为二次蒸馏水。
1.2 仪器与设备
P/ACE TMMDQ高效毛细管电泳仪（配有紫外检测器以及32 Karat软件） 美国Beckman公司；内径75 μm未涂层石英毛细管 邯郸鑫诺光纤色谱有限公司；KQ5200DA型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；AP250D分析天平 美国Ohaus公司；飞鸽牌TDL-16B型离心机 上海安亭科学仪器厂；PSH-2C型精密酸度计 上海大普仪器有限公司；0.22 μm一次性针孔过滤器；Lambda35紫外-可见分光光度计 美国PerkinEimer公司。
1.3 方法
1.3.1 溶液的制备
分别称量10.0 mg的亮蓝、日落黄、苋菜红、新胭脂红、柠檬黄放置于5 个容量瓶中，用二次蒸馏水溶解后定容成1.0 mg/mL的标准储备液。配制10 mmol/L Na 2B 4O 7-5 mmol/L NaH 2PO 4的缓冲溶液，用0.1 mol/L的NaOH溶液调至pH 11.5。
1.3.2 样品处理
将买来的雪糕放于烧杯中封口，待其溶化后，混合均匀，称取5.0 g于100 mL烧杯中，加入10mL的甲醇，玻璃棒搅拌1 min，超声提取20 min（隔5 min搅拌1 次），转移至15 mL的离心管中，以6 000 r/min离心10 min，取上层清液，用0.22 μm一次性针孔过滤器过滤两次，放置于冰箱中4 ℃保存备用。
1.3.3 操作条件
对新毛细管进行活化，在20 psi条件下，用0.1 mol/L NaOH、二次蒸馏水和缓冲溶液各冲洗20min；2 次进样间分别用0.1 mol/L NaOH溶液、二次蒸馏水和缓冲溶液冲洗5 min。检测波长：214 nm；分离电压：25 kV；进样时间：4 s；缓冲溶液：10 mmol/L Na 2B 4O 7-5 mmol/L NaH 2PO 4（浓度为0.7 mmol/L的β-环糊精）；pH 11.5。
2.1 样品处理条件的选择
对小布丁雪糕按1.3.2节中方法进行处理，经检测未发现有色素的添加，选择该雪糕作为基底。平行称取等量小布丁雪糕3 份放置于烧杯中，向其中添加0.1 mg/mL的色素，分别用等量的甲醇、乙醇、乙醇-氨水对其中色素进行单次提取，经超声离心处理后，观察发现，乙醇-氨水提取剂不能实现雪糕基体中蛋白质、增稠剂等大分子物质的完全沉淀，而甲醇和乙醇可以实现，进而对3 种提取剂的提取效率进行考察，结果如表1所示，乙醇-氨水的平均提取率为37.0%～43.5%，乙醇的平均提取率为55.5%～68.8%，而甲醇的平均提取率为90.6%～98.0%，甲醇的提取率最好，所以本实验选择甲醇作为提取剂。
表 1 溶剂提取率实验（n=3）
Table 1 Comparison of the extraction efficiencies of different solvents for synthetic dyes (s (n = 3) %
提取剂色素甲醇乙醇乙醇-氨水提取率平均提取率提取率平均提取率提取率平均提取率亮蓝97.5、97.9、98.798.061.4、62.1、59.761.138.2、39.2、37.338.2日落黄94.6、97.2、94.795.569.8、67.2、63.166.735.0、34.9、41.137.0苋菜红93.6、90.8、91.692.070.1、67.7、68.768.844.8、42.8、43.643.5新胭脂红97.7、96.9、96.597.066.1、65.4、66.165.935.8、35.6、42.638.0柠檬黄91.7、90.6、89.590.655.8、54.1、56.855.541.1、39.6、39.540.1
2.2 电泳分离条件的确定
2.2.1 检测波长的选择
配制一定质量浓度的亮蓝、日落黄、苋菜红、新胭脂红和柠檬黄的标准溶液，用水做空白，在200～650 nm范围内对其进行紫外扫描，确定5 种色素在214 nm波长处均有较大吸收，故将214 nm作为最佳检测波长。
2.2.2 缓冲溶液pH值对分离的影响
图 1 pH值对5 种色素分离的影响
Fig.1 Effect of running buffer pH on the separation of five synthetic dyes
缓冲溶液pH值通过对电渗流和分析物解离度的影响，从而影响分析物的分离情况，本实验考察了10 mmol/L Na 2B 4O 7-5 mmol/L NaH 2PO 4缓冲溶液，pH值分别在10.0、10.5、11.0、11.5、12.0时对5 种色素分离的影响，结果如图1所示。a曲线、b曲线和c曲线只出现了4 个色素峰，表明了当pH值小于11.5时，5 个色素峰并不能完全分离；e曲线的峰形开始变差，而且有色素峰发生重叠，分离不完全；只有d曲线所有色素峰分离完全，无重叠现象，因此实验中选择11.5为最佳pH值。
2.2.3 缓冲溶液浓度的影响
缓冲溶液浓度通过影响电渗流和溶液的黏度，从而影响样品的分离情况。本实验分别考察了5 mmol/L和10 mmol/L Na 2B 4O 7与5 mmol/L和10 mmol/L NaH 2PO 4在不同浓度配比（5∶5、10∶5、5∶10、10∶10）时对5 种色素分离的影响，并对影响分离效果的原因进行分析，结果见图2，a曲线和c曲线出现了色素峰的重叠，分离效果受到影响；d曲线由于浓度增大，有较多的焦耳热产生，导致峰形展宽，分离不完全；b曲线中所有组分均完全分离，因此本实验选择的缓冲溶液中Na 2B 4O 7和NaH 2PO 4的最佳浓度配比为10∶5，即10 mmol/L Na 2B 4O 7-5 mmol/L NaH 2PO 4溶液。
