竹盐酿造酱油对H 2O 2诱发LLC-PK1细胞氧化损伤的保护作用

宋家乐 1,2,李贵节 2,3,赵 欣 2,3,*

(1.桂林医学院公共卫生学院,食品卫生与营养学教研室,广西 桂林 541004;2.重庆第二师范学院,功能性生态食品研究所,重庆 400067;3.重庆第二师范学院生物与化学工程系,重庆 400067)

摘 要:目的:研究竹盐酿造酱油乙醇提取物对H 2O 2诱发猪肾近曲上皮小管细胞(pig proximal tubular cell)LLC-PK1氧化损伤的保护作用。方法:以不同质量浓度(10~200 μg/mL)的竹盐酿造酱油乙醇提取物预培养LLC-PK1细胞24 h后,换用含500 μmol/L H 2O 2的DMEM细胞培养液继续培养4 h建立细胞氧化损伤模型。四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法检测细胞生存率,硫代巴比妥酸比色法测定细胞内丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量,比色法测定细胞内过氧化氢酶(catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活性和谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量。结果:经不同质量浓度竹盐酿造酱油乙醇提取物预处理24 h后,受损细胞的生存率上升,细胞内MDA生成量减少,ROS水平显著降低。同时,细胞内抗氧化酶(CAT、SOD和GSH-Px)的活性及其mRNA转录水平,GSH含量也较未经竹盐酿造酱油乙醇提取物处理的受损细胞增加。结论:竹盐酿造酱油乙醇提取物可以通过提高细胞内抗氧化酶系的活性和抗氧化物质GSH的含量而有效地对抗H 2O 2诱发的LLC-PK1细胞氧化损伤。

关键词:竹盐酿造酱油;氧化损伤;抗氧化;LLC-PK1细胞

自由基和活性氧(reactive oxygen species,ROS),例如超氧阴离子(O 2 )、过氧根离子(O 2 2—)、羟自由基(・OH)、过氧化氢(H 2O 2)和过氧亚硝酸根(ONOO )是生物体在进行有氧呼吸时所产生的一类代谢副产物。体内蓄积过多的ROS能引起细胞或组织发生氧化应激反应,特别是其诱发的肾脏上皮细胞氧化损伤,被认为是导致肾脏疾患的重要致病因素之一 [1]。特别值得注意的是,在诸多ROS中,H 2O 2能够较容易地穿过细胞膜进入细胞内部,诱发细胞膜内多聚不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应,进而引起肾脏细胞损伤,最后导致整个肾脏组织坏死 [1-3]。正常生理状态下,机体内部存在内源性抗氧化系统,包含过氧化氢酶(catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)以及非酶性的谷胱甘肽(glutathione,GSH)。内源性抗氧化物质能帮助清除体内过多的自由基和活性氧,以此缓解氧化应激所造成的损伤。此外,摄取含有丰富抗氧化物质的食品也有助于提升机体自身的抗氧化能力,缓解氧化应激对肾脏机能所造成的不良影响 [4-5]

酱油是以大豆为主要原材料,加入水、豆粕、淀粉、小麦和食盐等辅料经过制曲、微生物发酵等过程而制成的一种营养丰富且广受亚洲特别是东亚地区人群所喜爱的传统发酵调味品。酱油中富含多种人体需要的营养成分如糖类、必需氨基酸、脂肪酸、维生素、烟酸以及钙、磷等矿物质元素。现代科学研究表明,酱油也是一种具有抗氧化、抗癌、抗炎症、降血压等功效的保健食品 [6-9]。本实验利用体外培养LLC-PK1猪肾近曲小管上皮细胞建立H 2O 2诱导的LLC-PK1上皮细胞氧化损伤模型,探究竹盐酿造酱油乙醇提取物对H 2O 2所诱发的猪肾脏上皮细胞氧化应激损伤的保护作用机制,为竹盐酿造酱油在氧化应激所导致的肾脏疾病的保健预防功能研究方面提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 细胞株、材料与试剂

LLC-PK1猪肾近曲上皮小管细胞购自美国典型微生物菌种保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)。

