吕冬梅，黄 原 *，文 慧，赵晓铃，黄 冲
（陕西师范大学生命科学学院，陕西 西安 710062）
摘 要：近年来，国内外不断出现有关食品掺假造假等食品安全问题的报道。产品与标签不符，肉类掺假，以次充好等商业欺诈问题影响着人们的利益与健康。食品掺假造假问题越来越受到重视，而传统的检测方法已不能满足食品鉴定的需要。DNA条形码技术是从分子水平上对食品进行鉴定，弥补了传统鉴定方法的不足，其准确、高效、简单的特点为食品鉴定领域带来了新的革命。本文在简要介绍DNA条形码研究现状的基础上，主要总结目前国内外关于DNA条形码技术在食品鉴定中的应用情况，包括在渔类产品、肉类产品、可食用植物、加工食品鉴定中的应用，最后讨论DNA条形码技术在食品鉴定中的优缺点以及发展趋势。
关键词：食品鉴定；DNA条形码；复合条形码；微型条形码
近年来关于食品造假的新闻层出不穷，如2013年，席卷欧洲的“马肉风波”；在国内早就有经化学药物处理的“假鱼翅”、以牛肉膏处理的猪肉和鸭肉冒充“假牛肉”以及鱼肉制品的标签存在标识错误等不法事件的报道。这样的行为不仅损害了消费者的利益，而且也造成了不正当的商业竞争。
食品掺假造假的准确判定和标签制度的有效实施，必须建立在行之有效的食品物种鉴定方法之上。对加工食品而言，物种的原始特征消失，这使得物种鉴别变得相对困难，因此迫切需要一些灵敏和可靠的检测方法来鉴定加工食品的物种来源。
传统上食品来源物种主要依靠生物的表型及解剖特征等进行鉴定。然而，由于许多生物在不同的发育时期形态特征各异且形态特征易受环境影响，同一类群的生物可能会因为生境条件的差异或反应和适应能力的不同而呈现显著的形态学特征差异，影响正确的分类鉴定，且该方法鉴定周期长，还需要研究人员具有较高的专业知识，因此传统分类学在现在的物种鉴定中受到很大的限制。
随着科学的发展，食品鉴定已从传统形态学方法发展到分子生物学方法。目前广泛应用的分子生物学方法主要分为两类：一类是蛋白质鉴定方法，该法主要采用电泳分析、酶联免疫吸附、高效液相色谱等技术，这些技术通常适用于新鲜或冰冻组织，对于蛋白质的生化特性和结构完整性都被破坏的加工食品不适用；第二类是DNA鉴定方法，用于食品物种鉴定的DNA技术主要是DNA芯片技术、DNA指纹图谱技术等，能够实现对新鲜、冰冻、腌制或罐装食品物种进行鉴定。然而不同的技术在食品鉴定中存在不同的缺陷：DNA芯片技术不能准确的进行定量分析；指纹图谱技术程序复杂，成本较高，鉴定结果精确性低，定量分析问题尚待解决等 [1-2]。
DNA条形码是当今可用于物种分类、食品鉴定等多种领域的一门新兴技术，它利用短的DNA序列对物种进行鉴定。这种DNA序列还具有标准、有足够变异、易扩增、片段自身在物种种内具有特异性和种间的多样性等特点。DNA条形码就是利用这些特点创建的一种新的身份识别系统，它可以对物种进行快速的自动鉴定 [3]。DNA条形码由加拿大动物学家Hebert等首次提出，其思想产生于现代商品零售业的条形码系统Universal Product Code（UPC），就像以超市条形码识别产品一样，利用A、T、C、G这4 个碱基在基因中的排列顺序识别物种。简单来说，即通过对不同生物个体上的短的同源DNA序列（COⅠ基因）进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增和测序，再经序列的多重比对和分析建立起物种名称和生物实体之间一一对应的关系。
自Hebert等 [3-4]提出使用线粒体基因细胞色素C氧化酶（COⅠ）基因片段（一段长约650 bp的DNA序列）作为动物的DNA条形码后，DNA条形码技术在动物、植物、微生物的分类与鉴定中获得迅速发展 [5]。动物主要以COⅠ基因作为条形码片段 [6-7]，目前主要运用于鸟类 [8-11]、鱼类 [12]、昆虫 [13]的分类鉴定。在植物方面，2009年国际生命条形码联盟植物工作组（Consortium for the Barcode of Life Plant Working Group）初步确定并推荐使用的DNA条形码片段是叶绿体基因片段的rbcL和matK [14]。目前，微生物DNA条形码研究工作主要集中在真菌类群上 [15]，首要选择作为真菌DNA条形码的是核糖体DNA内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS） [16]。
