植物乳杆菌表面性质及对Caco-2细胞的黏附

李 清 1,2,刘小莉 1,王 英 1,董明盛 2,周剑忠 1,*

(1.江苏省农业科学院农产品加工研究所,江苏 南京 210014;2.南京农业大学食品科技学院,江苏 南京 210095)

摘 要:通过对10 株不同来源的植物乳杆菌进行自聚集能力、表面疏水性以及体外黏附Caco-2细胞能力的测定,探究植物乳杆菌表面性质与黏附能力之间的关系,利用LiCl对植物乳杆菌进行处理,探究参与植物乳杆菌对细胞黏附过程的物质。结果表明:植物乳杆菌3-4对Caco-2细胞的黏附能力最强。所选的不同植物乳杆菌之间自聚集能力、表面疏水性以及对Caco-2细胞的黏附能力存在差异性;对细胞的黏附能力与表面疏水性存在着显著的相关性(P<0.05),因此,自聚集能力和疏水性可以作为筛选具有高黏附细胞能力的植物乳杆菌的参考指标。同时LiCl处理前后,植物乳杆菌自聚集能力和对细胞的黏附能力均有所下降,表明菌株表面蛋白类物质及其他大分子物质均参与自聚集和黏附过程。

关键词:植物乳杆菌;自聚集;疏水性;黏附

益生菌是指能以一定数量存活并定殖于宿主肠道内,通过调节肠道菌群平衡对宿主健康发挥有益作用的单一或者特定微生物混合物 [1-3]。为了调节人体肠道,发挥益生作用,益生菌必须能够在胃肠道中良好定殖,而对黏膜的黏附是定殖及增生的第一步 [4-6]。益生菌的黏附能力可为其提供竞争优势,是其在人体消化道中长期定殖的必要条件。益生菌黏附过程包括菌体与不同接触表面之间的非特异性物理作用和黏附素与特定受体间的特异性结合 [7]。特异性黏附是通过特定的黏附素-受体结合实现的;非特异性黏附则是通过疏水相互作用、静电作用等进行。阐明益生菌的黏附机理对于制备益生菌制剂和更好地认识微生态学基本规律都具有十分重要的意义。

体外研究益生乳杆菌黏附最常用的方法是体外细胞培养法。人体结肠腺癌细胞系如Caco-2细胞株,因其在体外生长所表现出的形态和功能特征可以模拟成熟肠道上皮细胞 [8-9],常作为体外模型来评价乳杆菌的黏附和定殖能力,但是体外培养细胞一般耗时较长,耗费较高,因此研究乳杆菌的自聚集能力和疏水性也可以为功能性益生乳杆菌的筛选提供参考。研究表明,疏水性与黏附性存在一定的相关性 [10],同时自聚集能力有助于生物膜形成,从而能够抑制致病菌对人体肠道的侵袭,有助于促进人体健康。本实验通过对10 株不同植物乳杆菌的自聚集能力、表面疏水性和对Caco-2细胞的黏附性进行研究,评价其黏附能力的高低,探究黏附与表面性质的关系,为肠道益生乳杆菌的筛选和黏附机制的探讨提供理论依据,同时通过对植物乳杆菌的化学处理,初步探讨其黏附机制。

1 材料与方法

1.1 菌种、细胞与培养基

10 株受试植物乳杆菌为实验室保藏菌种,分离自新疆酸马奶、酸驼奶、西藏灵菇,分别为:植物乳杆菌(Lactobacillus planturam,简写为L. p)AB1、L. p 3-4、L. p 9-5、L. p GCO10、L. p R2、L. p 3-1、L. p SR1-2、L. p A、L. p AB7、L. p M9-4。

人结肠腺癌细胞系Caco-2细胞株,购自上海博谷生物科技有限公司。

MRS培养基采用参考文献[11]的方法制备;高糖DMEM培养基、胰蛋白酶、双抗(青霉素、链霉素溶液) 上海英骏生物技术公司;胎牛血清 杭州四季青生物工程材料有限公司。

