响应面法优化假丝酵母Y6产γ-氨基丁酸发酵工艺

郑鸿雁 1,赵炜彤 1,昌妍希 2

(1.吉林农业大学食品科学与工程学院,吉林 长春 130118;2.内蒙古医科大学药学院,内蒙古 呼和浩特 010100)

摘 要:从火龙果果实表面上筛选出一株发酵产γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)假丝酵母菌菌株Y6(Candida sp.)。用反相高效液相色谱测定发酵液中GABA含量。响应面试验确定其最适培养基成分为:蔗糖23 g/L、麸皮65 g/L、L-谷氨酸6 g/L、磷酸吡哆醛0.5 mmol/L。最适培养条件为初始 pH 4.5、培养温度28 ℃、转速200 r/min、培养时间3.5 d。结果表明:优化之后GABA的产量提高了72%。

关键词:γ-氨基丁酸;假丝酵母;响应面法;培养基成分

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA),又称氨酪酸,是一种非蛋白质组成的天然氨基酸,分布非常广泛 [1],在动物 [2]、植物和微生物中均有γ-氨基丁酸存在 [3-6]。GABA是哺乳动物中枢神经系统一种主要的抑制性神经递质 [7],具有许多重要的生理功能,如降血压 [8]、安定神经 [9]、增强记忆 [10]、抗焦虑 [11],尤其对更年期的失眠、压抑和自身失调疗效良好 [12]。随着GABA的生理功能不断研究和阐明 [13],已经发展成为一种新型的功能性因子 [14],正逐渐应用于医药、食品及农业等行业中 [15-17]。目前GABA主要通过微生物发酵方法进行生产 [18],大肠杆菌是发现较早的具有谷氨酸脱羧酶活性的微生物,利用大肠杆菌发酵法制备的GABA一般用于化工生产,很少用于食品工业,因此制约了GABA的生产和开发 [19]。本研究以筛选自火龙果果实表面的假丝酵母菌株Y6为研究对象,通过单因素试验和响应面法对其产GABA进行发酵工艺条件优化,提高GABA产量。用麸皮作为发酵培养基中的氮源,为规模化利用廉价农副产品生产保健品奠定了基础,对于GABA的发酵生产具有参考意义。总之,国内学者的研究工作主要集中在筛选高产GABA的菌株上,但是其规模化生产的成本太高,因此降低γ-氨基丁酸的发酵培养成本是限制我国生产γ-氨基丁酸的瓶颈问题,突破该瓶颈势在必行。

1 材料与方法

1.1 菌株、培养基与试剂

假丝酵母(Candida sp.)Y6:分离自火龙果果实表面,购于长春市欧亚超市。菌种经生工生物工程(上海)股份有限公司分子生物学鉴定。

基础发酵培养基:葡萄糖30 g、麸皮40 g、L-谷氨酸5 g、磷酸吡哆醛0.12 g、K 2HPO 41 g、MgSO 4·7H 2O 0.5 g、KCl 0.5 g、FeSO 4·7H 2O 0.01 g,蒸馏水1 000 mL。

γ-氨基丁酸标准品 上海楷洋生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

Z-36HK高速低温冷冻离心机 德国Hermle公司;DL-CJ-2N超级洁净工作台、空气浴振荡箱 北京东联哈尔仪器制造有限公司;Shimadzu LC-20A高效液相色谱仪(SPD-20A紫外检测器,LC-20AT泵,CTO-10AS VP柱温箱,LC-solution工作站) 日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株Y6发酵基础培养条件

按2%的接种量接种在装有100 mL无菌发酵培养基(初始pH 6.0)的250 mL三角瓶中,26 ℃、200 r/min条件下恒温旋转培养2.0 d。

1.3.2 GABA含量的测定

用邻苯二甲醛(o-phthaldialdehyde,OPA)柱前衍生紫外检测反相高效液相色谱(reversed phase-high performance liquid chromatography,RP-HPLC)法测定发酵液中GABA含量。液相色谱条件:色谱柱:Venusil-AA氨基酸分析专用柱(5 μm)。流动相:流动相A为25 mmol/L的乙酸钠,用4%的乙酸调pH值至5.9;流动相B为纯乙腈。流速为1 mL/min,梯度洗脱程序如表1所示,柱温40 ℃,进样量20 μL,检测波长:332 nm。取发酵液5 000 r/min离心15 min取上清液,稀释到一定浓度。发酵液20 μL于样品瓶中,加入OPA衍生液100 μL,涡旋振荡5 s,静置2 min后,过0.45 μm滤膜,取20 μL进样。定量采用GABA标准曲线,取0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL GABA标准溶液分别邻苯二甲醛衍生后进行液相色谱测定。以色谱图中峰面积为纵坐标,以待测样品质量浓度(mg/mL)为横坐标绘制标准曲线,回归方程为y=8.9×10 7x+1 155.9(R 2=0.999 8)。采用RP-HPLC检测GABA所得的峰面积,根据标准曲线换算成GABA产量。

