β-乳球蛋白的聚合及特性研究进展

（1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌 330047；2.南昌大学中德联合研究院，江西南昌 330047；3.南昌大学食品学院，江西南昌 330047）

摘要：自然状态下，牛乳β-乳球蛋白聚合体的出现是蛋白聚合行为的结果，值得高度关注。β-乳球蛋白聚合受内部和外部双重因素的制约，二硫键是聚合的内部因素，而外部因素主要包括温度、pH值、离子强度、蛋白浓度等。随着β-乳球蛋白结构的改变，相应的特性也随之变化。其中，理化特性的变化包括热稳定性、浊度、流变特性、聚合体的形态及颗粒大小等，生物特性的变化主要涉及消化特性和免疫特性。本文对牛乳β-乳球蛋白聚合行为研究的综述将有助于β-乳球蛋白聚合体的开发利用。

β-乳球蛋白是反刍动物乳清中最主要的蛋白质，约占乳清蛋白总量的50 %。β-乳球蛋白分子质量约为18.3 kD，等电点是5.3，由162 个氨基酸组成。其中有4 个半胱氨酸形成 2 个二硫键，分别是66～160 位、106～119 位，前者位于蛋白分子表面；后者包埋于分子内部；而121 位游离的半胱氨酸则是埋藏在分子内部 [1]。在鲜牛乳中，β-乳球蛋白是由天然的单体和二聚体形式共存。蛋白质浓度不同，单体和二聚体的比例也会变化。研究发现，当蛋白质浓度高于50 mmol/L，β-乳球蛋白是以天然的二聚体形式存在 [2]。

一般情况下，β-乳球蛋白有A、B、C、D、E、H、I、J、W 9 种亚型，最主要的是亚型A（M W18.363 kD，pI 5.26）和B（M W18.276 kD，pI 5.34） [3]。A和B两种亚型仅在64 位（缬氨酸ValA-丙氨酸AlaB）和118 位（天冬氨酸AspA-甘氨酸GlyB）上有差异 [4]。其中B亚型疏水性较低，游离半胱氨酸残基的稳定性较低，易发生不可逆变性，这主要是由于B亚型上64 位丙氨酸的替换导致其性质的变化 [5]。另外，不同地区不同品种的奶牛乳中β-乳球蛋白亚型种类也有所不同。

1 1 β-乳球蛋白聚合体研究进展

目前β-乳球蛋白聚合方式可以分为两种：1）共价键聚合，即分子间主要以二硫键形式结合；2）非共价键聚合，即通过氢键、静电作用力、范德华力聚合在一起 [6]。其中前者是β-乳球蛋白聚合的主要方式。天然状态下，包埋在分子内部的121 位半胱氨酸残基性质稳定，分子间不会形成二硫键。但是当β-乳球蛋白变性，内部结构改变，自由巯基暴露在蛋白质表面发生氧化 [7]，就有利于分子间二硫键的形成或分子内二硫键的交换，形成二聚体、三聚体等低聚体或高聚物。而后者通常伴随前者同时发生，或当巯基活性较低时，β-乳球蛋白则以静电斥力等非共价键形成聚合物 [6]。

目前，诱导β-乳球蛋白聚合的因素分为内部因素和外部因素。内部因素主要是β-乳球蛋白中游离的半胱氨酸、疏水性氨基酸和带电荷的氨基酸等。外部因素主要有温度、pH值、离子强度、蛋白质浓度等。在β-乳球蛋白内部结构的基础上，外部因素诱导蛋白质变性，肽链伸展，发生去折叠，使原来包裹在分子内部的自由巯基、二硫键以及疏水性功能基团等暴露，导致相邻的分子通过二硫键、氢键、疏水作用、范德华力以及静电斥力等使β-乳球蛋白聚集。