竹盐酿造酱油系韩国仁山家竹盐公司产品。取适量冷冻干燥后的酱油样品,按1∶10(V/V)比例加入80%乙醇溶液,室温搅拌提取2~3 h后过滤,重复该过程3 次,合并滤液。滤液经3 600 r/min离心15 min后收集上清液,经50 ℃真空减压旋转蒸发后,制备得到酱油乙醇提取物并用二甲基亚砜配成质量浓度为20 mg/mL的储备液,—20 ℃贮存待用。

DMEM细胞培养液、胎牛血清、四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)、2’,7’-二氢二氯荧光黄双乙酸钠(2’,7’-dichloro-dihydro-fluorescein diacetate,DCFH-DA) 美国Sigma公司;Trizol试剂、OligodT 18、RNase、dNTP、MLV逆转录酶 美国Invitrogen公司;SOD测定试剂盒、CAT测定试剂盒、GSH-Px测定试剂盒、GSH测定试剂盒 南京建成生物工程研究所;其余试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

EYELA N-1001S旋转蒸发仪 日本东京理化器械株式会社;Thermo 3110二氧化碳细胞培养箱 美国Thermo公司;Combi-514R冷冻离心机 韩国Hanil株式会社;Bio-Rad 680酶标仪、Bio-Rad小型水平电泳槽美国Bio-Rad公司;ABI 2720 PCR仪 美国Applied Biosystems公司;FLUOstar OPTIMA荧光酶标仪 德国BMG公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养及分组

LLC-PK1细胞以含有10%胎牛血清的DMEM细胞培养液放置于37 ℃、5% CO 2环境下湿化培养,每2~3 d换液。分组时细胞按1×10 4、2×10 5个/孔分别接种于96 孔和6 孔细胞培养板中。待贴壁后,用含H 2O 2(500 μmol/L)的DMEM培养液继续培养4 h,制备氧化损伤细胞模型。LLC-PK1氧化损伤模型细胞分别按1×10 4个/孔,每孔100 μL接种于96孔板,细胞贴壁后,以不同质量浓度(10、50、100 μg/mL)的竹盐酿造酱油乙醇提取物(extract from bamboo salt sauce,BSSE)培养24 h后,进行后续实验测定。未经过任何处理的正常LLC-PK1细胞作为正常组。

1.3.2 MTT法测定细胞存活率

LLC-PK1细胞按照1.3.1节方法处理后,弃孔内培基并加入100 μL MTT溶液(终质量浓度 0.5 mg/mL)继续培养4 h。培养结束后弃上清液,每孔加100 μL二甲基亚砜避光振荡30 min,测定OD 490 nm后按公式(1)计算细胞生存率。

1.3.3 细胞内MDA生成量的测定

细胞接种于6 孔板,依1.3.1节方法处理后,硫代巴比妥酸比色法测定细胞内MDA生成量 [10]。在5 mL玻璃试管中加入500 μL细胞裂解上清液、400 μL 15%的三氯乙酸与0.67%硫代巴比妥酸混合溶液(内含0.01% 2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚),充分混匀并在95 ℃水浴中保温20 min。待冷却后,加入3 mL的异丙醇提取色素并测定OD 532 nm,细胞总蛋白含量以Bio-Rad蛋白质试剂盒定量。按照公式(2)计算MDA生成量。

1.3.4 细胞内ROS生成量的测定

在6 孔细胞培养板中按一定浓度接种细胞并依1.3.1节方法处理,加入含DCFH-DA(20 μmol/L)的DMEM培养液37 ℃孵育20 min,随后用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)清洗2 次,用FLUOstar OPTIMA荧光酶标仪测定荧光强度,激发波长为485 nm,发射波长为530 nm,按照公式(3)计算相对ROS含量。

1.3.5 细胞内抗氧化酶活力和GSH含量的测定

细胞按2×10 5个/孔接种于6 孔板,依1.3.1节所述方法处理后,取适量细胞培养上清液按SOD、CAT、GSH-Px和GSH各自的测定试剂盒说明书步骤操作,酶活力以酶比活力单位(U/mg pro)表示,并用细胞总蛋白质含量作校正。

1.3.6 逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)法检测竹盐酿造酱油乙醇提取物对LLC-PK1细胞相关基因表达的影响