表1 梯度洗脱程序表
Table 1 Gradient elution program

时间/min流速/(mL/min)流动相A体积分数/%流动相B体积分数/% 0 1 9010 3014060 3510100 4510100

1.3.3 发酵培养基优化

1.3.3.1 单因素试验

选择不同碳源、碳源质量浓度、麸皮添加量、L-谷氨酸和磷酸吡哆醛作为影响假丝酵母Y6产GABA发酵培养基的主要因素。不同碳源种类有葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖(30 g/L),选取最适碳源进行发酵试验。各因素的水平梯度设置分别为最适碳源质量浓度15、20、25、30、35 g/L,麸皮添加量40、50、65、70、80 g/L,L-谷氨酸3、4、5、6、7、8、9 g/L,磷酸吡哆醛0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mmol/L。

1.3.3.2 响应面法优化培养基

根据单因素试验结果,选取蔗糖质量浓度、麸皮添加量、L-谷氨酸添加量、磷酸吡哆醛添加量4 个因素为自变量,单因素试验得出的各最佳条件为中心点,以GABA为响应值,进行响应面试验设计,确定发酵培养基最优培养基组分含量。每个试验重复3 次,取其平均值。

1.3.4 发酵条件优化

1.3.4.1 单因素试验

选择初始pH值、培养温度、摇床转速、培养时间作为影响假丝酵母Y6产GABA发酵条件的主要因素,通过单因素试验结果选取响应面试验的因素和水平。各因素的水平梯度设置分别为时间2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 d,温度22、24、26、28、30、32、34 ℃,初始pH 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0,摇床转速120、140、160、180、200、220 r/min。

1.3.4.2 响应面法优化培养条件

根据单因素试验结果,选取初始pH值、培养温度、摇床转速、培养时间4 个因素为自变量,单因素试验得出的各最佳条件为中心点,以GABA为响应值,进行响应面试验设计,确定最优发酵条件。每个试验重复3 次,取其平均值。

1.3.5 模型验证

通过响应面法优化假丝酵母菌Y6产GABA发酵条件进行发酵试验,比较模型预测值和试验值,验证模型的有效性。

1.4 数据分析

采用Design Expert 7.0软件设计四因素三水平响应面分析试验,试验结果采用Design Expert 7.0软件进行数据处理和分析,确定最佳试验条件。

2 结果与分析

2.1 发酵培养基的确定

2.1.1 培养基单因素试验结果

图1 培养基对GABA产量的影响
Fig.1 Effect of medium components on GABA production

由图1a可知,不同的碳源种类对GABA产量有差异,以蔗糖作为发酵培养基碳源时,GABA产量明显高于其他碳源,所以把蔗糖选作最适碳源。在确定碳源种类的基础上,进一步确定蔗糖质量浓度大小,由图1b可知,随着蔗糖质量浓度的增大,GABA产量增加,当蔗糖质量浓度为25 g/L时,GABA产量达到最大。但随着蔗糖质量浓度继续增大,GABA产量降低,分析原因有可能是碳源质量浓度过大,会使菌体大量繁殖,影响GABA的积累。L-谷氨酸脱羧后生成GABA,可作为其前体物,由图1c可知,随着L-谷氨酸的增加,GABA产量迅速增大,当L-谷氨酸质量浓度为6 g/L时,GABA产量达到3.100 g/L,但继续增加L-谷氨酸,GABA产量没有明显增大,可能是因为L-谷氨酸转化率已经达到最大。麸皮是廉价农副产品,把它作为培养基的氮源,可以降低成产成本,增大麸皮的利用价值,由图1d可知,随着麸皮添加量的增大,GABA产量增加,麸皮添加量在60 g/L时,GABA产量最高,在麸皮超过60 g/L时,GABA产量略有降低,磷酸吡哆醛是谷氨酸脱羧酶的辅酶,在发酵培养基加入它有促进谷氨酸脱羧酶的作用,由图1e可知,磷酸吡哆醛的最佳浓度为0.5 mmol/L。

2.1.2 培养基响应面优化

表2 发酵培养基响应面试验设计及结果
Table 2 Response surface central composite design and experimental results for the optimization of medium components

试验号X 1蔗糖质量浓度/(g/L)Y GABA产量/(g/L)1205050.52.651 2305050.52.701 3207050.53.103 4307050.52.765 5256040.43.170 6256060.43.218 7256040.63.101 8256060.63.111 9206050.42.988 10306050.42.623 11206050.62.599 12306050.62.732 13255040.52.993 14257040.52.934 15255060.52.766 16257060.53.201 17206040.52.992 18306040.53.001 19206060.53.192 20306060.52.908 21255050.42.751 22257050.42.924 23255050.62.532 24257050.63.014 25256050.53.231 26256050.53.342 27256050.53.345 28256050.53.346 29256050.53.347 X 2麸皮质量浓度/(g/L)X 3 L-谷氨酸质量浓度/(g/L)X 4磷酸吡哆醛浓度/(mmol/L)

