响应面法优化草鱼内脏蛋白质酶解工艺

丛艳君 1,2,于晓凤 1,2,陈 澍 1,3

(1.北京工商大学食品学院,北京 100048;2.北京工商大学 北京市食品风味化学重点实验室,北京 100048;3.北京工商大学 食品添加剂与配料北京高校工程研究中心,北京 100048)

摘 要:为实现草鱼内脏蛋白质的高值化利用,本研究在单因素试验基础上应用响应面试验优化了木瓜蛋白酶水解脱脂草鱼内脏蛋白质的条件,响应面法分析得出4 个影响因素的最佳组合为加酶量33 015 U/g、酶解温度62.35 ℃、酶解时间5.37 h、酶解pH 7.9,此时水解度为44.48%,肽得率为19.68%,水解液鲜味较明显。

关键词:草鱼内脏;蛋白质;水解;响应面试验;优化

我国淡水鱼养殖业虽然发达,但是水产品加工率不到10% [1-2],在鱼加工制品的废弃物中,蛋白质、脂肪和酶类含量较高的内脏的加工尤其未得到重视 [3-5],这不仅造成了资源的浪费,而且污染环境,给环境带来巨大负担 [6]。草鱼是四大家鱼之一,草鱼内脏蛋白质中必需氨基酸的含量占总氨基酸含量的41.56%左右,除了硫氨酸的含量较低外,其他氨基酸的含量均接近或超过全蛋蛋白,尤其以赖氨酸的含量最高为7.6% [7]

利用酶水解技术加工鱼内脏和提取活性成分 [8-9],可减少资源浪费和环境污染 [10]、提高鱼内脏的质量、改善其营养价值和提升鱼内脏的加工利用率,同时满足市场对高附加值鱼类制品的需求,具有重要的经济和社会意义。国内在应用微生物发酵制备传统调味品如酱油、鱼露等方面工艺成熟 [11],而应用生物技术(主要是酶技术)深加工农产品起步晚,基础和应用基础薄弱 [12-13]。目前各种动植物原料的生物技术应用主要集中在采用各种特异性酶探索作用效果、蛋白质水解产物加工功能特性研究方面,对各种呈味肽的分离纯化以及功效研究尚处于初步阶段,市场上国产的呈味肽产品寥寥无几 [14-16]。本课题组前期研究了木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶水解草鱼内脏蛋白质的特性,发现6 种酶解液中氨基酸和多肽含量较丰富,感官评价结果表明,使用风味蛋白酶的水解液鲜味最强,其次为木瓜蛋白酶,这为实现草鱼内脏的高值化利用提供了思路 [17]。基于前期基础,本课题应用响应面试验优化木瓜蛋白酶水解脱脂草鱼内脏蛋白质的条件,以期为后续的应用研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

草鱼 北京市四道口水产品批发市场。

木瓜蛋白酶(酶活力4 982 U/g) 美国Sigma公司;乙醚、浓硫酸、盐酸、硼酸、硫酸钾、溴甲酚绿、甲基红 北京化学试剂公司;氢氧化钠 西陇化工股份有限公司;甲醛 天津市永大化学试剂公司;硫酸铜 天津市光复科技发展有限公司。实验所用试剂均为化学纯。

1.2 仪器与设备

DKB-501A超级恒温水槽 上海精宏实验设备有限公司;PHS-3D功能型pH计 上海三信仪表厂;TB214型电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司;CR22G型离心机 日本Hitachi公司;Kejeltic 2100型凯氏定氮仪 瑞士Foss公司;D2004W电动搅拌器 上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司;Spectrumlab 22pc可见分光光度计 上海棱光技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 脱脂草鱼内脏蛋白质酶解液的制备

将去除胆囊和鱼鳔的草鱼内脏清洗,绞碎,置于95 ℃水浴锅中20 min,灭内源酶活。冷却后按1∶1(g/mL)加入去离子水,在4 ℃、8 000 r/min的条件下离心10 min,去除上层液体,收集下层沉淀。重复上述操作,即得到粗脱脂草鱼内脏蛋白质,冻干备用。