在中性pH值条件下，温度是影响β-乳球蛋白聚合的一个主要因素。根据目前研究进展，温度诱导β-乳球蛋白聚合的模式是：室温条件下，溶液状态的β-乳球蛋白是以天然单体和二聚体存在 [8]；温度升高至4 0～55 ℃，β-乳球蛋白三级结构发生细微的变化，形成“R-态”，有微弱的聚合趋势 [9]；当温度达到60～70 ℃时，β-乳球蛋白结构发生可逆的展开，三级结构的非共价键发生变化，蛋白经过Tanford过渡，变成“熔融态”，此时，β-乳球蛋白可通过暴露的自由巯基发生分子间聚合 [10]；80～90 ℃时，“熔融态”的形成停止；当温度超过130～140 ℃，β-乳球蛋白发生不可逆的变性，二级结构改变，此时β-乳球蛋白极易发生聚合 [11]。

A y m a r d等 [1 2]研究表明，当温度逐渐升高（5～76 ℃）时，β-乳球蛋白天然的单体和二聚体之间的平衡改变，β-乳球蛋白分子间聚合速率逐渐增大。Iametti等 [13]也得出相似的结果，当温度在70～80 ℃时，疏水性基团和自由巯基暴露，β-乳球蛋白单体与非天然二聚体的转化极其活跃；当温度继续升高至95 ℃时，其聚合速率呈指数增加，最终达到稳定状态，而且此时天然蛋白单体基本消失。Creamer等 [14]研究发现当温度在85 ℃时，天然β-乳球蛋白二聚体的二硫键断裂，解离成两种非天然的单体，导致121位半胱氨酸和119位半胱氨酸分别暴露在两个单体的表面。随着研究的深入，Etri等 [15]证明，暴露121位半胱氨酸的单体易通过分子间二硫键再形成新的聚合物。而且也发现通过对β-乳球蛋白热处理后，一些氨基酸残基活性增强，疏水性区域暴露，聚合物通过共价键和非共价键同时形成。另外，Stanciuc等 [16]也得出β-乳球蛋白经热处理后，荧光强度增强，推测可能是包埋在内部的19、61位色氨酸暴露导致。

实际上，根据目前对温度诱导β-乳球蛋白聚合的研究，其影响机理主要符合上述聚合模式。随着温度的改变，β-乳球蛋白内部结构变化，从而使特定氨基酸暴露或隐藏，最终诱导蛋白发生聚合。因此，作为β-乳球蛋白聚合的影响因素之一，温度的诱导机理的探明为β-乳球蛋白聚合体的开发提供科学的理论依据。

pH值对β-乳球蛋白聚合的影响很早就有报道，在不同的pH值的条件下，β-乳球蛋白聚合体的种类不同，包括二聚体、三聚体等低聚体和高聚物 [17]。如Sawyer等 [18]得出，当pH值为2.0、3.0时，β-乳球蛋白主要以单体形式存在。Fennema等 [19]也发现当pH值低于3.5时，二聚体解离成单体；pH值在3.5～5.2之间，二聚体四聚化形成八聚体；而pH值在5.2～7.5之间时，以天然的单体和二聚体共同存在，且pH值的变化对其聚合影响不明显；而pH值高于7.5时，二聚体又解离形成构象变化的膨胀单体。当然，也有一些不同报道，如Mehalebi等 [20]指出当pH值在5.8～9.0时，主要存在非天然的单体和低聚体，且当β-乳球蛋白的质量浓度在1～10 g/L 时，pH值的变化对聚合物的存在状态影响不明显。此外，Yan等 [21]对β-乳球蛋白的聚合机理进一步研究发现，在等电点pI 5.3附近，β-乳球蛋白聚合有两个阶段：第一阶段是先形成小的低聚体即核心，第二阶段是核心开始慢慢延伸扩大形成高聚物。