本文对国内外DNA条形码技术在食品鉴定中的研究现状进行具体介绍。
DNA条形码技术为渔类产品的分类鉴定开辟了新道路。截止到2014年3月30日，FISH-BOL数据库（www. fishbol.org）已收录了10 267 种鱼类的75 249 条DNA条形码，这使得绝大多数常见的鱼类可以用DNA条形码技术进行鉴定。
在国外，Wong等 [17]利用DNA条形码技术对北美市场上的91个海产品样品进行分析，推断出可能有25%的海产品的标签与实物不符，认为DNA条形码技术是一种经济的、有效的、可将海产品鉴定到种的分子鉴别技术。Maralita等 [18]利用DNA条形码技术对菲律宾市场上的有标签的渔类产品（沙丁鱼、海鲂、罗非鱼、旗鱼、虾）进行鉴定，发现金枪鱼与标签不符合，还发现一种标签为银鳕鱼排（gindara steaks）的鱼类产品里含有一种有害人类身体健康的鱼类，强调了DNA条形码技术是一种能够对市场上鱼类产品进行有效地检测与鉴定的方法。Haye等 [19]利用DNA条形码技术对智利市场上7 种螃蟹制品进行鉴别发现一种螃蟹制品与其商品标签不符，表明标准的DNA条形码与系统发育分析一样可用于规范蟹肉加工产品。DNA条形码技术还应用于南非 [20]、意大利 [21]的海产品市场，成功地检测与鉴定了市场上与商标不符合和假冒的海产品。除了在海产品鉴别中的应用外DNA条形码技术也能够有效地对淡水鱼尤其是小规模种群关系复杂的鱼群进行分类鉴定 [22]。
在我国李新光等 [23]对市场上20 种冷冻鱼、10 种冻鳕鱼片和15 种烤鱼片样品进行鉴定，结果表明DNA条形码技术是一种简单的、有效的分子鉴别技术，可用于冷冻鱼、冻鱼片和烤鱼片中鱼肉成分的鉴定。邱德义等 [24]抽检的16 份鱼肉、鱼丸等水产制品运用DNA条形码技术进行鉴定结果显示约有31.25%的样品与产品标签标示不符，其结果表明DNA条形码作为一种简单、快速、有效的分子鉴定技术可以直接应用于鱼肉等动物源性食品的种类鉴定。有研究运用DNA条形码技术鉴定了鳢的19 个种，比较它们之间的种内差异和种间差异，证明了部分COⅠ基因能够作为鳢种（Channa species）的 DNA条形码 [25]。上述研究表明了DNA条形码技术对渔类及渔类制品的检测与鉴定上具有可行性。
国内外的大量研究表明DNA条形码技术在对鱼、螃蟹、虾等渔类产品的检测与鉴别中的应用是比较成熟的。相较于其他物种（猪、牛、羊、马）来说，鱼类本身物种种类颇为丰富，且具有巨大的DNA条形码数据库作为支撑，为DNA条形码技术的应用提供了数据基础；其次相较于传统的检测方法，DNA条形码技术从分子水平对水产品进行检测，检测范围更加广泛，鉴定结果更加精确；此外，鱼类的种类远远多于其他生物，分子水平更有利于对地方物种进行鉴定，确定产品的来源地。DNA条形码技术用于检测市场上标签与实物不符及掺假的渔类产品，这对于水产品市场的规范是一次革新。
市场上的所出售的肉类产品主要是家禽和家畜，消费者在购买肉类产品时仅依靠销售标签以及肉类的外观形态、气味已无法对其真实成分进行准确鉴定。因此，一种较为可靠有效的食品鉴定系统的出现与应用，对于解决肉类掺假等食品问题维护消费者与生产者的利益是十分必要。在家禽的研究上，线粒体COⅠ已被证明对鉴定不同鸡品种具有有效性和可行性 [26-27]，能够对不同地方鸡种的进行分类 [28]。其中高玉时等 [29]以我国6 个地方鸡品种为研究对象，测定了COⅠ基因的两段序列，研究发现线粒体COⅠ基因中的Bar1序列（Bar1：712～1 359 位）更适合作为条形码鉴定地方鸡品种。徐向明 [30]测定3 个地方品种鸭的线粒体COⅠ基因，表明其种间的多态性高于种内多态性，利用COⅠ基因序列可以进行品种鉴定。COⅠ基因作为DNA条形码对家禽类产品进行鉴定被证明是具有可行性的，但还缺乏实际应用。