1.3.2 酶解单因素试验

以脱脂草鱼内脏蛋白质为底物恒温水浴酶解,控制加酶量、酶解温度、酶解时间、酶解pH值,酶解结束时将酶解液在95 ℃水浴中灭酶15 min。

1.3.3 响应面试验

在单因素试验的基础上,根据Box-Behnken试验设计原理,结合单因素试验结果,对4 个因素加酶量(X 1)、酶解温度(X 2)、酶解时间(X 3)、酶解pH值(X 4)在-1、0、1这3 个水平上进行优化。试验因素与水平设计见表1。

表1 响应面试验因素与水平
Table1 Factors and levels used in response surface analysis

因素水平-101 X 1加酶量/(U/g)25 00030 00035 000 X 2酶解温度/℃556065 X 3酶解时间/h456 X 4酶解pH 77.58

1.3.4 水解度的测定

以甲醛电位滴定法 [18]测定氨基酸态氮含量;水解度计算如式(1)所示。

1.3.5 肽得率的测定

1.3.6 酶解液的脱色脱腥处理

酶解液在pH 4.0、温度50 ℃、粉状活性炭用量0.5%条件下水浴振荡40 min进行脱色脱腥,离心,取上清液进行感官评价。

1.3.7 感官评价

感官评价采用排序检验法测定 [19-21]。10 mmol/L谷氨酸钠作为对照样品,鲜味标准是“中”,并通过水浴加热保持对照、样品温度在40 ℃左右。评定小组包含12 名感官评价员(6 男6 女,23~50 岁),评定小组人员均受过相关培训,能够尝出标准品的鲜味,将酶解液作为品尝对象,比较待测样品与对照样品中鲜味感差别,评价其鲜味。酶解液放入口中15 s吐出,每个样品给两次,打分采用五分制,取平均值。评定前用清水漱口,评定时拒绝交流,且样品需用带中性的文字标明,避免主观评价。

表2 酶解液的感官评分标准
Table2 Criterion for taste evaluation of hydrolysate

鲜味无弱中较浓浓分数012~33~44~5

1.4 数据分析

采用Design-Expert 8.0.5软件,进行响应面试验设计及数据分析。

2 结果与分析

2.1 加酶量的确定

取冻干脱脂草鱼内脏蛋白质,按底物质量分数3%加入水,调酶解pH 7.5,分别按20 000、25 000、30 000、35 000、40 000 U/g加入木瓜蛋白酶,在60 ℃条件恒温振荡酶解6 h,95 ℃终止酶反应,常温取样测定其水解度和肽得率。

图1 加酶量对脱脂草鱼内脏蛋白质水解度和肽得率的影响
Fig.1 Effect of enzyme dosage on the DH and peptide yield of grass carp viscera

由图1可知,水解度随着加酶量的增加升高速率较为缓慢,差异不显著(P>0.05),这主要是由于随着加酶量的增加,酶已逐渐被底物所饱和,酶促反应速率趋向最大值。肽得率在加酶量为30 000 U/g达到最大值20.99%,随后有下降的趋势,原因在于酶量的增加使得酶与底物的接触更加充分,底物被进一步酶解为小分子肽和游离氨基酸,不同加酶量条件下肽得率差异显著(P<0.05)。综合考虑,30 000 U/g的加酶量水解程度和肽得率都较佳。

2.2 酶解温度的确定

取冻干脱脂草鱼内脏蛋白质,按底物质量分数3%加入水,调酶解pH 7.5,按30 000 U/g加入木瓜蛋白酶,分别在50、55、60、65、70 ℃条件下,恒温振荡酶解6 h,95 ℃终止酶反应,常温取样测定其水解度和肽得率。

图2 酶解温度对脱脂草鱼内脏蛋白质水解度和肽得率的影响
Fig.2 Effect of hydrolysis temperature on the DH and peptide yield of grass carp viscera

由图2可知,酶解温度50~60 ℃,水解度和肽得率都不断升高,但超过60 ℃之后,水解度和肽得率明显下降,不同酶解温度条件下水解度和肽得率差异均显著(P<0.05)。温度是影响酶促反应的一个重要因素,随着温度的升高会加快酶促反应,但是当温度超过了酶的最适反应温度时会降低反应的速率,木瓜蛋白酶的最适反应温度是60 ℃。