图 2 缓冲溶液浓度对5 种色素分离的影响
Fig.2 Effect of running buffer concentration on the separation of five synthetic dyes
2.2.4 添加剂对分离的影响
为了进一步改善峰形，提高分离的选择性，本实验考察乙腈、丙酮、β-环糊精作为添加剂对5 种色素分离情况的影响，结果表明乙腈的加入会导致分析物迁移时间的延长，丙酮的加入会导致峰形变差，而β-环糊精的加入可缩短分离时间，提高分离效率。β-环糊精有着特殊的内疏水外亲水的环状中空圆筒型结构，当将其加入到缓冲溶液中时，会对缓冲溶液中客体离子产生一定程度的包合，使缓冲溶液中离子强度降低，Zeta电势增大，电渗流增大，即加大了外加电压，进而缩短了分离时间，改善了峰形，提高了分离效率 [26]。因此选择β-环糊精作为添加剂。进一步考察不同浓度（0.6、0.7、 0.8 mmol/L）β-环糊精对分离的影响，结果如图3所示，a曲线中有色素峰发生重叠，5 种色素不能完全分离；b曲线中5 种分析物得到完全分离；c曲线中基线不稳，色素峰展宽，分离效果下降。因此，β-环糊精的最佳浓度为0.7 mmol/L。
图 3 3 β-环糊精的添加量对分离的影响
Fig.3 Effect of β-cyclodextrin concentration on the separation of five synthetic dyes
2.2.5 外加电压对分离的影响
外加电压也是影响分离度的一个重要因素，外加电压较低时，迁移时间延长，峰形展宽，当外加电压增大时，样品迁移速度增大，迁移时间缩短，但是产生的焦耳热也会增加，造成基线不稳，分离效果降低。考察外加电压分别为15、20、25、30 kV时，5 种色素分离的情况，结果见图4，a曲线和b曲线，5 种色素可以完全分离，但是所需时间长，c曲线中所有组分完全分离，d曲线中，由于峰的展宽有两个色素峰发生重叠，不能完全分离，综合考虑，选择25 kV作为最佳外加电压。
图 4 外加电压对5种色素分离的影响
Fig.4 Effect of applied voltage on the separation of five synthetic dyes
2.3 标准曲线及仪器检出限
表 2 添加剂的线性方程及检出限
Table 2 Standard curves for determining dyes by HPCE and their limits of detection
添加剂线性方程线性相关系数线性范围/（μg/mL）检出限/（μg/mL）亮蓝Y=157.25X＋3.510.998 45～1 0002日落黄Y=834.39X-10.670.997 910～1 0002.8苋菜红Y=633.90X＋1.1650.999 95～1 0001.7新胭脂红Y=297.35X＋0.030.999 710～1 0008.6柠檬黄Y=1 995.08X-60.750.997 510～1 0001.2
配制5 种色素的系列标准溶液，在最佳电泳条件下进行测定，以色素质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）作图得标准曲线，得到线性相关系数（r）、线性范围和各物质的仪器检出限（R SN=3），见表2。
2.4 实际样品分析
2.4.1 色素峰的确定
按1.3.2节中提到的方法对样品进行处理，在最佳电泳条件下对样品进行分析，采用标准加入法确定样品中所含色素含量，如图5所示，香橙雪糕中含有日落黄和柠檬黄，葡萄雪糕中含有亮蓝、苋菜红和柠檬黄，榴莲雪糕中含有柠檬黄，香芋雪糕中含有亮蓝和苋菜红。
图 5 样品色谱峰的确定
Fig.5 HPCE profiles of real samples
2.4.2 实际样品的色素含量
按1.3.2节中的方法对4 种雪糕样品进行处理，取处理好的雪糕样品，在最佳电泳条件下平行测定3 次，根据线性方程，计算出样品中色素的含量，结果见表3。
表 3 市售4种雪糕中色素的含量
Table 3 Contents of food dyes in four different flavored ice-creams μg/mL
样品亮蓝日落黄苋菜红新胭脂红柠檬黄香橙雪糕49.635.3葡萄雪糕127.717.631.9榴莲雪糕31.6香芋雪糕12.32.4
2.4.3 样品回收率和精密度
根据2.4.2节中所给出结果，将样品所含色素含量的2～3 倍作为添加量，进行回收率实验，测得结果见表4，平均回收率在93.8%～108.5%之间，相对标准偏差不大于4.19%，说明本法适用于雪糕中色素的测定，精密度良好，数据准确可靠。
表 4 色素在雪糕中的回收率（n=3)
Table 4 Recoveries of synthetic dyes in ice-cream (n = 3)
