辽宁传统发酵豆酱中乳酸菌及酵母菌分离鉴定

武俊瑞 1，王晓蕊 1，唐筱扬 1，王茜茜 1，乌日娜 1，2，*，岳喜庆 1

（1.沈阳农业大学食品学院，辽宁沈阳 110866；2.江南大学食品学院，食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡 214122）

摘要：以采自辽宁省不同地区农家38 份传统发酵豆酱样品为试材，通过选择性培养分离出豆酱中的优势乳酸菌及酵母菌疑似菌株，再利用16S rDNA和26S rDNA D1/D2序列分析方法，对其进行初步鉴定并保藏。结果表明，14 个地区38 份样品中共分离到乳酸菌62 株，初步鉴定结果为L. plantarum 19 株、E. faecium 14 株、T. halophilus 12 株、L. sakei 11 株、L. fermentum 4 株、P. pentosaceus 2 株。分离到酵母菌56 株，初步鉴定结果为Zygosaccharomyces 18 株、Candida 13 株、C. parapsilosis 14 株、D. hansenii 7 株、Debaryomyces 4 株。丹东市、沈阳市、阜新市等地区的样品中乳酸菌和酵母菌的多样性较好。

传统发酵豆酱是以大豆为原料，经过煮制、挤压成块、制曲、发酵而成，在制曲和发酵过程中，利用原料和环境中的微生物自然发酵，微生物利用蛋白质、脂肪、碳水化合物等大分子物质分解成为小分子的风味物质，使豆酱的pH值和各种养分发生变化 [1-5]。由于其良好的风味和营养价值广受人们欢迎。传统发酵豆酱中含有异黄酮类、多酚类、大豆皂苷、类黑精、肽类、维生素等大量对人体有益的生理活性物质，具有很好的保健功能 [3，5-7]。

豆酱中微生物的种类繁多，包括乳酸菌、酵母菌、霉菌等。乳酸菌是豆酱呈味的主要微生物，可将精氨酸、酪氨酸、组氨酸及天冬氨酸分解，同时对丝氨酸、苏氨酸和苯丙氨酸等进行特异性脱羧基作用，左右着酱的香气 [8-10]。酵母菌在豆酱发酵过程中主要起着发酵糖类产酸和产生醇类的作用 [11-12]。另外乳酸菌与酵母菌协同作用，乳酸和乙醇生成乳酸乙酯，和鲁氏酵母生成糠醇，从而产生独特的酱香气。同时乳酸菌发酵产生的乳酸使得体系pH值降低，有利于酵母菌的增殖，而酵母菌发酵产生的大量乙醇却会制约着乳酸菌的繁殖 [13]。乳酸菌和酵母菌在豆酱发酵中相互协同也相互影响。

本研究以采自辽宁地区的38 份传统发酵豆酱样品为实验材料，从豆酱中分离出乳酸菌和酵母菌疑似菌株，再利用16S rDNA序列分析方法和26S rDNA D1/D2序列同源性分析，对其进行鉴定并保藏，为进一步开发利用豆酱中乳酸菌和酵母菌资源提供了基础数据。

1 材料与方法

表1 样品采集结果
Table 1 Geographic sources of samples collected for this study

样品编号样品来源样品编号样品来源SY1～SY5辽宁省沈阳市LY1～LY2辽宁省辽阳市DD1～DD3辽宁省丹东市AS1～AS2辽宁省鞍山市CY1～CY3辽宁省朝阳市YK1～YK3辽宁省营口市BX1～BX2辽宁省本溪市PJ1～PJ2辽宁省盘锦市FS1～FS4辽宁省抚顺市HLD1～HLD3辽宁省葫芦岛市JZ1～JZ2辽宁省锦州市TL1辽宁省铁岭市DL1～DL3辽宁省大连市FX1～FX3辽宁省阜新市

MRS培养基、马铃薯葡萄糖（potato dextrose agar，PDA）培养基、孟加拉红琼脂培养基本实验室自行配制。

细菌基因组DNA小量制备试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、Taq DNA聚合酶、DNA Marker 上海桑尼生物科技有限公司。