国内对如猪、牛、马、兔等饲养最广泛的家畜DNA条形码的研究依然处于空缺状态。主要是应用DNA序列（如线粒体D-loop区和线粒体基因）研究家畜的群体遗传多样性和系统进化关系，探讨其遗传资源保护策略，而能否应用这些片段作为家畜种群鉴定和系统发育分析的DNA条形码还有待更深入的研究与探讨 [31]。Cai Yansen等 [32]利用COⅠ对18 种牛进行研究，结果验证了COⅠ基因作为鉴别牛科动物DNA条形码的有效性。此外，欧阳解秀等 [31]讨论了DNA条形码技术在地方猪种质资源保护中应用及其可行性。Luo Arong等 [33]对真哺乳动物亚纲1 179 条线粒体基因组序列中各蛋白质编码基因评估其作为DNA条形码的效力，结果表明COⅠ基因5’端是真哺乳动物亚纲的物种识别研究中首选的DNA条形码。
COⅠ基因作为公认的DNA条形码被认为能够很好地对动物进行分类鉴定。然而，DNA条形码技术在肉类产品的鉴定中存在很大的局限与缺陷。首先，数据库中关于家禽家畜的DNA条形码序列很少，缺乏大量数据作为支撑；对于某些类群各线粒体基因片断依然存在种内与种间变异相重叠的问题，这些线粒体基因片断对种以上较高级分类阶元水平的解决能力有限 [34]。其次，DNA条形码技术只能对单一的物种成分进行鉴别。市场上许多肉类产品都掺杂了两种或两种以上肉类成分，应用DNA条形码技术难以进行鉴定。此外，现今市场上所销售的家畜和家禽大都来自于专业养殖场动物经过了大量的杂交育种筛选，发生基因渗入现象，使得一些不同物种和品种间具有相同的DNA，DNA条形码技术在该类产品的鉴别上受到限制。
虽然DNA条形码技术在禽畜肉类鉴定中存在局限性，但其作为一种可靠、有效的禽畜肉类鉴定方法依然具有广阔的应用前景。目前急需要进行的工作包括：首先构建主要禽畜类动物的标准DNA条形码数据库，为DNA条形码技术的应用提供数据基础；寻找有较强特异性和通用性的基因片段作为标准DNA条形码；对于一些含有多个物种基因的混合产品或者是基因杂交的种类，可以采用基于新一代测序技术的复合条形码（metabarcoding）技术。
随着经济的全球化各国之间贸易的发展，市场上的植物产品种类越来越多，来源越来越广泛。PCR技术和多重DNA微阵列或芯片技术等分子水平的鉴定方法，在种间鉴定中受到了限制。此外，转基因技术的发展使市场上出现了大量的转基因农作物产品，因此需要发展一种可靠通用的分子技术对可食用植物产品从基因水平进行检测与鉴定 [35]。DNA条形码技术对鉴定者的专业知识背景要求不高，不受植物发育时期和形态特征的限制，且只需要通过一个或少数几个通用标记就能对植物的进行鉴定 [36]。另外DNA条形码标记是基于线粒体基因或质体基因的一段较短的基因片段，其在进化过程中具有较高保守性，且更有利于扩增。因此，在植物的鉴定中，DNA条形码因为其更快速、高效、精确和经济的特点逐步取代了传统分类学以及DNA指纹图谱技术 [37]。目前植物DNA条形码技术的研究已经从分析不同标记的性能转向更多的实际应用。
国外DNA条形码技术在可食用植物的鉴定中已有初步的研究应用。de Mattia等 [38]对市场作为香料的唇形科植物6 个属（包括：Mentha、Ocimum、Origanum、Salvia、Thymus和Rosmarinus）共64 个样本，利用rpoB、rbcL、matK和trnH-psbA基因间隔序列等4 个基因片段作为DNA条形码对其进行分类鉴定。Bruni等 [39]应用DNA条形码技术对3 个集合植物样本进行鉴别：含有不同有毒物质的被子植物、同一个属中含有不同程度毒性的物种、同一个属中的可食用植物和有毒植物，结果表明DNA条形码技术是一种强有力的有毒植物鉴别工具。此外，Jaakola等 [40]结合DNA条形码技术和高分辨率溶解（highresolution melt，HRM）分析技术，成功地对来自不同野生浆果品种且在市场上易混淆的欧洲越橘（Vaccinium myrtillus L.）样本进行鉴定，最后提出了DNA条形码技术与HRM分析技术结合不仅能够很好地应用于市场上的野生浆果的分类鉴定，随着进一步的优化，该项技术还能够作为一种快速有效的高通量方法用于辨别其他食物原料的真伪。
