王 月 1，张东杰 1,*，王 颖 1,2,*，梁小月 1，徐炳政 1
(1.黑龙江八一农垦大学食品学院,黑龙江 大庆 163319；2.国家杂粮技术工程研究中心,黑龙江 大庆 163319)
摘 要：采用聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）-(NH 4) 2SO 4双水相体系，分离铜诱导的诱变酿酒酵母菌所表达的金属硫蛋白。以PEG质量分数、(NH 4) 2SO 4质量分数及pH值为考察因素，萃取率为响应值，结合Design-Expert 8.0.6软件做响应面优化分析，优化到最佳萃取条件:PEG相对分子质量2 000、PEG和(NH 4) 2SO 4质量分数分别为22.5%和17.46%、pH 5.98。获取的金属硫蛋白主要分布在上相，萃取率可达81.69%。此方法操作简单、高效、成本低，是酵母源金属硫蛋白分离提纯的新方法。
关键词：金属硫蛋白；双水相萃取；响应面分析；分配系数；萃取率
金属硫蛋白（metallothionein，MT）是一类分子质量低、含丰富半胱氨酸的金属结合蛋白 [1]，广泛存在于植物、动物以及微生物体内，能被多种因素诱导产生。不同来源MT的等电点也不同，如哺乳类动物MT的pI在3.9～4.6之间，已发现的水生生物MT的pI在3.5～6.0之间。MT的分子质量较小，其范围大致为2 000～16 000 kD，MT构象较坚固，热稳定性强 [2]。其具有清除自由基，调节锌、铜等微量元素代谢，解除铅、砷、汞等重金属毒素，抗电离辐射等生物学功能，广泛应用于食品、药品、化妆品等领域 [3-5]。
目前常用的分离纯化MT方法包括层析法、DEAESepharose Fast Flow法、高效液相色谱法、毛细管电泳法等 [6-9]，但这些方法大多停留在实验室阶段。双水相萃取技术作为一种新型的分离技术，具有体系含水量高、分相时间短、萃取环境温和使蛋白质在其中不易变性、生物相容性高、易于放大和进行连续性操作等诸多优势 [10-11]，现已广泛应用于蛋白质、多肽、核酸以及氨基酸的分离和纯化 [12-13]。本实验采用聚乙二醇-硫酸铵双水相体系，通过单因素试验及响应面优化得到双水相萃取酵母源MT的最佳条件，为酵母源金属硫蛋白的分离提纯及工业化生产提供理论数据。
1.1 材料与试剂
酿酒酵母N-8 实验室诱导分离保存菌株；酵母菌MT酶联免疫分析试剂盒 上海劲马生物科技有限公司；YPD液体培养基 北京奥博星生物技术有限责任公司；其他试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
HZQ-F160振荡培养箱 哈尔滨东联电子技术开发有限公司；FS-450N型超声波处理器 上海生析超声仪器有限公司；DK-S24型电热恒温水浴锅 上海森信实验仪器有限公司；紫外分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；TD5A-WS台式离心机 湖南湘仪离心机仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 MT的诱导合成及粗提液的制备
将实验室保存的酿酒酵母菌按2%的接菌量接至活化YPD培养基中，30 ℃、24 h摇床活化，再按2%接菌量将活化种子液接入含0.7 mmol/L CuCl 2溶液的诱导YEPD培养基中，30 ℃、62 h摇床培养 [14-15]。之后3 000 r/min离心25 min，去上清液收集菌体，菌体与0.01 mol/L Tris-HCl（pH 8.6）缓冲液按1∶5的体积比充分混匀，冰浴条件下超声波破壁处理混合液，功率287 W、时间32 min。离心收集上清液，80 ℃水浴中热变性8 min，迅速冷却后离心收集上清液，得到MT含量约为170 ng/L的粗蛋白提取液 [16]。
1.3.2 双水相萃取酵母源MT
固定体系总质量为10.00 g，分别加入2 g聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）、2 g (NH 4) 2SO 4和1 g样品溶液，其余质量用超纯水补足，形成双水相体系。振荡使成相物质充分混匀，调节pH 5，静置到两相达到相分离，MT富集于双水相系统的上相中，用移液管吸取上下相溶液并读取上下相体积，求相比R；分别测定上下相MT质量浓度，计算MT的分配系数K及萃取率Y，如式（1）～（3）所示:
式中:V 1为上相体积/mL；V 2为下相体积/mL；ρ 1为上相中MT的质量浓度/（mg/mL）；ρ 2为下相中MT的质量浓度/（mg/mL）。
1.3.3 MT含量及抗氧化性测定
MT含量的测定采用酵母菌MT酶联免疫分析法 [17]，体外清除羟自由基能力的测定采用分光光度计法 [18]。
1.3.4 双水相萃取的单因素试验
影响双水相萃取的因素很多，本实验重点研究了PEG的相对分子质量（600、1 000、2 000、4 000、6 000）和质量分数（5%、10%、15%、20%、25%）、(NH 4) 2SO 4质量分数（15%、20%、25%、30%、35%）、pH值（3、4、5、6、7）、温度（20、25、30、35、40 ℃）5个因素对酵母源MT萃取率的影响。根据20%聚乙二醇（相对分子质量2 000）、20% (NH 4) 2SO 4、pH 6、温度25 ℃成相条件，改变其中1 个因素，其他条件不变，分别对上述5 个因素进行单因素考察。每个单因素试验均做3 个平行样品，计算其平均萃取率和平均分配系数。
1.3.5 响应面优化萃取条件