JNOEC XS-212-201生物显微镜日本Olympus公司；5804R型离心机德国Eppendorf公司；SHP-1500型低温生化培养箱上海精宏实验设备有限公司；HZQ-F160全温振荡培养箱哈尔滨东联电子技术开发有限公司；2720型Thermal Cycler PCR仪美国ABI公司；Tanon 2500凝胶成像系统中国天能公司；ND-1000型微量紫外分光光度计美国Nano Drop公司。

采用倾注培养法，将豆酱样品进行10 倍梯度稀释后，取10 —4～10 —7的样品稀释液100 μL于平板中，倒入含有CaCO 3的灭菌MRS琼脂培养基20 mL，混合均匀并凝固后，于30 ℃培养24～48 h。挑取有钙圈的单菌落，在灭菌后的MRS固体培养基上反复划线分离，置于30 ℃培养24～48 h，确定为单菌落后置于10 倍放大镜下进行菌落形态学观察，并且进行革兰氏染色，于100 倍光学显微镜下进行菌体形态学观察，并记录 [14-16]。最后用MRS固体培养基进行穿刺保藏。

采用十六烷基三甲基溴化铵（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）法提取供试菌株基因组DNA [17-18]。使用ND-1000型微量紫外分光光度计检测基因组DNA的浓度以及OD 260 nm/OD 280 nm比值，再用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。

1.4.2.2 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增16S rDNA序列

16S rDNA 扩增引物：正向引物为27f：5’-AGAGTTT G A T C C T G G C T C A G-3’；反向引物为1 4 9 5 r：5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’。PCR扩增反应体系（25 μL）：上下游引物各1 μL（10 pmol/μL），模板DNA（100 ng/μL）1 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP Mix 2 μL，超纯水17.2 μL ，rTaq酶0.3 μL。PCR扩增反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，循环30 次；72 ℃延伸10 min，4 ℃保温 [19-20]。

取3 μL的PCR产物与1 μL的6×Loading Buffer混合，加入1%的琼脂糖凝胶点样孔中，在电压为5 V/cm，电泳液为0.5×TBE（Tris硼酸）中电泳。电泳结束后，用溴化乙锭（ethidium bromide，EB）进行染色，染色30 min，将胶板置于凝胶成像系统中观察。PCR产物检测后，片段长度约为1 500 bp的阳性产物直接送上海桑尼生物科技有限公司进行序列测定 [21-22]。

将所得序列在GenBank数据库中进行基本局部相似性比对搜索工具（basic local alignment search to ol，BLAST）同源性比对分析，运用Mega4.0软件的相邻计算法构建系统发育树，判定目的菌的分类地位或它的系统发育地位 [18，21]。

将豆酱样品进行梯度稀释，取10 —4～10 —7的样品稀释液100 μL，均匀涂布在孟加拉红琼脂培养基中，25 ℃培养48 h。挑取与酵母菌菌落形态相符的单个菌落，接于PDA液体培养基中，25 ℃培养24 h。传至二代，用平板划线的方法，接种于PDA琼脂培养基上，25 ℃培养48 h [23-24]。挑取培养好的平板上分离出的单菌落，接于PDA液体培养基中依上述纯化过程再次纯化两代。用接种环挑取纯化过的二代菌种，以划线的方式保藏于PDA固体斜面上，25 ℃培养48 h。

采用酵母基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）对酵母菌总DNA进行提取。使用ND-1000型微量紫外分光光度计检测基因组DNA的浓度和OD 260 nm/OD 280 nm比值，用1%的琼脂糖凝胶对基因组DNA进行电泳检测。

26S rDNA D1/D2扩增引物：正向引物为NL1-FA：5’-GCAGAGTTCTCGGAGTCACGAGCATATCAATA AGCGGAGGAAAAG-3’；反向引物为NL4-RA：5’-AG CGGATCACTTCACACAGGAGGTCCGTGTTTCAAG ACGG-3’。PCR扩增反应体系（50 μL）：上下游引物各1 μL（10 pmol/μL），模板 DNA（100 ng/μL）1 μL，10×PCR Buffer 5 μL，4×dNTP Mix 1 μL，超纯水40 μL，rTaq酶1 μL。PCR扩增反应程序为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min 20 s，循环36 次；72 ℃延伸8 min，4 ℃保温 [23-26]。