2.3 酶解时间的确定

取冻干脱脂草鱼内脏蛋白质,按底物质量分数3%加入水,调酶解pH 7.5,按30 000 U/g加入木瓜蛋白酶,分别恒温振荡酶解4、5、6、7、8 h终止酶反应,常温取样测定其水解度和肽得率。

图3 酶解时间对脱脂草鱼内脏蛋白质水解度和肽得率的影响
Fig.3 Effect of hydrolysis time on the DH and peptide yield of grass carp viscera

由图3可知,随着酶解时间的延长,水解度不断的提高,酶解5 h的效果较酶解4 h的有明显的提高,5 h之后水解度的增加比较缓慢。而肽得率在酶解5 h时达到最大值23.19%,而后有明显的下降趋势,7~8 h下降趋于平缓,不同时间水解度和肽得率差异均显著(P<0.05),因此确定最适酶解时间为5 h。

2.4 酶解pH值的确定

取冻干脱脂草鱼内脏蛋白质,按底物质量分数3%加入水,分别调酶解pH 6.5、7.0、7.5、8.0、8.5,按30 000 U/g加入木瓜蛋白酶,在60 ℃条件恒温振荡酶解6 h,95 ℃终止酶反应,常温取样测定其水解度和肽得率。

图4 酶解pH值对脱脂草鱼内脏蛋白质水解度和肽得率的影响
Fig.4 Effect of pH on the DH and peptide yield of grass carp viscera

由图4可知,当pH值小于7.5时,水解度与肽得率较低,pH 7.5时水解度和肽得率均达到最大值,分别是41.86%和20.99%,当pH值达到7.5以后水解度与肽得率不再增加,开始逐渐降低,不同pH值条件下水解度、肽得率差异均显著(P<0.05)。因此木瓜蛋白酶反应的最适pH 7.5。

2.5 响应面分析法优化草鱼内脏蛋白质的水解条件

以加酶量(X 1)、酶解温度(X 2)、酶解时间(X 3)、酶解pH值(X 4)为自变量,以水解度、肽得率为响应值,响应面试验方案及结果见表3。

表3 响应面优化试验方案及结果
Table3 Experimental design and results for response surface analysis

试验号X 1加酶量X 2酶解温度X 3酶解时间X 4酶解pH水解度/%肽得率/% 感官评分1010-145.28 14.89 1 200-1-128.71 18.34 2 3-100145.43 16.24 1 4-10-1041.54 16.69 1.5 5 0-1-1042.98 15.63 1 6-1-10044.66 16.43 1.5 7 110045.62 15.37 1.5 8 0-11048.61 13.77 0.8 9-100-140.74 15.59 2 10101042.17 12.25 2 11000048.38 20.85 2.5 12000048.38 20.85 2.5 131-10049.28 15.78 1 140-10150.50 14.15 0.5 15100-146.89 13.10 1.5 16000052.03 19.12 2 17011038.18 15.12 1 18100150.48 17.59 1.5 1900-1146.18 17.27 1.3 2010-1045.78 18.07 1.5 21000048.38 20.85 2.5 2201-1040.39 19.04 1.5 23000048.38 20.85 2.5 24001-146.15 12.02 0.5 25-110039.14 17.63 1 260-10-145.58 16.07 1 27010145.55 17.60 1.5 28001145.36 19.16 2 29-101047.05 20.58 2

2.5.1 水解度为响应值的响应面试验优化

方差分析和酶解各因素的显著性比较结果见表4 。

表4 水解度回归模型方差分析表
Table4 Analysis of variance of DH

注:*.差异显著(P<0.05);**.差异极显著(P<0.01)。下同。

来源方差自由度均方差F值P值显著性X 1加酶量75.74175.749.390.008 4** X 2酶解温度62.89162.897.800.014 4* X 3酶解时间40.09140.094.970.042 7* X 4酶解pH39.10139.104.850.044 9* X1 2 18.96118.962.350.147 5 X 222.07122.072.740.120 3 X3 2 2 142.001142.0017.610.000 8** 14.01114.011.740.208 6 X 1X 25.4215.420.670.426 0 X 1X 383.35183.3510.330.006 2** X 1X 40.3010.300.0370.850 0 X 2X 315.37115.371.910.189 1 X 2X 40.8610.860.110.748 7 X 3X 420.79120.792.580.130 7模型496.051435.434.390.004 6**残差112.92148.07失拟项102.231010.223.830.103 9误差10.6942.67总和608.9628 X4 2