在我国DNA条形码技术主要是用于植物的分类与鉴定，尤其是药用植物资源的鉴定。已有相关研究应用DNA条形码对威灵仙的基原植物 [41]、党参 [42]、石斛兰属植物的6 个物种 [43]；人参 [44]、羌活药材 [45]、药用蕨类植物的多个物种 [46]，以及豆科 [47]、菊科 [48]、忍冬科 [49]、五茄科 [50]等多种药用植物的基原成功进行鉴定。DNA条形码技术在药用植物的鉴定中得到较多的应用，但对于日常可食用的植物中还需要进一步进行研究与利用。
目前DNA条形码技术在植物鉴定中的应用已经被证明是可行的，但也还存在一些问题。缺乏一段能够对所有植物物种进行鉴定的DNA条形码；而且单一片段植物DNA条形码具有局限性，制约了植物DNA条形码技术的发展。为克服这个限制，Kress等 [51]提出了条形码片段组合的理念，即通过不同的DNA片段的组合，对植物进行分类鉴定。此外，Kane等 [52]提出了超级条形码（ultrabarcoding）方法，这种方法以质体基因组（plastidial genome）为基础，伴随着大部分核基因的参与。这样可以克服栽培品种遗传变异少，品种杂交过程的复杂性对采用通用条形码标记的限制。
通过DNA条形码技术在植物分类鉴定中的应用与研究，可看到其在可食用的植物食品鉴定中具有巨大潜力。市场上最主要的可食用植物是农作物产品包括谷类、蔬菜、水果、香料等，而一些普通的农作物一般不会存在掺假问题，主要针对经济价值较高、较难区分的可食用植物，或者是一些易混于可食用植物中的有毒植物进行鉴定。应用DNA条形码的目的是在通过形态学无法进行鉴定的基础上，鉴定未知物种，区分近似种，而并不是用于区分所有的可食用植物种类。因此，从这个角度来看，目前筛选出的DNA条形码已能够基本满足可食用植物鉴定的要求。
加工食品主要是指在食品工业链上对动物及其副产品、蔬菜、谷物、水果等可食用生物部分或整体用物理或化学方法进行加工，制做成的罐头、零食等。加工食品在制作过程中对原材料进行高温灭菌、煎、炸等处理，还加入一些食品添加剂以及食品防腐剂等。这不仅导致其形态、口感、味道等方面发生改变，还破坏了DNA的结构。Aslan等 [53]研究表明，经过加工的肉类核基因已经大量降解，线粒体基因相对而言保存地更为完整。Smith等 [54]从熏鱼产品中获得完整线粒体COⅠ片段并成功对熏鱼产品进行鉴别，表明了在鱼类及其产品的分类鉴定中，DNA条码技术有望成为一个标准的鉴别工具。
在国外，DNA条形码标记成功地应用于加工食品中某些植物成分的检测。主要是选用植物最普遍的DNA条形码——质体rbcL基因，运用PCR技术成功鉴定了市场上所出售的商品茶 [55]，检测许多加工食品中所含有的水果种类 [56-57]。此外还能够运用该种方法对牛奶中所含的植物进行鉴定从而获得奶牛的食物种类，以此来检测哺乳动物奶制品的质量 [58]。
上述研究表明动物DNA条形码COⅠ基因和植物DNA条形码rbcL基因片段能够很好地应用于部分加工食品的鉴定。对于含有几种混合物质的产品使用限制性片段长度多态性或者电泳分析等PCR技术能够对混合物中各物种的DNA条形码片段进行分离 [59-61]。对于含有多种混合物的产品，454焦磷酸测序法（454 pyrosequencing methodology）能够有效地对其原材料的DNA条形码片段进行分析 [62-63]。此外，Rasmussen等 [64]提出使用更短的片段——微型条形码（mini-barcodes）能够对加工食品进行鉴定。