LLC-PK1细胞接种于10 cm细胞培养皿中,依1.3.1节所述方法处理后,使用Trizol试剂照说明书提取细胞内总RNA,紫外法检测纯度后,将各样品组的总RNA浓度调整至同一水准。各组取等量RNA(2 μg)分别加入OligodT 18、RNase、dNTP和MLV酶各1 μL,5×Buffer 10 μL,在20 μL体系下,37 ℃ 120 min,99 ℃ 4 min,4 ℃ 3 min条件下合成cDNA。基因序列逆转录后,进行聚合酶链式反应。反应条件为95 ℃预变性5 min,58 ℃退火50 s,72 ℃延伸90 s,循环35 次,72 ℃延伸10 min。用2%的琼脂糖凝胶电泳检测最终产物的表达程度,并用Image J软件分析基因表达强度。

1.4 数据分析

所有实验均重复3 次,结果以 表示,并经SAS 9.2统计分析,多重比较采用Duncan’s 检验,P<0.05为具有差异显著性。

2 结果与分析

2.1 竹盐酿造酱油乙醇提取物对LLC-PK1细胞增殖的影响

采用MTT法观察10、50、100 μg/mL竹盐酿造酱油乙醇提取物对LLC-PK1猪肾近曲小管上皮细胞的毒性效应时,3 种质量浓度处理下的细胞生存率均超过80%(结果未显示),该结果提示竹盐酿造酱油乙醇提取物对LLC-PK1细胞没有细胞毒性作用。因此10~100 μg/mL为对细胞无影响的安全质量浓度,并用于后续研究。如图1所示,与正常组细胞比较,未经竹盐酿造酱油乙醇提取物预处理的细胞在暴露于H 2O 2(500 μmol/L)4 h后,生存率明显下降(P<0.05)。相反,经不同质量浓度竹盐酿造酱油乙醇提取物(10~100 μg/mL)预处理24 h后,受损细胞的生存率较损伤模型组(0 μg/mL)细胞明显增加,且保护效果随竹盐酿造酱油乙醇提取物的质量浓度增加而增强,并呈现出显著的剂量-效应关系(P<0.05)。该结果提示竹盐酿造酱油乙醇提取物(10~100 μg/mL)可有效地抑制氧化应激损伤所导致的细胞死亡。

图1 竹盐酿造酱油乙醇提取物对LLC-PK1猪肾近曲小管细胞的保护效果
Fig.1 Protective effect of ethanol extract from bamboo salt soy sauce on LLC-PK1 renal proximal tubule cells

小写字母不同表示组间差异显著(P<0.05)。下同。

2.2 竹盐酿造酱油乙醇提取物对受损LLC-PK1细胞内MDA生成量的影响

图2 竹盐酿造酱油乙醇提取物对H 2O 2致损LLC-PK1细胞内MMDDAA含量的影响
Fig.2 Effect of ethanol extract from bamboo salt soy sauce on the level of MDA in LLC-PK1 cells exposed to H 2O 2

自由基和ROS所诱发的氧化应激损伤可导致细胞膜上的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应,进而生成对细胞具有毒性作用的脂质过氧化产物MDA,因此MDA可作为衡量氧化应激对细胞造成损伤的指标物质 [11]。如图2所示,经500 μmol/L的H 2O 2处理后,LLC-PK1细胞内MDA的生成量明显上升(P<0.05),在同时给予不同质量浓度竹盐酿造酱油乙醇提取物(10、50、100 μg/mL)处理后,细胞内MDA生成量呈明显下降趋势,且在最高质量浓度100 μg/mL时,呈现出最强的MDA生成抑制能力,这是由于酱油中含有丰富的大豆异黄酮和类黑素等具有强抗氧化能力的活性物质 [12-13],而给予抗氧化剂可以降低H 2O 2引起肾脏细胞的脂质过氧化程度,防止肾脏细胞发生氧化性损伤 [14]。本结果提示竹盐酿造酱油乙醇提取物能有效地通过降低氧化应激损伤细胞内MDA的生成量而保护细胞。

2.3 竹盐酿造酱油乙醇提取物对受损LLC-PK1细胞内ROS生成量的影响

机体内部过量生成ROS可造成细胞的氧化应激损伤 [15-16]。作为一种重要的ROS,H 2O 2能较为容易地通过细胞膜进入细胞内并与细胞内的Fe 2+通过Fenton反应生成具有高度活性的•OH,进而造成细胞内生物大分子物质诸如DNA、蛋白质和脂类的损伤,导致细胞死亡 [17]。如图3所示,H 2O 2显著地提高了受损细胞内ROS水平,加速细胞氧化损伤的进程。相反,经24 h不同质量浓度竹盐酿造酱油乙醇提取物(10、50、100 μg/mL)预处理后,受损细胞内的ROS水平逐渐降低,且与损伤模型组(0 μg/mL)相比有明显差异(P<0.05)。该结果提示竹盐酿造酱油是一种良好的ROS清除剂。