目前pH值对β-乳球蛋白聚合的影响机理尚不完全清晰，没有详实的理论与实验支持，仍值得深入探索。

盐离子浓度对β-乳球蛋白聚合的影响主要是通过改变溶液中蛋白质的电荷分布，使β-乳球蛋白以非共价键的方式形成，而且形成的聚合物多以低聚体为主。如，Aymard等 [12]研究盐离子浓度对β-乳球蛋白的聚合的影响时发现，随着盐离子浓度的增加，β-乳球蛋白中单体和二聚体平衡被破坏，二聚体含量逐渐增加。他推测由于盐离子的加入，使蛋白分子所带的电荷重新分布。同时，Muhammad等 [22]研究得出，NaCl可以催化变性的β-乳球蛋白单体进行非共价键聚合，他指出可能由于高浓度的盐离子修饰蛋白的精细结构，改变蛋白表面特性，从而促进蛋白的聚合。另外，O’Kennedy等 [23]在研究金属离子对β-乳球蛋白的影响时也发现，NaCl能催化Ca 2+诱导β-乳球蛋白的聚合。

由于在β-乳球蛋白的提取、加工及应用领域中，蛋白缓冲体系大多离不开盐离子的参与，故解析盐离子对其聚合过程把握非常关键。很遗憾，盐离子对β-乳球蛋白影响过程还未十分明了，相关研究较少。因此，仍需加大对此因素的深入探究。

表1 牛乳中主要矿物质元素含量 [24]
Table 1 Concentrations of mineral elements in milk [[2244]]

金属离子KNaCaMgZnFeCu质量浓度/（mg/L）1 094.677328.164268.27672.4355.942.0340.383

新鲜牛乳中，矿物质含量极其丰富（表1）。金属离子对牛乳中β-乳球蛋白聚合的影响越来越多，尤其是对于Ca 2＋的研究最多。如，Phan-Xuan等 [25]提出，Ca 2＋诱导β-乳球蛋白聚合有3 种机理：1）二价阳离子与邻近的带负电的基团或羧基结合形成“蛋白-Ca-蛋白”聚合体 [ 26]；2）金属离子的加入，降低蛋白分子间的静电斥力，促进其聚合；3）金属离子诱导蛋白分子结构的改变，分子间的疏水相互作用随之改变，诱导分子间聚合 [27]。而Roefs等 [28]研究则表明，Ca 2＋主要是中和蛋白的负电荷，减少蛋白分子间的静电相互作用，多余的Ca 2＋却会对蛋白的聚合有抑制作用。此外，Mudgal等 [29]发现，Ca 2＋在pH 3.5时，能促进β-乳球蛋白的聚合，而且形成聚合体的分子质量大多在10 6D以上。对于其他金属离子对β-乳球蛋白聚合的影响也有报道。如Giovanna等 [30]探讨了Cu 2＋和Zn 2＋对β-乳球蛋白A亚型聚合的影响，该研究结果表明：中性条件下，Zn 2＋能在较低的温度、较短时间形成较大聚合体；而Cu 2＋则需要较长的时间，且通过强的氢键形成网状结构。随着Stirpe等 [31]和Navarra等 [32]的深入研究，发现Zn 2＋是通过改变β-乳球蛋白内部结构，导致聚合；而Cu 2＋则是降低了蛋白的热稳定性，更易发生变性形成聚合物。

迄今为止，金属离子对牛乳中β-乳球蛋白聚合的影响主要集中于二价金属离子，而对牛乳中其他的金属离子的研究相对较少，这是一个值得高度关注的问题。

蛋白质浓度对β-乳球蛋白的影响主要呈现聚合和凝胶两种现象。据报道，β-乳球蛋白聚合的第一步必须满足溶液中约有100 个单体 [33]。而β-乳球蛋白形成凝胶的临界质量分数是6.9%，即超过了此临界值，聚合体含量明显降低，开始形成凝胶状态 [34]。Christel [3 5]和Dominique [36]等研究发现β-乳球蛋白的浓度越低聚合速率越慢，但是β-乳球蛋白的浓度高于蛋白的胶化临界值时，整个溶液开始迅速地胶化。Mehalebi等 [20]则在2008年报道当浓度小于蛋白胶化临界值时，随着β-乳球蛋白浓度增加，形成聚合体的分子质量增大，直到95%的β-乳球蛋白单体形成聚合体，才达到稳定状态。Mudgal等 [37]也指出随着β-乳球蛋白浓度增加，分子质量小于10 5D的聚合体含量逐渐减少，而分子质量大于10 6D的聚合体含量逐渐增加。当蛋白质量分数达到8%，超过临界值时，聚合体含量降低，开始出现凝胶。由此可知，准确把握蛋白聚合的临界值是研究蛋白质浓度对β-乳球蛋白聚合影响的关键。