微型条形码是指长度明显小于COⅠ标准条形码（650 bp）的一段序列，这个概念是针对博物馆标本的研究而提出的 [63]。微型条形码的出现不仅在一定程度上弥补了焦磷酸测序技术的缺陷，还能够有效地对经深加工DNA已大量降解的食品进行鉴定 [63]。此外较于标准DNA条形码序列微型条形码更为经济。在我国，程鹏等 [65]研究表明适当的DNA微型条码可用于鱼类的鉴定。与海产品的鉴定一样，微型条形码也能够为其他物种的分类鉴定提供足够的信息 [66-67]。然而，相较于完整的COⅠ基因微型条形码基因片段明显减少，这对于区分近缘物种和基因相似度较高的物种来说还有争议。
DNA条形码技术在加工食品鉴定中的应用其实质是对该技术在动植物分类鉴定研究的进一步扩展和应用。DNA条形码片段能够有效地对加工食品或者加工食品中的某些成分进行分类鉴定。复合条形码技术、微型条形码的出现在一定程度上解决了加工食品DNA片段降解、混合有多个物种的问题，为DNA条形码技术在加工食品鉴定中的广泛应用奠定了理论和技术基础。同时也反映了要针对不同的鉴定内容和目的不断地对DNA条形码技术进行改进，使其能够更有效地应用不同食品的鉴定。总之，DNA条形码技术快速、高效、经济等特点为相关部门实现对食品工业和食品市场监督管理走向高效、信息化开启了道路。
DNA条形码技术旨在对现存生物类群和未知生物材料进行识别和鉴定，为人们了解和探索生物界提供了新的方式和新的理念。DNA条形码技术有着检测范围较广，操作简单，准确度高，鉴别效率高，信息化等优点，使其在食品安全领域得到广泛应用。
目前针对各种商业欺诈对人们利益和健康以及社会安定造成的威胁，DNA条形码技术有必要作为一种标准的鉴定方法应用于食品安全领域。但是DNA条形码技术在食品鉴定中的应用还存在诸多困难与挑战：首先，国内外商家交易，消费的食品物种丰富，突变可能性大，而且很多物种具有相似基因图谱就使得鉴别异常复杂 [2]；其次，对于加工过的食品以及混合食品较难获得单一的DNA条形码片段；此外，该技术依赖参考的数据库创建不够完善存在太多不确定因素；另外，关于DNA 条形码的一些技术问题还存在很大争议 [68-70]：近缘物种共享线粒体多态性以及同属物种间的线粒体DNA修复机制，这些将给近期快速分化物种和通过杂交产生的新种的鉴定带来一定困难；而同属种间较低的差异也会使物种分类鉴定存在疑虑；除此之外，研究者们尚未探明线粒体基因在一个物种中不会有太大变化的原因，而且用作动物条形编码的线粒体基因并不会在所有动物物种中都准确地分化；同时也不能确定该方法能否适用于近缘和近期分化的物种。尽管DNA条形码技术还存在很多的问题，但是与实时荧光PCR、物种特异性PCR等技术相比较，DNA条形码技术有着无可比拟的优势。实时荧光PCR技术具有高准确性、低假阳性，特异性好，灵敏度、精确性以及自动化程度高，并且能缩短反应时间，快速测定产物大小等优点，但是荧光标记材料有限，数据分析软件不完善。而物种特异性PCR除具有高灵敏度和精确性外，还具有简单易行、耗时少、成本低等优点，但是在选取引物时需要设计合理、特异性强的引物存在较大困难，在鉴定亲缘系数较近的物种时有更大的挑战。DNA条形码的稳定性较强，而且采用数字化的形式，能够在较短时间内形成并建立易于利用的系统，从而使样本鉴定过程能够实现标准化和自动化 [68]。
DNA条形码技术的使用并不意味着脱离形态学鉴定而是在形态学的基础上进一步扩展。随着研究的深入，DNA条形码鉴别技术还可以与基因芯片技术、限制性片段长度多态性技术（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、时间温度梯度电泳（temporal temperature gradient gel electrophoresis，TTGE）等技术相结合达到对食品更准确、更快速的鉴别 [24]。在不久的将来通过对软硬件的改进以及技术的进一步完善，相信DNA条形码技术将更加广泛的应用于食品安全鉴定领域，成为食品物种来源鉴定的基本方法。