表3 发酵培养基回归模型方差分析
Table 3 Analysis of variance of regression model for medium components

注:P<0.05表示差异显著;P<0.01表示差异极显著。下同。

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试验方案及试验结果见表2,回归分析见表3。根据试验结果,利用响应面分析软件对数据进行分析,以GABA产量为响应值,得到回归方程为Y=3.32—0.066X 1

由方差分析得出P值,模型极显著,模型的失拟项不显著,回归决定系数R 2=0.950 4,修正决定系数 = 0.900 7,说明方程拟合性较好,可以应用于对培养基优化的分析预测。根据结果进行分析:一次项X 1、X 4显著,X 2极显著,二次项 极显著,交叉项X 1X 2显著,X 1X 4、X 2X 3极显著。由表3可知,影响GABA产量的因素大小排序依次是麸皮质量浓度、蔗糖质量浓度、磷酸吡哆醛浓度、L-谷氨酸质量浓度。

图2 培养基交互因素响应面图及等高线图
Fig.2 Response surface and contour plots showing the effects of medium components on GABA production

发酵培养基交互因素响应面立体分析见图2。数据分析表明回归模型存在最大值,发酵培养基最优配方为:蔗糖23 g/L、麸皮65 g/L、L-谷氨酸6 g/L、磷酸吡哆醛0.5 mmol/L,此条件下理论预测最大值为3.453 g/L。验证实验此条件下GABA产量为3.450 g/L,基本与预测值一致,证明了模型的可靠性。

2.2 发酵培养最适条件的确定

2.2.1 发酵条件单因素试验结果

图3 发酵培养条件对GABA产量的影响
Fig.3 Effect of fermentation conditions on GABA production

由图3a可知,发酵培养基初始pH值在4.0~5.0的范围内,GABA产量在增大,当pH值大于5.0时,GABA产量明显下降,表明培养假丝酵母Y6的最适pH值在5.0附近。由图3b可知,温度为28 ℃,GABA产量最高,低于或高于28 ℃,都不利于菌株产GABA,说明28 ℃左右是假丝酵母Y6产GABA较为适宜的温度。由图3c可知,摇床转速从120 r/min增加到200 r/min的过程中,GABA产量不断增大,在转速高达220 r/min时,GABA产量略有降低。由图3d可知,在发酵时间为2.0 d时,GABA产量为2.500 g/L,随着发酵时间的延长,GABA产量逐渐增加。发酵时间在3.5 d时达最高,为4.100 g/L。但多于3.5 d时,GABA产量略有减少,选择3.5 d为发酵培养时间。

2.2.2 发酵条件响应面优化

表4 发酵条件响应面试验设计及结果
Table 4 Response surface central composite design and experimental results for the optimization of fermentation conditions

试验号X 1初始pH Y GABA产量/(g/L)14.5262003.54.123 25.5262003.53.315 34.5302003.53.887 45.5302003.53.303 55.0281803.03.422 65.0282203.03.383 75.0281804.03.394 85.0281804.03.589 94.5282003.03.795 105.5282003.03.601 114.5282004.04.197 125.5282004.03.550 135.0261803.53.568 145.0301803.53.409 155.0262203.53.291 165.0302203.53.193 174.5281803.53.942 185.5281803.53.234 194.5282203.53.511 205.5282203.53.515 215.0262003.03.799 225.0302003.03.234 235.0262004.03.330 245.0302004.03.640 255.0282003.54.221 265.0282003.54.165 275.0282003.54.289 285.0282003.54.203 295.0282003.54.147 X 2培养温度/℃X 3摇床转速/(r/min)X 4培养时间/d

表5 发酵条件回归模型方差分析
Table 5 Analysis of variance of regression model for fermentation conditions

变异来源方差平方和自由度均方F值P值模型3.420 0140.240 020.980<0.000 1 X 10.720 010.72 0061.780<0.000 1 X 20.048 010.048 04.1400.061 4 X 30.020 010.020 01.7000.213 5 X 40.018 010.018 01.5600.232 8 X 1X 20.013 010.013 01.0800.316 7 X 1X 30.130 010.130 010.8900.005 3 X 1X 40.051 010.051 04.4100.054 3 X 2X 30.000 910.000 10.0800.781 5 X 2X 40.190 010.190 016.4500.001 2 X 3X 40.014 010.014 01.1800.296 4 X 10.160 010.160 013.7300.002 4 X2 2 2 1.000 01185.690<0.000 1 X3 0.530 010.5345.850<0.000 1残余项0.160 0140.012失拟项0.150 0100.0154.9100.069 5误差0.01240.003 1总和3.5828 1.450 011.45124.290<0.000 1 X4 22