1.2 仪器与设备

YXQ-LS-50SⅡ/75SⅡ立式压力蒸汽灭菌器 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;PHS-25型数显pH计、离心机 上海精密科学仪器有限公司;净化工作台 上海新苗医疗器械制造有限公司;DNP-9272型生化培养箱 上海精宏实验设备有限公司;101-1型电热鼓风干燥箱 江苏省东台电器厂;PHS-2F型紫外-可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 植物乳杆菌的自聚集能力测定

按照Collado [12]和Tuo Yanfeng [13]等的方法并做适当修改:10 株植物乳杆菌分别以2%接种于灭菌后的液体MRS培养基中,37 ℃培养20 h。培养液4 ℃、10 000 r/min离心10 min,用pH 7.2的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)清洗2 次,然后重新悬浮于PBS中,调整细菌悬液浓度为10 7~10 8CFU/mL,取1 mL细菌悬液于600 nm波长处测定吸光度,记为A 0,细菌悬液37 ℃静置5 h后取1 mL上层清液至另一试管中,于600 nm波长处测定吸光度,记为A t。通过公式(1)计算自聚集能力。重复进行3 次独立实验,取平均值。

1.3.2 植物乳杆菌的表面疏水性测定

参考Rosenberg等 [14]的方法,并略加修改:按照

1.3.1 节的方法制备细菌悬液,再加入等体积的二甲苯,该两相体系涡旋混合3 min,37 ℃静置1 h后取出上清液,于600 nm波长处测定水相的吸光度,记做A。按照公式(2)计算菌株的表面疏水性。重复进行3 次独立实验,取平均值。

式中:A 0和A分别表示植物乳杆菌悬液及两相混合后水相的吸光度。

1.3.3 植物乳杆菌对Caco-2细胞的黏附

1.3.3.1 细胞培养

从液氮罐中取出Caco-2细胞,将冻存管迅速置于37 ℃水浴中复苏细胞,离心收集细胞后,加入5 mL DMEM完全培养液(含10%胎牛血清、1%双抗)后,于37 ℃、5% CO 2培养箱中培养,待细胞生长状况良好时(70%~80%融合),用0.25%胰酶-乙二胺四乙酸消化传代。细胞贴壁生长,隔天更换培养液,隔4 d进行传代,传代5 次左右进行黏附实验。

1.3.3.2 植物乳杆菌悬液的制备

10 株植物乳杆菌分别按2%的接种量接种于MRS液体培养基中,37 ℃培养20 h,于4 ℃、1 000 r/min离心10 min收集菌体。用无菌PBS(pH 7.2)洗涤3 次,将菌体重悬于不含血清和双抗的DMEM培养液中,调整菌悬液的浓度为1×10 8CFU/mL。

1.3.3.3 植物乳杆菌对Caco-2细胞的黏附观察 [15]

将细胞接种于含有盖玻片的6 孔板中,于37 ℃、5% CO 2培养箱中培养,隔天换液一次,待细胞长至单层时,用无菌PBS(pH 7.2)洗涤1 次,每孔中加入1 mL 1.3.3.2节所制备的细菌悬液(1×10 8CFU/mL)孵育1 h。用无菌PBS洗涤5 次,以除去未黏附的细菌。甲醇固定30 min,自然晾干后进行革兰氏染色,显微镜下观察植物乳杆菌的黏附情况。

1.3.3.4 植物乳杆菌对Caco-2细胞的黏附计数

细菌、细胞培养与处理同前,除了将细菌悬浮液直接滴加于细胞培养孔中而不放置盖玻片。经PBS洗涤后用1%的Triton X-100裂解10 min,梯度稀释后平板计数。另选取长至单层的培养孔进行细胞计数。每个处理做3 个平行,计算平均每个细胞黏附的细菌个数。