取2 μL的PCR产物与1 μL的6×Loading Buffer混合，加入1%的琼脂糖凝胶点样孔中，在电压为5 V/cm，电泳液为0.5×TBE中电泳。电泳结束后，用EB进行染色，染色30 min，将胶板置于凝胶成像系统中观察。PCR产物检测后，将片段长度约为600 bp的阳性产物直接送上海桑尼生物科技有限公司进行序列测定。

将所得序列在GenBank数据库中进行BLAST同源性比对分析 [25-26]。

2 结果与分析

本实验共从豆酱样品中分离出62 株乳酸菌，其中有28 株球菌（45.2%），34 株杆菌（54.8%）。在MRS固体培养基中，菌落形态为乳白色或透明且表面光滑的圆形菌落。菌落直径集中在0.5～1.5 mm。革兰氏染色发现62 株菌均为革兰氏阳性菌，菌落形态分为球状和杆状，排列方式为单个、成对或短链。

图1 部分菌株16S rDNA PCR扩增产物电泳图
Fig.1 Electrophoresis of 16S rDNA PCR products from lactic acid bacteria

M. DL2000 DNA Marker；1. DD2-1；2. PJ1-2；3. FX2-2；4. SY1-2；5. CY2-1；6. BX1-1；7. DL2-2；8. YK2-1。

图1所示为部分菌株16S rDNA PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测结果，可以观察到所有泳道的1 500 bp左右位置均出现了一条亮带，并且无明显非特异扩增现象，符合测序要求。将PCR片段长度在1 500 bp左右的阳性产物进行序列测定。

将62 株乳酸菌16S rDNA扩增产物测序结果同国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）数据库进行BLAST同源性对比分析（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）。结果如表2所示。

表2 乳酸菌16S rDNA序列分析结果
Table 2 Results of 16S rDNA sequence analysis for 62 LAB strains

菌株编号鉴定结果同源性/%菌株编号鉴定结果同源性/% DD1-2L. plantarum100YK2-1E. faecium99 DD3-1L. plantarum100TL1-1E. faecium100 PJ1-2L. plantarum100DD1-1T. halophilus100 HLD1-2L. plantarum100PJ1-1T. halophilus99 HLD2-2L. plantarum99HLD2-1T. halophilus100 FX1-1L. plantarum100FX2-1T. halophilus100 FX3-1L. plantarum100SY4-2T. halophilus100 FX3-2L. plantarum99FS1-1T. halophilus100 SY2-1L. plantarum100FS2-2T. halophilus100 SY3-2L. plantarum100FS3-2T. halophilus100 SY5-1L. plantarum100JZ1-1T. halophilus99 CY1-2L. plantarum99LY2-2T. halophilus100 FS3-1L. plantarum100AS2-1T. halophilus100 BX2-2L. plantarum100CY3-1T. halophilus100 DL3-1L. plantarum100DD2-2L.sakei100 LY2-3L. plantarum100PJ2-1L. sakei100 YK1-2L. plantarum99HLD1-1L. sakei100 YK3-1L. plantarum100FX2-2L. sakei100 TL1-2L. plantarum100SY1-2L. sakei99 DD2-1E. faecium100SY3-1L. sakei100 HLD3-1E. faecium99FS2-1L. sakei100 FX1-2E. faecium100DL2-1L. sakei100 SY4-1E. faecium100LY1-1L. sakei99 CY2-1E. faecium100LY1-2L. sakei100 FS1-2E. faecium99LY2-1L. sakei100 FS4-1E. faecium100SY1-1L. fermentum100 BX1-1E. faecium100CY1-1L. fermentum100 BX2-1E. faecium100BX1-2L. fermentum99 DL2-2E. faecium100JZ2-1L. fermentum100 AS1-1E. faecium99DL1-1P. pentosaceus100 YK1-1E. faecium100DL3-2P. pentosaceus100