图3 竹盐酿造酱油乙醇提取物对H 2O 2致损LLC-PK1细胞内ROS含量的影响
Fig.3 Effect of ethanol extract from bamboo salt soy sauce on the level of ROS in LLC-PK1 cells exposed to H 2O 2

2.4 竹盐酿造酱油乙醇提取物对受损LLC-PK1细胞内CAT、SOD、GSH-Px活力的影响

表1 竹盐酿造酱油对H 2O 2致损LLC-PK1细胞内CAT、SOD和GSH-Px活力的影响
Table 1 Effect of ethanol extract from bamboo salt soy sauce on the levels of CAT, SOD and GSH-Px in LLC-PK1 cells exposed to H 2O 2

注:同列小写字母不同表示组间差异显著(P<0.05)。

(μg/mL)CAT活力/(U/mg pro)SOD活力/(U/mg pro)GSH-Px活力/(U/mg pro)正常组3.67±0.45 a11.11±1.01 a2.57±0.09 a组别质量浓度/ 00.88±0.32 e3.62±0.85 d1.08±0.07 d101.61±0.28 d7.24±1.11 c1.56±0.09 c501.69±0.21 c7.84±0.80 c1.65±0.08 b1002.09±0.12 b8.92±1.12 b1.72±0.06 b竹盐酿造酱油乙醇提取物处理组

在正常生理状态下,内源性抗氧化物质如抗氧化酶(CAT、SOD、GSH-Px)以及非酶性的GSH能有效地对抗氧化应激损伤对机体造成的伤害。SOD可以将细胞内多余的超氧阴离子转化为H 2O 2,且生成的H 2O 2可以被CAT和GSH-Px转化为无害的水 [18]。如表1所示,H 2O 2能显著降低细胞内CAT、SOD和GSH-Px等抗氧化酶的活力,加速细胞的氧化损伤。相反,经24 h不同质量浓度竹盐酿造酱油乙醇提取物(10、50、100 μg/mL)预处理后,受损细胞内的抗氧化酶的活力逐渐升高,与损伤模型组(0 μg/mL)比较有明显差异(P<0.05)。此外,添加CAT和SOD有助于防止氧化应激对LLC-PK1细胞所造成的损伤,同时还可以抑制氧化应激所造成的脂质过氧化反应 [19-20]

2.5 竹盐酿造酱油乙醇提取物对LLC-PK1细胞内GSH含量的影响

GSH作为机体内的一种主要的非酶性抗氧化剂,不仅可以直接通过GSH-Px还原毒性的脂质过氧化物和H 2O 2,还可以间接地抑制体内自由基的链式反应,避免细胞因自由基所导致的损伤 [17-18]。如图5所示,H 2O 2明显降低细胞内GSH的含量,而经不同质量浓度竹盐酿造酱油乙醇提取物(10、50、100 μg/mL)预处理24 h后,受损细胞内GSH的含量逐渐增高,且与损伤模型组(0 μg/mL)比较存在明显差异(P<0.05)。

图4 竹盐酿造酱油乙醇提取物对H 2O 2致损LLC-PK1细胞内GSH含量的影响
Fig.4 Effect of ethanol extract from bamboo salt soy sauce on the level of GSH in LLC-PK1 cells exposed to H 2O 2

2.6 竹盐酿造酱油乙醇提取物对LLC-PK1细胞内CAT、SOD和GSH-Px基因表达水平的影响

图5 竹盐酿造酱油乙醇提取物对LLC-PK1细胞内CAT SOD和GSH Px基因表达的影响
Fig.5 Effect of ethanol extract from bamboo salt soy sauce on the gene expressions of CAT, SOD and GSH-Px in LLC-PK1 cells