1.3.4 LiCl处理对植物乳杆菌自聚集能力和黏附能力的影响

10 株植物乳杆菌分别以2%接种量接种于灭菌的液体MRS培养基中,37 ℃培养20 h。培养液4 ℃、10 000 r/min离心10 min,用pH 7.2的PBS清洗2 次后悬浮于1/5体积的5 mol/L LiCl溶液中,冰浴处理30 min,PBS清洗2 次后,重复1.3.1节和1.3.3.4节的步骤。

1.4 数据分析

实验结果以 表示。采用Origin 8.0进行作图及分析。运用SAS 8.1软件,采用独立样本t检验进行数据分析(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 植物乳杆菌的自聚集能力

图1 植物乳杆菌的自聚集能力
Fig.1 Autoaggregation ability of L. planturam strains

小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。下同。

由图1可知,10 株不同植物乳杆菌之间的自聚集能力从8.33%到63.39%,差异显著(P<0.05)。10 株植物乳杆菌中,植物乳杆菌SR1-2的自聚集能力最差为8.33%。其中6 株植物乳杆菌自聚集能力达到20%以上,植物乳杆菌A的自聚集能力最强为63.39%,而植物乳杆菌AB1、植物乳杆菌9-5、植物乳杆菌GCO10、植物乳杆菌R2、植物乳杆菌M9-4的自聚集能力均在20%~30%之间。

2.2 植物乳杆菌的表面疏水性

图2 植物乳杆菌的表面疏水性
Fig.2 Cell surface hydrophobicity of L. planturam strains

由图2可知,10 株不同植物乳杆菌的疏水性有所差异,其中植物乳杆菌3-4的表面疏水性最高(P<0.05),达到67.90%,其次是植物乳杆菌A和植物乳杆菌M9-4,表面疏水性分别为60.37%和59.34%,植物乳杆菌AB1、植物乳杆菌9-5和植物乳杆菌GCO10表面疏水性均在45%~50%之间,植物乳杆菌3-1、植物乳杆菌AB7表面疏水性均在30%~40%之间。植物乳杆菌SR1-2的疏水性最低,为12.99%。

2.3 植物乳杆菌对Caco-2细胞的黏附能力

图3 植物乳杆菌对Caco-2细胞的黏附能力(×1 000)
Fig.3 Adhesion of L. planturam strains to Caco-2 cells by Gram staining under a light microscope (×1 000)

由图3可知,植物乳杆菌菌体形态完整,并且能够黏附在Caco-2细胞的周围,同时发现植物乳杆菌A(图3a)和植物乳杆菌3-4(图3b)黏附数量明显高于其他植物乳杆菌,植物乳杆菌3-1(图3c)和植物乳杆菌SR1-2(图3d)对Caco-2细胞的黏附能力较差,这与黏附计数的结果一致(图4)。同时发现植物乳杆菌A、植物乳杆菌3-4和植物乳杆菌3-1对Caco-2细胞的黏附较为规则,能整齐地黏附在细胞周围。

图4 植物乳杆菌对Caco-2细胞的黏附分析
Fig.4 Adhesion ability to Caco-2 cell of L. planturam strains

由图4可知,不同植物乳杆菌对Caco-2细胞的黏附能力存在显著差异(黏附数量为20.00~170.31,P<0.05),其中植物乳杆菌SR1-2黏附数量最少,黏附能力最差,植物乳杆菌3-4黏附数量最多,黏附能力最强。10 株实验植物乳杆菌中,植物乳杆菌3-4、植物乳杆菌9-5、植物乳杆菌R2、植物乳杆菌A和植物乳杆菌M9-4对Caco-2细胞的黏附数量均高于100,植物乳杆菌GCO10和植物乳杆菌AB1对Caco-2细胞的黏附数量在90~100之间,其余植物乳杆菌的黏附数量在20~60之间,黏附能力较差。

2.4 植物乳杆菌表面性质和黏附能力的相关性分析

图5 植物乳杆菌自聚集能力、表面疏水性和对细胞黏附能力的比较分析
Fig.5 Comparative analysis of autoaggregation, cell surface hydrophobicity and adhesion ability of L. planturam strains