由表2可知，DD1-2等19 株菌与Lactobacillus plantarum KJ026699.1的同源性达到99%或100%，所以将其鉴定为L. plantarum；DD2-1等14 株与Enterococcus faecium FJ972173.1的同源性达到99%或100%，所以将其鉴定为E. faecium；DD1-1等12 株菌与Tetragenococcus halophilus FJ715470.1的同源性达到99%或100%，所以将其鉴定为T. halophilus；DD2-2等11 株菌与Lactobacillus sakei EU626014的同源性达到99%或100%，所以将其鉴定为L. sakei；SY1-1等4 株菌与Lactobacillus fermentum EF371900.1的同源性达到99%或100%，所以将其鉴定为L. fermentum；DL1-1与DL3-2与Pediococcus pentosaceus AJ305321的同源性达到99%或100%，所以将其鉴定为P. pentosaceu。

本研究从辽宁省14 个地区采集到的38 份样品中共分离出了62 株乳酸菌，通过16S rDNA序列分析后共鉴定出6 个种，L. plantarum19 株，是样品中分离数量最多的菌种，除锦州和鞍山外均分离到该菌株，占总数的30.65%；E. faecium有14 株，除盘锦、锦州和辽阳外均分离到该菌株，占总数的22.58%；T. halophilus有12 株，占总数的19.35%；分离到L. sakei 11 株，占总数的17.74%。另外，还分离到4 株L. fermentum和2 株P. pentosaceus，这2 株P. pentosaceus均分离自大连样品。14 个地区中，有85.71%的地区都分离到了L. plantarum，78.57%的地区分离到了E. faecium，有71.43%的地区分离到了T. halophilus，可初步推测这3 种菌为辽宁省地区自然发酵豆酱中存在的优势菌。

根据同源序列的搜索结果，下载相关模式株的序列，利用本地软件Mega4.0将测得序列与GenBank中的模式菌株16S rDNA序列进行分析，构建系统发育树（图2），获得目的菌的分类地位和它的系统发育地位。

从系统发育树（图2）可以看出，Lactobacillus sakei SY3-1形成了第一群，Lactobacillus plantarum BX2-2和Lactobacillus fermentum CY1-1的16S rDNA序列在进化关系上亲缘关系较近，形成了第二类群；Tetragenococcus halophilus FS2-2和Enterococcus faecium DD2-1形成了第三类群，所有分离株与相对应的参考菌株同源性都达到了99%以上，并与其聚在一起，证明乳酸菌16S rDNA区域序列分析结果的准确性。

本研究从辽宁省14 个地区38 份样品中共分离到6 个种62 株乳酸菌，其中乳球菌为3 个种28 株（45.16%），乳杆菌3 个种34 株（54.84%），表3汇总了每个种的乳酸菌的地区分布情况。

表3 各地区豆酱样品中乳酸菌分离鉴定情况
Table 3 Distribution of lactic acid bacteria in fermented soybean paste from different regions

注：*、□、#、○、※标注的字母或数字分别表示：样品采集地、各地采样数量、各地分离到该菌的样品份数、各地分离到该菌菌株数、该菌总数。

菌株名称L. plantarumE. faeciumT. halophilusL. sakeiL. fermentum P. pentosaceus DD */3 □2 #.2 ○.19 ※1 #.1 ○.14 ※1 #.1 ○.12 ※1 #.1 ○.11 ※PJ */2 □1 #.1 ○.19 ※1 #.1 ○.12 ※1 #.1 ○.11 ※HLD */3 □2 #.2 ○.19 ※1 #.1 ○.14 ※1 #.1 ○.12 ※1 #.1 ○.11 ※FX */3 □2 #.3 ○.19 ※1 #.1 ○.14 ※1 #.1 ○.12 ※1 #.1 ○.11 ※SY */5 □3 #.3 ○.19 ※1 #.1 ○.14 ※1 #.1 ○.12 ※2 #.2 ○.11 ※1 #.1 ○.4 ※CY */3 □1 #.1 ○.19 ※1 #.1 ○.14 ※1 #.1 ○.12 ※1 #.1 ○.4 ※FS */4 □1 #.1 ○.19 ※2 #.2 ○.14 ※3 #.3 ○.12 ※1 #.1 ○.11 ※BX */2 □1 #.1 ○.19 ※2 #.2 ○.14 ※1 #.1 ○.4 ※JZ */2 □1 #.1 ○.12 ※1 #.1 ○.4 ※DL */3 □1 #.1 ○.19 ※1 #.1 ○.14 ※1 #.1 ○.11 ※2 #.2 ○.2 ※LY */2 □1 #.1 ○.19 ※1 #.1 ○.12 ※2 #.3 ○.11 ※AS */2 □1 #.1 ○.14 ※1 #.1 ○.12 ※YK */3 □2 #.2 ○.19 ※2 #.2 ○.14 ※TL */1 □1 #.1 ○.19 ※1 #.1 ○.14 ※