利用Design-Expert软件对所得数据进行回归分析,对各因素回归拟合后,得到回归方程为:

用上述回归方程描述各因素与水解度之间的关系时,其因素和全体自变量之间的线性关系显著(R 2=0.814 6),模型达极显著水平(P<0.01)。模型中X 1、X 3 2、X 1X 3对水解度的影响极显著,X 2、X 3、X 4对水解度的影响显著。而失拟项P=0.103 9>0.05,不显著,说明方程对试验拟合较好,因此用此方程模型来模拟四因素与响应值的关系是可行的。

图5 各因素交互作用对脱脂草鱼内脏蛋白质水解度的影响
Fig.5 Response surface plots showing the interactive effect of hydrolysis parameters on the DH of grass carp viscera

图5显示了6 组试验参数以水解度为响应值的趋势图。由图5B、5D、5F的等高线图可以看出,酶解时间与加酶量、酶解温度、酶解pH值的交互作用显著。只有在加酶量、酶解温度、酶解时间和酶解pH值适宜的情况下,脱脂草鱼内脏的水解度才会达到最大值。

2.5.2 肽得率为响应值的响应面试验优化

方差分析和酶解各因素的显著性比较结果见表5。

表5 肽得率回归模型方差分析表
Table5 Analysis of variance of peptide yield

因素方差自由度均方差F值P值显著性X 1加酶量12.02112.0211.600.004 3** X 2酶解温度5.7515.755.550.033 6* X 3酶解时间13.35113.3512.890.003 0** X 4酶解pH8.3318.338.040.013 2* X 137.78137.7836.48<0.000 1** X2 2 2 37.87137.8736.57<0.000 1** X3 29.21129.2128.210.000 1** X 1X 25.3615.365.180.039 1* X 1X 316.95116.9516.360.001 2** X 1X 43.6713.673.550.080 6 X 2X 30.6110.610.590.454 6 X 2X 40.6510.650.630.442 0 X 3X 418.95118.9518.290.000 8**模型166.221411.8711.46<0.000 1**残差14.50141.04失拟项12.09101.212.010.261 6误差2.4140.06总和180.7228 19.59119.5918.920.000 7** X4 22

图6 各因素交互作用对脱脂草鱼内脏蛋白质肽得率的影响
Fig.6 Response surface plots showing the interactive effect of hydrolysis parameters on the peptide yield of grass carp viscera

利用Design-Expert软件对所得数据进行回归分析,对各因素回归拟合后,得到回归方程为:

用上述回归方程描述各因素与肽得率之间的关系时,其因素和全体自变量之间的线性关系显著(R 2=0.919 8),模型达极显著水平(P<0.01)。模型中X 1、X 3、X 1X 3、X 3X 4对肽得率的影响极显著,X 2、X 4、X 1X 2对肽得率的影响显著。而失拟项P=0.261 6>0.05,不显著,说明方程对试验拟合较好,因此用此方程模型来模拟四因素与响应值的关系是可行的。

图6中各图分别显示了6组试验参数以肽得率为响应值的趋势图。由图6B、D、F的等高线图可以看出,酶解时间与加酶量、酶解温度、酶解pH值的交互作用显著。只有在加酶量、酶解温度、酶解时间和酶解pH值都适宜的情况下,脱脂草鱼内脏的肽得率才会达到最大值。

2.5.3 响应面优化结果及验证

经响应面法分析得出4 个影响因素的最佳组合为加酶量33 015 U/g、酶解温度62.35 ℃、酶解时间5.37 h、酶解pH 7.9,此时的水解度达到44.65%,肽得率为18.49%,感官评分为2.16。为了检验模型预测的准确性,在最佳酶解条件下进行实验,实际测得的水解度为44.48%,肽得率为19.68%,感官评分为2,即总体风味柔和,鲜味强度适中。可见该模型能较好的预测草鱼内脏蛋白质的酶解情况。