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Application of DNA Barcoding in Authentication of Food Product
L☒ Dongmei， HUANG Yuan*， WEN Hui， ZHAO Xiaoling， HUANG Chong
(College of Life Science， Shaanxi Normal University， Xi’an 710062， China)
Abstract：In recent years， there are constant reports about food adulteration problems all over the world. Inconsistent labeling of food products， adulteration of meat products， passing off inferior products as superior ones， and other commercial fraud problems affect consumer health and interests. Although the problem of food adulterations has gained more and more attention， traditional detection methods have many weaknesses for the authentication of food products. DNA barcoding is a technique for authenticating food products at the molecular level that can make up for the shortcomings of traditional identification methods. Its characteristics of accuracy， high efficiency and simplicity have brought about a new revolution in the field of food identification. This paper reviews the current situation of DNA barcoding studies and summarizes the applications of DNA barcoding to identify fishery products， meat products， edible plants， and processed foods. Finally， the strengths and weaknesses of DNA barcoding and its development trend in the future are also discussed.
Key words：food identification; DNA barcoding; meta-barcoding; mini-barcoding
中图分类号：TS207.3
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2015）09-0248-06
doi：10.7506/spkx1002-6630-201509046
收稿日期：2014-04-08
基金项目：陕西师范大学勤助科研创新基金项目（QZZD13016）
作者简介：吕冬梅（1993—），女，本科，研究方向为食品鉴定技术。E-mail：873842584@qq.com
*通信作者：黄原（1962—），男，教授，博士，研究方向为分子进化与分子系统学。E-mail：yuanh@snnu.edu.cn