由表3可知，从丹东市采集的3 个样品中共分离到4 个种（占种数的66.67%）5 株乳酸菌（占总菌数的8.06%）；盘锦市采集的2 个样品中分离出乳酸菌3 个种（占种数的50%）3 株（占总菌数的4.83%）；葫芦岛市的3 个样品中分离出乳酸菌4 个种（占种数的66.67%）5 株（占总菌数的8.06%）；来自阜新市的3 个样品中分离出4 个种（占种数的66.67%）乳酸菌6 株（占总菌数的9.68%）；沈阳市的5 份样品中分离出乳酸菌5 个种（占种数的83.33%）8 株（占总菌数的12.9%）；朝阳市的3 份样品中分离出乳酸菌4 个种（占种数的66.67%）乳酸菌4 株（占总菌数的6.45%）；抚顺市的4 份样品中分离出乳酸菌4 个种（占种数的66.67%）乳酸菌7 株（占总菌数的11.29%）；本溪市的2 份样品中分离出乳酸菌3 个种（占种数的50%）乳酸菌4 株（占总菌数的6.45%）；来自锦州市的2 个样品中分离到乳酸菌2 个种（占种数的33.33%）2 株乳酸菌（占总菌数的3.23%）；大连市采集的3 个样品中分离出4 个种（占种数的66.67%）乳酸菌5 株（占总菌数的8.06%）；辽阳市采集的2 个样品中分离出3 个种（占种数的50%）乳酸菌5 株（占总菌数的8.06%）；鞍山市采集的2 个样品中分离出乳酸菌2 个种（占种数的33.33%）2 株（占总菌数的3.23%）；营口市采集的3 个样品中分离出乳酸菌2 个种（占种数的33.33%）4 株（占总菌数的6.45%）；铁岭市采集的1 个样品中分离出乳酸菌2 个种（占种数的33.33%）2 株（占总菌数的3.23%）。

实验共从豆酱样品中分离出56 株酵母菌。在PDA固体培养基中，菌落颜色为乳白色或奶油色，表面光滑，呈圆形或卵圆形。菌落大而厚，直径大于3 mm。

图3为部分菌株26S rDNA D1/D2扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测结果，所有泳道的600 bp左右位置均出现了一条亮带，并且无明显非特异扩增现象，符合测序要求。将PCR片段长度在600 bp左右的阳性产物进行序列测定。

图3 部分菌株26S rDNA D1/D2 PCR扩增产物电泳图
Fig.3 Electrophoresis of 26S rDNA D1/D2 PCR products from yeast

M. DL2000 DNA Marker；1. DD3；2. PJ1-A；3. FX1-A；4. SY3-B；5. CY1；6. BX1-A；7. DL2-B。

将56 株酵母菌26S rDNA D1/D2扩增产物测序结果同NCBI数据库进行BLAST同源性对比分析（http://www. ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）。结果如表4所示。

表4 酵母菌26S rDNA D1/D2序列分析结果
Table 4 Results of 26S rDNA D1/D2 sequence analysis for yeast