由图5可知,植物乳杆菌的自聚集能力、表面疏水性和黏附能力存在一定的相关性。其中,表面疏水性与黏附能力存在显著相关性(P<0.05),表面疏水性高的植物乳杆菌对Caco-2细胞的黏附能力相应也高,表面疏水性低的植物乳杆菌对Caco-2细胞黏附能力也较低。如植物乳杆菌3-4疏水性最强,相应地对Caco-2细胞的黏附数量也最多,其次是植物乳杆菌A,疏水性较强,相应地对细胞的黏附数量也较多,而植物乳杆菌SR1-2表面疏水性最弱,相应地对细胞的黏附数量也最少,黏附能力最差。

由图5可知,除植物乳杆菌3-4和植物乳杆菌A以外,植物乳杆菌的自聚集能力与黏附能力也存在着一定正相关。自聚集能力强,细胞黏附数量较高,黏附能力也较强。植物乳杆菌3-4对Caco-2细胞的黏附数量最多,但其自聚集能力并不是最强的,而植物乳杆菌A的自聚集能力最强,但对Caco-2细胞的黏附数量却不是最多的。说明植物乳杆菌的自聚集能力与细胞黏附能力的关系在菌株间存在着差异性。

2.5 LiCl处理对植物乳杆菌自聚集能力和黏附能力的影响

由图6可知,与LiCl处理前的菌体细胞相比,经5 mol/L的LiCl处理后的菌体细胞自聚集能力明显降低。

图6 LiCl处理前后植物乳杆菌自聚集能力的变化
Fig.6 Comparison of autoaggregation ability of L. planturam strains before and after LiCl treatment

图7 LiCl处理前后植物乳杆菌对Caco-2黏附能力的变化
Fig.7 Comparison of adhesion ability of L. planturam strains before and after LiCl treatment

由图7可知,经5 mol/L的LiCl处理后,植物乳杆菌对Caco-2细胞的黏附能力也明显降低。植物乳杆菌R2、植物乳杆菌3-1和植物乳杆菌SR1-2对Caco-2细胞的黏附数量几乎为0,说明蛋白类物质在这3 株植物乳杆菌的黏附过程中起着重要的作用。而其他植物乳杆菌对Caco-2细胞的黏附数与LiCl处理前相比,虽有不同程度的降低,但依然保持较多的细胞黏附数量,说明这些菌株对Caco-2细胞的黏附过程不仅有蛋白类物质起作用,还有其他因素的作用。

3 结论与讨论

植物乳杆菌对肠道细胞的黏附和定殖是其发挥阻止外源病原菌入侵、清除肠道有害物质、保护胃肠黏膜等益生作用的先决条件。由于直接在体内研究植物乳杆菌对人肠道上皮细胞的黏附作用具有一定困难,因此本实验以人结肠癌腺细胞系Caco-2为模型,采用显微镜观察和平板计数的方法研究植物乳杆菌对细胞黏附状态和数量的差异。结果发现10 株植物乳杆菌对细胞的黏附能力存在菌株差异性,王丽群 [16]和del Re [17]等对双歧杆菌的黏附能力进行评价时,发现不同种类双歧杆菌之间也存在着黏附能力的差异性,由此可见,黏附能力与植物乳杆菌的自身性质存在着必然联系。

大量的研究结果表明,细菌的黏附能力与菌体表面性质存在较大的相关性 [18-20],研究黏附能力与表面性质的关系不仅可以通过表面性质快速筛选具有黏附性质的益生菌,同时可以初步判断黏附机制。自聚集能力和表面疏水性通常被认为是反映菌体黏附能力的两个特征。自聚集能力在细菌生物膜的形成过程中起着举足轻重的作用,同时自聚集能力的大小也影响着乳杆菌在人体肠道内定殖情况,表面疏水作用对于乳杆菌在人体肠道的定殖具有良好的促进作用。本实验选用10 株植物乳杆菌,研究其黏附能力与自聚集能力和表面疏水性的关系。结果发现黏附能力与表面疏水性存在显著相关性,这与陈臣等 [5]的研究一致。此外,已有研究通过测定表面疏水性来间接反映细菌的黏附能力大小,细菌表面疏水性越大,则其黏附能力越强 [21-22]。而黏附能力与自聚集能力的关系在菌株间存在差异性,与Tuo Yanfeng [13]和Vlková [23]等的研究结果一致。因此,自聚集能力和表面疏水性可作为筛选高黏附能力植物乳杆菌的参考指标。