A. 琼脂糖凝胶电泳结果;B、C、D. 电泳结果的定量分析。

如图5所示,竹盐酿造酱油乙醇提取物可有效地增强内源性抗氧化酶CAT、SOD和GSH-Px的基因在LLC-PK1细胞中的表达,从而增强对LLC-PK1细胞氧化应激损伤的保护作用。此外,增强细胞内CAT和GSH-Px的转录水平有助于提高细胞内总铜/锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn SOD)和锰过氧化物歧化酶(MnSOD)的活性,进而有效地帮助细胞对抗活性氧造成的氧化应激损伤 [16,19-20]

3 结 论

通过MTT法、硫代巴比妥酸比色法测定细胞内抗氧化标志物水平,采用RT-PCR法对竹盐酿造酱油乙醇提取物保护H 2O 2诱发猪肾近曲小管上皮细胞LLC-PK1发生氧化应激损伤的机制研究发现,LLC-PK1细胞暴露于H 2O 2(500 μmol/L)后,细胞生存率及胞内主要抗氧化酶活力明显下降,ROS水平及MDA含量明显上升;预先给予不同质量浓度的竹盐酿造酱油乙醇提取物处理24 h后,LLC-PK1细胞生存率较未经竹盐酿造酱油乙醇提取物处理的受损细胞明显增高(P<0.05)。作为细胞发生氧化应激损伤后的一种主要生物标志物,MDA是ROS攻击细胞生物膜内多不饱和脂肪酸后所形成的脂质过氧化物,检测其生成量可间接反映细胞的受损程度。经不同质量浓度竹盐酿造酱油乙醇提取物预先保护24 h后,受损细胞内的ROS及MDA含量较未经竹盐酿造酱油乙醇提取物处理的受损细胞明显降低。同时,受损细胞内的主要抗氧化酶(CAT、SOD和GSH-Px)活力及非酶性抗氧化物质GSH的含量也得到显著提升。此外,竹盐酿造酱油还能上调受损细胞内主要抗氧化酶的mRNA转录水平。本实验为竹盐酿造酱油作为保健食品缓解自由基引起的细胞氧化应激损伤提供了一定的理论依据,但本实验结果仅限于细胞水平的体外实验,对竹盐酿造酱油在氧化应激损伤下对细胞保护的具体分子生物学机制及其在体内的抗氧化保护机制还有待进一步的深入研究。

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Protective Effect of Bamboo Salt Soy Sauce on H 2O 2-Induced Cellular Oxidative Damage in LLC-PK1 Cells

SONG Jiale 1,2, LI Guijie 2,3, ZHAO Xin 2,3,*
(1. Department of Food Hygiene and Nutrition, School of Public Health, Guilin Medical University, Guilin 541004, China; 2. Institute of Functional Ecological Food, Chongqing University of Education, Chongqing 400067, China; 3. Department of Biological and Chemical Engineering, Chongqing University of Education, Chongqing 400067, China)

Abstract:The aim of this study was to investigate the protective effect of ethanol extract from bamboo salt sauce (BSSE) on H 2O 2-induced oxidative damage in porcine renal epithelial (LLC-PK1) cells. The LLC-PK1 cells were first incubated with different concentrations of BSSE (10-200 μg/mL) for 24 h, and then exposed to H 2O 2(500 μmol/L) for 4 h. MTT assay was used to evaluate the cell viability. The cellular levels of reactive oxygen species (ROS), lipid peroxidation, and antioxidant enzymes including catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSH-Px) and glutathione (GSH) were measured. In addition, mRNA levels of these antioxidant enzymes were determined by RT-PCR assay. BSSE was able to increase the cell viability, and also decrease the cellular levels of ROS, lipid peroxidation, as well as increase the activity and mRNA expression of antioxidant enzymes when compared with those in control cells. These results suggest that BSSE showed a protective effect against H 2O 2-induced oxidative damage in LLC-PK1 cells through inhibiting lipid peroxidation,deceasing ROS levels, and increasing antioxidant system activities.

Key words:bamboo salt soy sauce; oxidative damage; antioxidant; LLC-PK1 cells

中图分类号:TS201.4

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2015)09-0176-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201509032

收稿日期:2014-06-24

基金项目:重庆高校创新团队建设计划资助项目(KJTD201325)

作者简介:宋家乐(1983—),男,讲师,博士,研究方向为分子营养学和植物化学。E-mail:biopaul@pusan.ac.kr

*通信作者:赵欣(1981—),男,教授,博士,研究方向为食品营养学和食品化学。E-mail:foods@live.cn