根据目前对β-乳球蛋白聚合的研究，其影响因素除以上叙述外，还有一些伴随物的影响。如Isabelle等 [38]研究发现β-乳球蛋白在pH 7.0，0.1 mol/L NaCl条件下，加入κ-卡拉胶可以加速低聚体聚合为大颗粒高聚物。Philippe等 [39]也指出，κ-卡拉胶会影响β-乳球蛋白的聚合；当κ-卡拉胶质量浓度为1 g/L时，能有效地加速蛋白聚合，并且聚合体较稳定；而高浓度的κ-卡拉胶的会导致聚合体从溶液中析出。另外，Wijayanti等 [40]研究得出二氢硫辛酸能影响β-乳球蛋白聚合的方式，导致非共价键聚合比共价键聚合的产物多，作者推测由于二氢硫辛酸抑制单体的巯基活性，阻碍二硫键的形成。近几年，蛋白肽段对β-乳球蛋白聚合的研究也逐渐增多。如Kosters等 [41]研究发现，谷氨酸特定酶的水解产物与β-乳球蛋白的结合，导致其热变性温度降低，而对其二级结构无影响。之后，Kosters等 [42]又对β-乳球蛋白自身酶解后的肽段进行研究，发现含有游离巯基的肽段更易与β-乳球蛋白结合形成聚合物。很明显，这些伴随物属于食品添加剂、辅酶类以及有特定功能的蛋白肽段等，其常用在具有功能特性的产品的开发中。因此，研究伴随物对β-乳球蛋白聚合的影响，有利于未来β-乳球蛋白聚合物的开发利用。

2 2 β-乳球蛋白聚合体的特性

随着β-乳球蛋白聚合机理的深入研究，目前对聚合体的特性变化的研究也取得一些进展，如各种理化性质、生物特性等。众所周知，性质决定用途，β-乳球蛋白作为牛乳中重要的蛋白之一，研究其聚合物的性质变化无疑有助于β-乳球蛋白的开发与利用。

目前对β-乳球蛋白聚合体理化特性的研究主要包括热稳定性、浊度、流变特性等。如Sardar等 [43]研究聚合体的稳定性时发现，低聚体不能稳定存在，易形成高聚物，但是在柠檬酸盐纳米金粒子的存在下，β-乳球蛋白单体和二聚体可以稳定存在，但高聚物的形成受到抑制。Mehalebi等 [20]发现聚合物的浊度随着温度（30～80 ℃）的升高先升高后下降，推测原因是大颗粒的聚合物初形成时，浊度升高，当聚合物沉淀后，浊度也开始降低。此外，对β-乳球蛋白形成高聚物的流变特性也有报道。如Bolisetty等 [44]得出，盐离子对β-乳球蛋白的相转变有很明显的影响，即增加盐离子的浓度，会加速β-乳球蛋白高聚物晶体转化为胶体。另外，Santipanichwong等 [45]在研究β-乳球蛋白的聚合时发现，果胶还可以增强聚合体的耐盐特性。

此外，对有关β-乳球蛋白聚合物的形态及颗粒直径的研究也有不少报道。如β-乳球蛋白形成的聚合物的形态有两种，一种是紧密的球状结构，另一种是线性结构。前者是通过疏水相互作用形成，且有很好的持水能力，而后者则通过二硫键形成，聚合物颗粒直径则比较小 [46-48]。另外，Croguennec等 [49]研究发现在pH 6.7时，β-乳球蛋白只形成直径小的聚合体；而pH 4.0时，则形成粒径大于5 μm的聚合物。

很明显，β-乳球蛋白由于受到不同因素的影响，其形成的聚合物的理化特性也明显不同。同时，所形成的聚合物的各种理化特性的变化极其复杂。因此，这对聚合物的利用将是一个难题，必须要针对性地采取相应的方法和手段，以此来避免在工业生产上出现不利的特性变化。