3 讨论与结论

近年来,我国食品工业面临着来自资源和环境的双重压力,对现有蛋白质资源,特别是对大宗低值蛋白资源的精深加工,是解决长期以来严重制约我国食品工业发展问题的必要途径。国内关于低值鱼加工副产物综合利用的研究不断增多,也相应取得了较为突出的进展,但综合利用整体水平并未显著提高,未能在大范围深层次内实现高值化综合利用。鱼腥味的残留已经成为阻碍低值鱼加工副产物产业化发展的重要因素,因此未来的研究应进一步的完善,以解决这些问题为目的 [22]。乔路等 [23]研究了中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶制备鲍鱼脏器呈味肽及呈味氨基酸的最佳条件,中性蛋白酶酶解产物的水解度和肽得率最大,鲜味氨基酸含量最高且口味最好。Benjakul等 [2]利用碱性蛋白酶酶解太平洋白鱼下脚料得到了高含量的蛋白质(79.97%)。余杰等 [24]酶解鳗鱼下脚料得到的蛋白提取物具有营养价值高、海鲜风味浓郁的特点。Bhaskar等 [5]对印度一种淡水鱼Catla鱼内脏蛋白质用中性蛋白酶进行酶解,找到了酶解的最佳条件,在自然pH值、料液比1.25% (g/mL)、温度55 ℃、水解时间165 min条件下,水解度大于48%。Bhaskar等 [25]对Catla鱼内脏蛋白质用碱性蛋白酶进行酶解得到了酶解的最佳条件即pH 8.5、料液比1.5%(g/mL)、温度50 ℃、水解时间135 min时水解度接近50%。何莉萍等 [26]在草鱼内脏资源的综合利用技术研究中发现水解温度、时间、pH值、加酶量是影响草鱼内脏蛋白水解的关键因素,通过实验分析,可得到高的蛋白质溶出率。本研究探索了木瓜蛋白酶酶解草鱼内脏蛋白质的特性,以脱脂草鱼内脏蛋白为底物,以感官评分为指标,通过响应面试验确定加酶量33 015 U/g、酶解温度62.35 ℃、酶解时间5.37 h、酶解pH 7.9为最佳反应条件,本研究通过酶解的技术使鲜味多肽与鲜味氨基酸更多的释放,并且利用活性炭对水解液进行了脱腥处理,提高了草鱼内脏蛋白质的滋味品质,此时水解物水解度为44.48%,肽得率为19.68%,感官评分为2。

酶水解技术在鱼内脏加工的应用将越来越广泛,但是仍然存在一些问题,如酶解产物的不确定性及后期分离纯化的复杂性,过度酶解时产品有苦味,如何更加有效脱除苦腥味提高其可食性等将是鱼内脏深加工技术未来研究的重点内容。

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Optimization of Enzymatic Hydrolysis Conditions of Grass Carp Visceral Proteins by Response Surface Methodology

CONG Yanjun 1,2, YU Xiaofeng 1,2, CHEN Shu 1,3
(1. College of Food Science, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China; 2. Beijing Key Laboratory for Flavor Chemistry, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China; 3. Beijing Higher Institution Engineering Research Center for Food Additives and Ingredients, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

Abstract:The hydrolysis conditions of defatted visceral waste proteins of grass carp with papain were optimized by the combined use of single factor method and response surface methodology. An enzyme dosage of 33 015 U/g, a hydrolysis temperature of 62.35 ℃, a hydrolysis time of 5.37 h and initial pH 7.9 were found to be optimal for the hydrolysis of visceral proteins of grass carp. Under these conditions, the degree of hydrolysis (DH) was 44.48% with a peptide yield of 19.68%, and the hydrolysate had a medium umami taste.

Key words:grass carp viscera; protein; hydrolysis; response surface methodology; optimization

中图分类号:S254.9

文献标志码:A

文章编号:

doi:10.7506/spkx1002-6630-201510009

收稿日期:2014-10-19

基金项目:北京市自然科学基金项目(6132004);北京市科技新星计划项目(Z131102000413005)

作者简介:丛艳君(1978—),女,副教授,博士,研究方向为食品蛋白质化学与工程。E-mail:cyj_win@sina.com