试验方案及试验结果见表4,回归分析见表5。根据试验结果,利用响应面分析软件对数据进行分析,以GABA产量为响应值,得到回归方程表达为:

由方差分析得出P值,模型极显著,模型的失拟性不显著,回归决定系数R 2=0.955 9,修正决定系数 说明方程拟合性较好,可以应用于对发酵条件优化的分析预测。根据结果进行分析:一次项X 1极显著,二次项 极显著,交叉项 极显著。由表5可知,影响GABA产量的因素由大到小排序依次是初始pH值、培养温度、摇床转速、培养时间。

图4 发酵条件交互因素响应面图
Fig.4 Response surface and contour plots showing the effects of fermentation conditions on GABA production

发酵条件交互因素响应面立体分析见图4。数据分析表明回归模型存在最大值,发酵最优条件为:初始pH 4.5、培养温度28 ℃、转速200 r/min、培养时间3.5 d,此条件下理论预测最大值为4.333 g/L。进行验证实验,此条件下GABA产量为4.300 g/L,基本与预测值一致。

与采用其他氮源发酵生产GABA相比,利用麸皮作为氮源突破发酵成本高的缺陷,降低其生产成本,增加麸皮及农副产品的附加值,实现农副产品环境友好的高附加值转化,在实际应用中具有更加广阔的发展空间。除酵母菌外,含有谷氨酸脱羧酶的大肠杆菌、霉菌、乳酸菌等也可用于GABA的生产 [20]。罗少华等 [21]以明胶为载体,戊二醛为交联剂,采用包埋-交联复合固载法固定大肠杆菌细胞用于制备γ-氨基丁酸,虽然具有较高的转化率,但安全性较差。边鑫等 [22]利用突变株米曲霉3.800接入大豆-水的培养基中发酵产GABA为0.874 g/L。江南大学黄桂东等 [23]从黄酒发酵过程中分离得到的一株具有产GABA能力的植物乳杆菌MJ0301进行了发酵培养基的优化,产量为1.590 g/L。本实验在发酵培养基中添加了辅酶磷酸吡哆醛,并且通过响应面优化了发酵培养基组分及发酵条件,有效地提高了发酵GABA的产量,最终GABA产量高达4.300 g/L。

3 结 论

本研究通过单因素试验和响应面试验方法,以GABA产量为指标,采用反相高效液相色谱邻苯二甲醛柱前衍生法对发酵液中GABA含量进行测定,优化了假丝酵母菌Y6产GABA发酵培养基及其发酵条件。确定了假丝酵母Y6发酵产GABA的最优培养基配方:蔗糖23 g/L、麸皮65 g/L、L-谷氨酸6 g/L、磷酸吡哆醛0.5 mmol/L,最适发酵条件:初始 pH 4.5、培养温度28 ℃、转速200 r/min、培养时间3.5 d。在此条件下,GABA产量达4.300 g/L,较优化之前的2.500 g/L提高了72%。用响应面法优化假丝酵母Y6产GABA的发酵工艺条件是有效可行的。然而产量提高与多种因素有关,除了对菌种发酵条件的优化以外,利用现代分子生物技术改变GAD的酶活性来提高产γ-氨基丁酸的产量有待进一步研究。

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Optimization of Medium Components and Culture Conditions for Enhanced Yield of γ-Aminobutyric Acid by Candida sp. Y6 by Response Surface Methodology

ZHENG Hongyan 1, ZHAO Weitong 1, CHANG Yanxi 2
(1. College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China; 2. Pharmacy College, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010100, China)

Abstract:In this study, we optimized medium components and culture conditions of Candida sp. Y6, a γ-aminobutyric acid (GABA)-producing strain isolated from the surface of pitaya, using response surface methodology (RSM). The content of GABA in fermentation broth was analyzed by reversed phase high performance chromatography (RP-HPLC). The optimal fermentation medium was found to consist of 23 g/L sucrose, 65 g/L wheat bran, 6 g/L L-glutamate, and 0.5 mmol/L pyridoxal phosphate, and the optimal culture conditions were initial medium pH 4.5 and 28 ℃ for 3.5 d with a shaking speed of 200 r/min. Under the optimal conditions, the yield of GABA was increased 72% when compared with that before optimization.

Key words:γ-aminobutyric acid; Candida sp.; response surface methodology; medium components

中图分类号:TS201.3

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2015)09-0130-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201509024

收稿日期:2014-07-29

作者简介:郑鸿雁(1968—),女,副教授,硕士,研究方向为功能食品、微生物菌种筛选及发酵工艺。E-mail:zhenghongyan6811@163.com