吕 群，宁文艳，王 智，王玉霞，顾响响，武鹏凯，林 峰，王春梅 *
（北京中医药大学中药学院，北京 100102）
摘 要：目的：研究家蚕茧壳水解粉的急性毒性和遗传毒性。方法：应用小鼠急性毒性实验、体外哺乳类细胞（V79/HGPRT）基因突变实验、小鼠骨髓细胞染色体畸变实验及小鼠精子畸变实验对家蚕茧壳水解粉毒性进行研究。结果：该家蚕茧壳水解粉对雌雄小鼠半数致死量（median lethal dose，LD 50）均大于11.50 g/kg，属实际无毒物质；基因突变实验中各受试物剂量组的突变率均没有达到自发突变率的3 倍，亦无剂量-反应关系，结果为阴性；染色体畸变实验中家蚕茧壳 水解粉各剂量组与阴性对照组无显著差异（P＞0.05）；精子畸变实验中，样品低、中剂量组与阴性对照组 无显著差异（P＞0.05），而高剂量组畸变率显著低于阴性对照组（P＜0.05），证明实验结果均为阴性。结论：本次实验条件下，该家蚕茧壳水解粉属实际无毒级，未显示有急性毒性和遗传毒性作用。
关键词：家蚕茧壳水解粉；小鼠；急性毒性；遗传毒性
家蚕茧壳（silkworm cocoon），又名蚕衣、茧黄，为蚕蛾科昆虫家蚕蛾的茧壳 [1]。家蚕茧壳除了用于丝绸工业外，应用于中医临床也历史悠久，主治便血、尿血、血崩、消渴、反胃、痈肿、疳疮等。现代药理学研究表明家蚕茧壳具有降血糖作用 [2]。由于传统家蚕茧壳直接煮水的方法使用效率较低，现代研究者或企业利用酸碱水解或酶解等工艺将家蚕茧壳进行加工得到了家蚕茧壳水解物 [3]，进一步的研究发现家蚕茧壳水解物具有抗氧化 [4-6]、抗肿瘤 [7-8]、抗糖尿病 [9-13]、免 疫调节 [14]、降低血液中的甘油三酯和维持正常肝功能 [15-17]等作用。家蚕茧壳主要由纤维状蛋白质“丝心蛋白”，外包以另一种蛋白质“丝胶蛋白”黏结而成 [3]。家蚕茧壳经水解后得到的产物以氨基酸为主，另外含有一些活性肽 [17]。家蚕茧壳水解物已广泛用于多个品牌的外用美容产品中 [18-19]，近来国内有研究报道拟将其开发为抗氧化剂 [6]，国外也已经有多家公司将其开发为特殊食品在韩国、日本、俄罗斯和美国等地销售。已有文献报道该家蚕茧壳水解粉能提高小鼠体能和雄性生殖功能 [20]，给足球运动员服用后，能提高运动员的运动能力并对抗疲劳 [21]，显示了其作为食品或保健品具有巨大开发潜力，但其用作口服用品的安全性评价没有文献报道，这使得开发者心存顾虑。本研究通过急性经口毒性实验以及遗传毒性实验对家蚕茧壳水解粉进行安全性研究，为其进一步市场开发应用提供参考。
1.1 材料、细胞株与动物
家蚕茧壳水解粉，为淡黄色粉末，主要成分为氨基酸和活性肽，总氨基酸含量≥89.0%，肽含量约为4%，易溶于水，通过酸水解、中和、脱色等基本工艺流程制得 [22]，由韩国Worldway有限公司提供。
中国仓鼠肺细胞株（V79），购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。
健康昆明种小鼠，购于北京斯贝福实验动物科技有限公司，许可证号SCXK（京）2011-0004，SPF级。实验动物室室温（23±3）℃，相对湿度（55±15）%。
1.2 试剂与仪器
大鼠肝匀浆S-9混合物 上海宝录生物科技有限公司。
Nikon ECLIPSE E200光学显微镜 日本Nikon公司。
1.3 方法
实验方法与操作程序均按卫生部《保健食品检验与评价技术规范（2003年版）》 [23]进行。
1.3.1 小鼠急性毒性实验
选体质量18～22 g小鼠，雌雄各13 只，采用最大耐受剂量（maximum tolerated dose，MTD）实验法，实验前动物禁食16 h，不限饮水。受试样品剂量设为230 mg/d（成人使用剂量的100 倍）和最大灌胃容量20 mL/kg（一日内1 次或多次给予，一日内最多不超过3 次），空白对照组给予同体积蒸馏水。给药后连续观察14 d内小鼠的外观体征、精神状态、行为活动、饮水进食、粪便、呼吸、腺体分泌、体质量变化及死亡等情况。
1.3.2 遗传毒性实验
1.3.2.1 体外哺乳类细胞（V79/HGPRT）基因突变实验
将5×10 5个细胞接种于直径为100 mm平皿中，于37 ℃，5% CO 2培养箱中放置24 h，吸去培养液，用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗2 次，加入无血清培养液及一定质量浓度的受试物（受试物分为高（5.00 mg/mL）、中（3.00 mg/mL）、低（1.20 mg/mL）3 个剂量组，对于阳性对照物的选择，需要代谢活化的选用苯并芘（10 μmol/L），不需活化的选用甲基磺酸乙酯（1.0 mg/mL））。需代谢活化者同时加入大鼠肝匀浆S-9混合物，置于培养箱中2 h，结束后吸去培养液，换入含10%血清的培养液，继续培养19～22 h、消化计数，以5×10 5个细胞接种直径为100 mm的平皿，3 d后传代1 次，仍接种5×10 5个细胞培养3 d，共表达6 d。表达结束后消化细胞，每组5 皿，每皿2×10 5个细胞，待细胞贴壁后加入6-TG， 终质量浓度为5 μg/mL。培养8～10 d后固定，Giemsa染色，计数每皿集落数并计算突变率。同时另做集落形成率测定，每皿接种200 个细胞，不加6-TG，每组5 个皿，7 d后固定染色，计算集落形成率。
1.3.2.2 小鼠骨髓细胞染色体畸变实验
选体质量18～22 g小鼠60 只，随机分成5 组，每组12 只，雌雄各半，3 个受试物组的剂量分别为11.50、2.88、1.44 g/kg，设阴性对照组（相同体积的蒸馏水）和阳性对照组（环磷酰胺0.04 g/kg）。经口给予受试物4 次，每次间隔24 h，在末次给受试物后24 h颈椎脱臼处死小鼠。处死小鼠前2 h，按4 mg/kg腹腔注入秋水仙素。取股骨骨髓制片，每鼠观察100 个分散良好、着色清晰的中期相细胞，每个剂量组观察1 200 个中期相细胞，计数染色体畸变率。