对β-乳球蛋白生物学特性的研究主要有β-乳球蛋白聚合体的消化特性和免疫特性。如Peram等 [50]研究了热诱导β-乳球蛋白聚合物消化的情况，结果发现对β-乳球蛋白90 ℃加热5 min后得到的产物经人工胃液消化120 min后，部分聚合体不被消化；而经过90 ℃加热120 min后，形成的聚合物则几乎完全被人工胃液消化。他们推测高聚物易被消化，而形成高聚物的中间产物则具有较强的耐消化特性。另外，由于β-乳球蛋白是牛乳中主要的过敏原之一，故对β-乳球蛋白聚合体的免疫特性也有很多报道。如Hattori等 [51]就发现β-乳球蛋白与壳聚糖偶联后，β-乳球蛋白聚合被抑制，且抗原性降低，推测其过敏原表位因偶联后被修饰。Kleber等 [52]研究得到β-乳球蛋白经热处理后，发生变性聚集的同时，其表位被掩盖，导致β-乳球蛋白的致敏性降低。Downs等 [53]也发现热加工的β-乳球蛋白聚合物的抗原特性偏低，分析是聚合导致β-乳球蛋白的抗原表位隐藏。实际上，过敏原的表位是致敏性的物质基础。无论何种加工处理，只要是改变了过敏原的结构，都会影响其致敏性。由此可见，欲通过 β-乳球蛋白聚合改变致敏性，其研究靶标一定是其致敏性表位。

3 结语

近年来，蛋白质聚合现象的研究越来越受到关注。β-乳球蛋白作为一个常用的模式蛋白，同时作为牛乳中一个重要的蛋白成分，它的聚合行为引起了广泛关注。尽管对牛乳β-乳球蛋白的聚合行为已经开展了一些卓有成效的研究，但对各种诱导聚合的机制仍然缺乏统一的认识。另外，食物蛋白质具有非常重要的加工性能和营养功能，已有的研究已表明蛋白的聚合影响到它的结构，并影响其功能。但有关牛乳β-乳球蛋白聚合后结构变化的研究还不系统，也不全面，相关的结构与功能关系研究比较欠缺。显而易见，继续开展牛乳β-乳球蛋白的聚合行为的基础研究并探索其结构与功能的关系，具有重要的学术价值。

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XIE Xiuling 1，2，3， LI Xin 1，3， CHEN Hongbing 1，2，*
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology， Nanchang University， Nanchang 330047， China; 2. Sino-German Joint Research Institute， Nanchang University， Nanchang 330047， China; 3. School of Food Science and Technology， Nanchang University， Nanchang 330047， China)

Abstract：Beta-lactoglobulin is one of the important proteins in cow milk. More and more researchers focused on its aggregation in recent years. The factors affecting aggregation of β-lactoglobulin include internal and external factors. The disulfide bonds are the internal factor s. However， there are many external factors， s uch as temperature， pH， ion strength， and protein concentration. The physicochemical and biological properties of β-lactoglobulin could be changed by ch anging its conformation. The thermal st ability， turbidity， rheological properties， polymer morphology and particle size， digestion and immune prope rties are summarized in this paper. Meanwhile， we review recent studies on the aggregation of β-lactoglobulin. Hopefully this r eview will provide meaningful information for the development and utilization of β-lactoglobulin polymers.

基金项目：国家自然科学基金地区科学基金项目（ 31260204）；国家自然科学基金青年科学基金项目（31301522）；国家高技术研究发展计划（863计划）项目（2013AA102205）；江西省自然科学基金项目（2012BAB204002）

作者简介：谢秀玲（1988—），女，硕士研究生，研究方向为食品科学。E-mail：xiexiuling0824@126.com

*通信作者：陈红兵（1967—），男，教授，博士，研究方向为食品营养与安全。E-mail：chbgjy@hotmail.com

β-乳球蛋白的聚合及特性研究进展

1 1 β-乳球蛋白聚合体研究进展

2 2 β-乳球蛋白聚合体的特性

3 结 语

3 结语