黏附不仅涉及与表面性质有关的非特异性黏附,还包括与黏附素有关的特异性黏附 [24]。与黏附有关的物质包括蛋白质、多肽、糖蛋白、糖脂和多糖或单糖等。本实验发现经LiCl处理后的植物乳杆菌自聚集能力和黏附能力均有所下降,表明蛋白类物质在植物乳杆菌自聚集和黏附过程中起到一定作用;除植物乳杆菌R2、植物乳杆菌3-1和植物乳杆菌SR1-2外,其余植物乳杆菌对Caco-2细胞仍有黏附作用,说明除蛋白质外,其他黏附素在黏附过程中起主要作用,其黏附机制和黏附素的确定有待进一步研究。

通过对10 株从新疆酸马奶、酸驼奶、西藏灵菇中分离的植物乳杆菌进行自聚集能力、表面疏水性和对Caco-2细胞的黏附能力研究,发现自聚集能力与黏附能力存在菌株之间的差异性,而表面疏水性和黏附能力之间存在显著正相关,为高黏附植物乳杆菌的筛选提供了简单、合理、有效的筛选方法。通过比较LiCl处理前后植物乳杆菌自聚集能力和黏附能力的变化,发现植物乳杆菌对细胞的黏附不仅与蛋白质有关,其他黏附因素也起到至关重要的作用。今后的研究将进一步确定与黏附有关的物质及黏附机制。此外,具有高黏附能力的乳杆菌有利于调节人体肠道健康,为食品应用及功能性食品的开发提供可能。实验结果表明,植物乳杆菌3-4和植物乳杆菌A具有良好的黏附能力,其表面黏附物质的属性及在黏附中发挥作用的具体机制有待进一步研究。

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Surface Properties and Adhesion to Caco-2 Cells of Lactobacillus planturam Strains

LI Qing 1,2, LIU Xiaoli 1, WANG Ying 1, DONG Mingsheng 2, ZHOU Jianzhong 1,*
(1. Institute of Agricultural Products Processing, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China; 2. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Abstract:The autoaggregation ability, cell surface hydrophobicity and in vitro adhesion to Caco-2 cells of 10 Lactobacillus plan turam strains from different sources were assessed, and the relationship between surface properties and adhesion to Caco-2 cells. The compounds associated with the adhesion process were investigated by using LiCl-treated L. planturam strains. The results showed that L. planturam 3-4 showed the strongest adhesion to Caco-2 cells. Significant differences in autoaggregation, hydrophobicity and adhesion to Caco-2 cells were observed among the 10 L. planturam strains. Significant correlation existed between adhesion and cell surface hydrophobicity. Autoaggregation and hydrophobicity could be used as reference indexes for the screening of L. planturam strains with high adhesion ability. Meanwhile, when treated with LiCl, the autoaggregation and adhesion of some L. planturam strains were decreased, indicating that surface-bound proteins and other macromolecules play an important role in the process of autoaggregation and adhesion.

Key words:Lactobacilus planturam; autoaggregation; hydrophobicity; adhesion

中图分类号:Q939.117

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2015)09-0097-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201509018

收稿日期:2014-05-26

基金项目:江苏省农业科技自主创新项目(CX(13)3080)

作者简介:李清(1993—),女,硕士研究生,研究方向为食品微生物。E-mail:elenaliqing@126.com

*通信作者:周剑忠(1965—),男,研究员,博士,研究方向为食品生物技术。E-mail:zjzluck@126.com