样品色素样品检出量/（μg/mL）添加量/（μg/mL）加标测定值/（μg/mL）回收率/%平均回收率/%相对标准偏差/%葡萄雪糕亮蓝127.7500613.6、618.0、584.3798.2、97.2、91.395.62.91苋菜红17.65070.1、67.7、68.7101.4、104.9、102.2102.81.72柠檬黄31.9100128.5、125.3、121.795.3、96.5、89.793.83.62香橙雪糕亮蓝12.350061.2、61.2、60.696.6、97.7、97.897.44.19苋菜红2.458.0、8.1、7.3112.2、98.3、114.9108.51.04榴莲雪糕柠檬黄31.6100127.1、126.6、123.296.1、95.0、94.695.22.23日落黄49.6100 144.1、144.3、143.494.4、94.6、94.794.60.37柠檬黄35.3100129.6、132.5、134.198.8、97.2、94.396.82.25香芋雪糕
本实验使用高效毛细管电泳-紫外检测法，在最佳电泳条件下（检测波长214 nm、外加电压25 kV、缓冲溶液10 mmol/L Na 2B 4O 7-5 mmol/L NaH 2PO 4（含有浓度为0.7 mmol/L的β-环糊精）、pH 11.5），实现5 种合成色素的同时检测。通过选用甲醇对雪糕样品进行处理，在该条件下对其进行检测，所得平均回收率为93.8%～108.5%，相对标准偏差不大于4.19%，表明该方法准确可靠，为雪糕中合成色素的同时检测提供了较好的理论依据。
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Determination of Different Synthetic Dyes in Ice-Cream by High Performance Capillary Electrophoresis with UV Detection
GUO Fangfang
1, FENG Feng
1,2,*, BAI Yunfeng
2, CHEN Zezhong
2, LIU Lizhen
2, LI Rong
2, ZHOU Gao
2
(1. School of Chemistry and Chemical Engineering, Shanxi University, Taiyuan 030006, China；2. School of Chemical and Environmental Engineering, Shanxi Datong University, Datong 037009, China)
Abstract：An efficient high performance capillary electrophoresis (HPCE) method with ultraviolet detector has been successfully developed for the determination of brilliant blue, sunset yellow, amaranth, ponceau 4R and tartrazine in icecream. The running buffer was composed of 10 mmol/L Na 2B 4O 7and 5 mmol/L NaH 2PO 4containing 0.7 mmol/L betacyclodextrin at pH 11.5. The detection wavelength was set at 214 nm and applied voltage 25 kV. Under these conditions, the linear range was from 10 to 1 000 μg/mL with correlation coefficients between 0.997 5 and 0.999 9 and the limit of detection (LOD) varied from 1.2 to 8.6 μg/mL (R SN= 3). The average recoveries (n = 3) were in the range from 93.8% to 108.5%, with a relative standard deviation (RSD) lower than 4.19%. This method is convenient, accurate and suitable for the simultaneous detection of multiple synthetic dyes.
Key words：high performance capillary electrophoresis； synthetic dyes； ice-cream
中图分类号：O658.9
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2015）08-0206-05
doi：10.7506/spkx1002-6630-201508038
收稿日期：2014-06-12
基金项目：国家自然科学基金面上项目（21175085）
作者简介：郭芳芳（1989—），女，硕士研究生，主要从事毛细管电泳研究。E-mail：13546046121@163.com
*通信作者：冯锋（1964—），男，教授，博士，主要从事毛细管电泳研究。E-mail：feng-feng64@263.net