1.3.2.3 小鼠精子畸变实验
选体质量25～20 g雄性性成熟小鼠25 只，随机分为5 组，每组5 只，3 个受试物组的剂量分别为11.60、2.90、1.45 g/kg，设阴性对照组（相同体积的蒸馏水）和阳性对照组（环磷酰胺0.06 g/kg）。连续经口给予受试物5 d，均于首次给受试物后的第35天处死动物，取两侧附睾，制备精子标本，高倍镜下检查每只动物的精子形态，计数结构完整的不少于1 000 个精子中精子畸形的数量。
1.4 统计学分析
采用SPSS 19.0对数据进行统计处理，对于计数资料采用泊松分布和卡方检验进行实验组与对照组的比较分析，结果用
表示。
2.1 小鼠急性毒性实验结果
给药后小鼠未见中毒症状，小鼠有1 例死亡，经剖检后发现是由于灌胃失误导致。14 d后处死动物，观察小鼠各脏器均未见异常。本品灌胃给药小鼠的半数致死量（median lethal dose，LD 50）大于11.50 g/kg，表明其无急性毒性，属实际无毒物质。小鼠体质量增长情况见表1。
表1 家蚕茧壳水解粉对小鼠急性经口毒性体质量增长的影响
Table 1 Impact of silkworm cocoon hydrolysate powder on body weight in mice in acute oral toxicity test g
组别剂量/（g/kg）给药前给药后7 d给药后14 d空白对照组22.67±0.9828.92±2.9532.65±2.65雌性给药组11.5021.78±1.0325.28±2.1726.42±1.55雄性给药组11.5022.04±1.26 28.90 ±2.49 31.45±2.88
2.2 遗传毒性实验结果
2.2.1 体外哺乳类细胞（V79/HGPRT）基因突变实验结果
表2 家蚕茧壳水解粉对体外哺乳类细胞（V79/HGPRT）基因突变的影响
Table 2 Effect of silkworm cocoon hydrolysate powder on V79/HGPRT gene mutation in vitro
注：*. 与阴性对照组比较差异显著（P＜0.05）；Δ. 与阳性对照组相比差异显著（P＜0.05）。表4同。
突变率/%阴性对照组活化79.2033.79±5.65未活化72.2056.93±8.48阳性对照组活化2.53×10 —363.201828.48±9.02*未活化1.0072.1086119.28±21.60*高剂量组活化5.0063.4046.31±8.64 Δ未活化5.0070.0068.57±9.31 Δ中剂量组活化3.0073.8056.78±4.79 Δ未活化3.0080.00810.00±7.13 Δ低剂量组活化1.2069.5045.76±7.88 Δ未活化1.2085.0033.53±5.26 Δ组别剂量/（mg/mL）形成率/%突变集落数/个集落
由表2可知，阴性对照组的基因突变率显著低于阳性对照组（P＜0.05），各受试物剂量组的基因突变率均低于阳性对照组（P＜0.05），并且各受试物剂量组的突变率均没有达到自发突变率的3 倍，同时不存在突变率随剂量递增而升高的剂量反应关系，由此可判定结果为阴性，所以家蚕茧壳水解粉对哺乳动物细胞无致突变作用。
2.2.2 小鼠骨髓细胞染色体畸变实验
表3 家蚕茧壳水解粉对小鼠骨髓细胞染色体畸变的影响
Table 3 Effect of silkworm cocoon hydrolysate powder on bone marrow cell chromosome aberration in mice
注：**.与阴性对照组比较差异极显著（P＜0.01）。表4同。
组别剂量/（g/kg）畸变细胞数/个畸变率/%阴性对照组70.58±1.38阳性对照组0.0428423.67±21.63**高剂量组11.5000.00±0.00中剂量组2.8800.00±0.00低剂量组1.4400.00±0.00
由表3可知，各个剂量组的染色体畸变率均小于阴性对照组，但无显著性差异（P＞0.05），阳性对照组的染色体畸变率极显著高于阴性对照组及各个剂量组（P＜0.01），由此可判定结果为阴性，所以家蚕茧壳水解粉对小鼠骨髓细胞染色体无致畸作用。
2.2.3 小鼠精子畸变实验
表4 家蚕茧壳水解粉对小鼠精子畸变的影响
Table 4 Effect of silkworm cocoon hydrolysate powder on sperm shape abnormality in mice
组别剂量/（g/kg）畸变精子数/个观察精子总数/个突变率/%阴性对照组1805 0003.60±1.82阳性对照组0.067105 26613.48±2.60**高剂量组11.60575 1901.10±1.08*中剂量组2.901165 0002.32±1.86低剂量组1.452635 2485.01±1.69
由表4可知，阳性对照组的小鼠精子畸变数极显著大于阴性对照组及各个剂量组（P＜0.01），阴性对照组与中低剂量组无显著性差异（P＞0.05），高剂量组的小鼠精子畸变数显著低于阴性对照组（P＜0.05），由此可判定结果为阴性，所以家蚕茧壳水解粉对小鼠精子无致畸变作用。
《本草纲目》中记载：蚕茧，性甘，味温，无毒。古方中多用蚕茧煮汤治疗消渴症。蚕茧在加热过程中会发生水解反应，从而产生类似酸水解的活性产物。本实验证明家蚕茧壳水解粉是安全无毒的，这也间接证明了蚕茧作为中药临床使用的安全性。