菌株编号鉴定结果同源性/%菌株编号鉴定结果同源性/% SY2Zygosaccharomyces100 HLD3Candida100 SY5Zygosaccharomyces100FX1-BCandida99 DD1-AZygosaccharomyces100FX2Candida100 DD3Zygosaccharomyces100SY1-AC. parapsilosis99 CY1Zygosaccharomyces99SY3-BC. parapsilosis100 CY3-BZygosaccharomyces100DD2C. parapsilosis100 FS2Zygosaccharomyces100CY3-AC. parapsilosis99 FS3-AZygosaccharomyces99BX2C. parapsilosis100 JZ2Zygosaccharomyces100FS3-BC. parapsilosis100 DL1Zygosaccharomyces100JZ1-AC. parapsilosis100 AS1-BZygosaccharomyces100DL3C. parapsilosis100 YK3Zygosaccharomyces99LY1-BC. parapsilosis100 PJ1-AZygosaccharomyces100AS1-CC. parapsilosis100 HLD1Zygosaccharomyces100YK1C. parapsilosis99 TL1Zygosaccharomyces100PJ2C. parapsilosis100 YK2-BZygosaccharomyces100HLD2-BC. parapsilosis100 FX1-AZygosaccharomyces99FX2C. parapsilosis100 FX3Zygosaccharomyces100SY3-AD. hansenii100 SY1-BCandida100DD1-BD. hansenii100 SY4Candida100JZ1-BD. hansenii100 CY2Candida99DL2-AD. hansenii100 BX1-ACandida100AS1-AD. hansenii100 FS4Candida100PJ1-BD. hansenii100 DL2-BCandida100FX1-CD. hansenii100 LY1-ACandida99BX1-BDebaryomyces100 AS2Candida100FS1Debaryomyces99 YK2-CCandida100LY2Debaryomyces100 HLD2-ACandida100YK2-ADebaryomyces100

通过在NCBI数据库进行BLAST同源性对比分析（表4），SY2等18 株菌被鉴定为Zygosaccharomyces；SY1-B等13 株被鉴定为Candida；SY1-A等14 株菌被鉴定为C. parapsilosis；SY3-A等7 株菌被鉴定为D. hansenii；BX1-B等4 株菌被鉴定为Debaryomyces。

本研究从辽宁省14 个地区采集到的38 份样品中共分离出了56 株酵母菌，通过26S rDNA D1/D2序列分析后共鉴定出5 个种，Zygosaccharomyces18 株，是样品中分离数量最多的菌种，占总数的32.14%；Candida 13 株，占总数的23.21%；C. parapsilosis 14 株，占总数的25%；分离到D. hansenii 7 株，占总数的12.5%。还分离到4 株Debaryomyces，分别来自本溪、抚顺、辽阳、营口。14 个地区中，有34.21%的地区都分离到了Zygosaccharomyces和C. parapsilosis，26.32%的地区分离到了Candida，可初步推测这3 种菌为辽宁省自然发酵豆酱中存在的优势菌。

本研究从辽宁省14 个地区38 份样品中共分离到5 个种56 株酵母菌，表5汇总了每个种的酵母菌的地区分布情况。

表5 各地区豆酱样品中酵母菌分离鉴定情况
Table 5 Distribution of yeast in fermented soybean paste from different regions

注：*、□、#、○、※标注的字母或数字分别表示：样品采集地、各地采样数量、各地分离到该菌的样品份数、各地分离到该菌菌株数、该菌总数。

菌株名称ZygosaccharomycesCandidaC. parapsilosisD. hanseniiDebaryomyces DD */3 □2 #.2 ○.18 ※1 #.1 ○.14 ※1 #.1 ○.7 ※PJ */2 □1 #.1 ○.18 ※1 #.1 ○.14 ※1 #.1 ○.7 ※HLD */3 □1 #.1 ○.18 ※2 #.2 ○.13 ※1 #.1 ○.14 ※FX */3 □2 #.2 ○.18 ※2 #.2 ○.13 ※1 #.1 ○.14 ※1 #.1 ○.7 ※SY */5 □2 #.2 ○.18 ※2 #.2 ○.13 ※2 #.2 ○.14 ※1 #.1 ○.7 ※CY */3 □2 #.2 ○.18 ※1 #.1 ○.13 ※1 #.1 ○.14 ※FS */4 □2 #.2 ○.18 ※1 #.1 ○.13 ※1 #.1 ○.14 ※1 #.1 ○. 4 ※BX */2 □1 #.1 ○.13 ※1 #.1 ○.14 ※1 #.1 ○.4 ※JZ */2 □1 #.1 ○.18 ※1 #.1 ○.14 ※1 #.1 ○.7 ※DL */3 □1 #.1 ○.18 ※1 #.1 ○.13 ※1 #.1 ○.14 ※1 #.1 ○.7 ※LY */2 □1 #.1 ○.13 ※1 #.1 ○.14 ※1 #.1 ○.4 ※AS */2 □1 #.1 ○.18 ※1 #.1 ○.13 ※1 #.1 ○.14 ※1 #.1 ○.7 ※YK */3 □1 #.1 ○.18 ※1 #.1 ○.13 ※1 #.1 ○.14 ※1 #.1 ○.4 ※TL */1 □1 #.1 ○.18 ※