迄今为止，未见对蚕茧壳水解物的毒性研究的报道。然而对蚕茧壳的组成成分的毒性相关的研究有零星的报道，如李加斌 [14]在研究丝蛋白肽对小鼠免疫功能的影响时，对BALB/c小鼠进行了急性毒性实验的研究，结果表明丝蛋白肽属无毒物质。熊佳庆 [24]在利用丝胶蛋白制备肝脏组织工程支架材料时，选用L929小鼠成纤维细胞进行了丝胶（silk sericin，SS）/壳聚糖（chitosan，CS）/甘油磷酸钠（sodium glycerophosphate，GP）复合凝胶细胞毒性的系统评价，实验结果表明该复合凝胶无细胞毒性，而且随着该复合凝胶中丝胶的含量增大细胞的生长增强。张艳冬 [25]在利用丝素蛋白制备药物缓释复合材料时，也选用L929小鼠成纤维细胞对丝素蛋白（silk fibroin peptide，SFP）/聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）/聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）复合材料进行细胞毒性实验，研究结果表明该药物缓释复合材料无细胞毒性。以上结果均表明，家蚕茧壳的水解物是安全无毒的，这为其开发成为药品、保健品或生物材料提供了安全依据。
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Experimental Studies on Acute Toxicity and Genetic Toxicity of Silkworm Cocoon Hydrolysate Powder
L☒ Qun， NING Wenyan， WANG Zhi， WANG Yuxia， GU Xiangxiang， WU Pengkai， LIN Feng， WANG Chunmei*
(School of Chinese Materia Medica， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China)
Abstract：Purpose: To observe the acute toxicity and genetic toxicity of silkworm cocoon hydrolysate powder. Methods: Acute oral toxicity test， V79/HGPRT gene mutation test， bone marrow cell chromosome aberration test and sperm shape abnormality test in mice were performed. CTX was used as positive control. Results: The median lethal dose (LD 50) of silkworm cocoon hydrolysate powder was more than 11.50 g/kg， which indicated that it was non-toxic. In V79/HGPRT gene muta tion test， the mutation rates of the tested substances at all dose levels did not reach levels 3 times higher than the spontaneous mutation rate; meanwhile， there was no dose-effect relationship， suggesting that the results were negative. In bone marrow cell chromosome aberration test and sperm shape abnormality test， there were significant differences between the positive and negative control groups (P ＜ 0.01)， and between all dose and negative control groups (P ＞ 0.05) except that the aberration rate of the high dosage group was significantly lower than that of the negative control group (P ＜ 0.05) in sperm shape abnormality test. Conclusion: Silkworm cocoon hydrolysate powder is a substance without acute or genetic toxicity in this test.
Key words：silkworm cocoon hydrolysate powder; mouse; acute oral toxicity; genetic toxicity
中图分类号：R994.4
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2015）09-0198-04
doi：10.7506/spkx1002-6630-201509037
收稿日期：2014-07-28
作者简介：吕群（1992—），女，硕士研究生，主要从事天然产物活性研究。E-mail：775208465@qq.com
*通信作者：王春梅（1971—），女，教授，博士，主要从事天然产物活性研究。E-mail：wchunmei@126.com