由表5可知，从阜新市采集的3 个样品中共分离到4 个种（占种数的80%）6 株酵母菌（占总菌数的10.71%）；沈阳市采集的5 个样品中分离出酵母菌4 个种（占种数的80%）7 株（占总菌数的12.5%）；大连市的3 个样品中分离出酵母菌4 个种（占种数的80%）4 株（占总菌数的7.14%）；来自鞍山市的2 个样品中分离出4 个种（占种数的80%）乳酸菌4 株（占总菌数的7.14%）；营口市的3 份样品中分离出酵母菌4 个种（占种数的80%）4 株（占总菌数的7.14%）。由此可见，辽宁省阜新市和沈阳市自然发酵豆酱中酵母菌多样性较好。

3 结论

本研究从辽宁省14 个地区38 份样品中共分离到乳酸菌62 株，并用乳酸菌16S rDNA序列分析法对分离到的乳酸菌进行鉴定，鉴定结果为L. plantarum 19 株、E. faecium 14 株、T. halophilus 12 株、L. sakei 11 株、L. fermentum 4 株、P. pentosaceus 2 株。分离到酵母菌56 株，经过26S rDNA D1/D2序列分析方法鉴定结果为Zygosaccharomyces 18 株、Candida 13 株、C. parapsilosis 14 株、D. hansenii 7 株、Debaryomyces 4 株。

14 个地区中，有85.71%的地区都分离到了L. plantarum；78.57%的地区分离到了E. faecium；有71.43%的地区分离到了T. halophilus，可初步推测这3 种菌为辽宁省自然发酵豆酱中存在的优势菌。14 个地区中，有34.21%的地区都分离到了Zygosaccharomyces和C. parapsilosis，26.32%的地区分离到了Candida，可初步推测这3 种菌为辽宁省自然发酵豆酱中存在的优势菌。

丹东市、沈阳市、阜新市等地区的样品中乳酸菌的多样性较好，而营口市和铁岭市均发现2 种乳酸菌，多样性较差。辽宁省阜新市和沈阳市自然发酵豆酱中酵母菌多样性较好。

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Identification of Lactic Acid Bacteria and Yeast from Naturally Fermented Soybean Paste from Liaoning Province

WU Junrui 1， WANG Xiaorui 1， TANG Xiaoyang 1， WANG Qianqian 1， WU Rina 1，2，*， YUE Xiqing 1
(1. College of Food Science， Shenyang Agricultural University， Shenyang 110866， China; 2. State Key Laboratory of Food Science and Technology， School of Food Science and Technology， Jiangnan University， Wuxi 214122， China)

Abstract：In this study， 38 traditional fermented soybean paste samples from Liaoning province were collected and used for the isolation of dominant lactic acid bacteria and yeast strains by selective culture method， and preliminary identification by 16S rDNA or 26S rDNA D1/D2 sequencing and conservation of the isolated strains were carried out. The results showed that 62 strains of lactic acid bacteria were isolated from 38 samples， including 19 L. plantarum strains， 14 E. faecium strains，12 T. halophilus strains， 11 L. sakei strains， 4 L. fermentum strains and 2 P. pentosaceus strains. In addition， 56 strains of yeast were also isolated， including 18 Zygosaccharomyces strains， 13 Candida strains， 14 C. parapsilosis strai ns，7 D. hansenii strains， and 4 Debaryomyces strains. Samples from Dandong， Shenyang and Fuxin displayed a wider diversity of lactic acid bacteria and yeast.

基金项目：国家自然科学基金面上项目（31470538；31471713）；中国博士后科学基金项目（2014M560395）；江苏省博士后科研资助计划项目（1402071C）

作者简介：武俊瑞（1977—），男，副教授，博士，研究方向为食品生物技术。E-mail：junruiwu@126.com

*通信作者：乌日娜（1979—），女，副教授，博士，研究方向为食品生物技术。E-mail：wrn6956@163.com

辽宁传统发酵豆酱中乳酸菌及酵母菌分离鉴定

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结 论

3 结论