Box-Behnken试验设计是响应面分析设计试验中利用合理的试验设计且通过前期试验得到一定的数据，采用多元二次方程方法来拟合响应面值及因素之间的函数关系，采用回归方程来分析以寻求多因素系统中最优的提取条件的一种统计学方法 [19-20]。根据单因素试验的结果，在PEG的相对分子质量2 000、温度25 ℃的条件下，选择PEG质量分数（X 1）、(NH 4) 2SO 4质量分数（X 2）、pH值（X 3）3 个对酵母源MT萃取率影响较大的因素设计三因素三水平优化试验，因素水平见表1。
表1 响应面试验设计因素水平表
Table1 Factors and levels used in in response surface design
水平因素X 1PEG质量分数/%X 2(NH 4) 2SO 4质量分数/%X 3pH -115155 0 20206 1 25257
2.1 单因素试验结果
2.1.1 不同相对分子质量PEG对MT萃取的影响
PEG-(NH 4) 2SO 4双水相体系中，设定PEG质量分数20%、(NH 4) 2SO 4质量分数20%、pH 6、温度25 ℃，改变PEG相对分子质量，比较双水相体系的MT分配系数及萃取率。
图1 PEG相对分子质量对MT分配系数及萃取率的影响
Fig.1 Effect of average molecular weight of PEG on partition coefficient and extraction rate
由图1可以看出，当PEG的相对分子质量小于2 000时，随着PEG相对分子质量的升高，MT的分配系数和萃取率均出现先升高后降低的趋势。主要是随PEG的相对分子质量增大，分子链长度增加，分子内部极性基团的羟基相对减少，疏水性增加，界面张力增大，促使MT富集于上相，MT的分配系数和萃取率随之增加。但当PEG的相对分子质量大于2 000时，随着PEG相对分子质量的继续增大，黏度也随之增大，MT在两相间的传递和在相中的扩散阻力增加阻碍MT向上相富集，从而使MT的分配系数和萃取率下降 [21]，综合考虑选择PEG 2 000为成相物质。
2.1.2 PEG质量分数对MT萃取的影响
图2 PEG质量分数对MT分配系数及萃取率的影响
Fig.2 Effect of PEG concentration on partition coefficient and extraction rate
PEG-(NH 4) 2SO 4双水相体系中，设定(NH 4) 2SO 4质量分数20%、pH 6、温度25 ℃，改变PEG质量分数，比较双水相体系的MT分配系数及萃取率。由图2可知，随着PEG质量分数的增加，MT萃取率及分配系数随之增加。此现象主要是由于PEG质量分数在一定范围内增加，系统远离临界点，两相性质的差别增大，利于MT富集于PEG相中。当PEG质量分数超过20%后，继续增大PEG质量分数，成相物质分子间的作用、相界面张力、系统的黏度也会增大，导致溶质在相间的传递和在相内的扩散阻力增加，反而不利于MT进入PEG相，所以MT的分配系数及萃取率降低，故PEG质量分数为20%为最佳值。
2.1.3 (NH 4) 2SO 4质量分数对MT萃取率的影响
图3 (NH
4
)
2
SO
4
质量分数对MT分配系数及萃取率的影响
Fig.3 Effect of (NH
4
)
2
SO
4
concentration on partition coefficient and extraction rate
PEG-(NH 4) 2SO 4双水相体系中，设定PEG质量分数20%、pH 6、温度25 ℃，改变(NH 4) 2SO 4质量分数，比较双水相体系的MT分配系数及萃取率。
从图3可知，双水相体系中(NH 4) 2SO 4质量分数为20%时，MT的萃取率最高，随着(NH 4) 2SO 4质量分数继续增大，不仅破坏了MT表面的水化层，使之发生盐析，而且还会扰乱双水相系统，改变各相中成相物质的组成和相体积比，下相水分含量升高，下相的体积增大，MT有不断向下相分配的趋势，所以MT萃取率逐渐下降。虽然(NH 4) 2SO 4质量分数为25%时MT分配系数最大，但相比减小，萃取率减少，综合考虑选择(NH 4) 2SO 4为20%为最佳值。
2.1.4 pH值对MT萃取率的影响
PEG-(NH 4) 2SO 4双水相体系中，设定PEG质量分数20%、(NH 4) 2SO 4质量分数20%、温度25 ℃，改变pH值，比较双水相体系MT分配系数及萃取率。
图4 pH值对MT分配系数及萃取率的影响
Fig.4 Effect of pH on partition coefficient and extraction rate
由图4可知，双水相体系的pH值为3～7时，MT萃取率及分配系数呈现先升高后降低的趋势。当选择双水相体系为一种无机盐和一种PEG时，盐的正、负离子对两相具有不同的亲和力，它们在双水相体系中的分配能力不同，上相显示为正电性，下相显示为负电性 [22]。据报道酵母源MT的等电点在5.0左右 [23]，当双水相体系pH值大于MT等电点时，MT易富集于上相；当双水相体系pH值小于MT等电点时，MT易于向下相富集。pH值的改变也会影响双水相系统中无机离子的分配情况及两相之间的电位差，从而影响MT的分配系数和萃取率。在pH 6时MT萃取率及分配系数均达到最大值，故体系的pH值在6左右为最佳。
2.1.5 温度对MT萃取率的影响
PEG-(NH 4) 2SO 4双水相体系中，设定PEG质量分数20%、(NH 4) 2SO 4质量分数20%、pH 6，改变温度，比较双水相体系的MT分配系数及萃取率。
由图5可知，体系的温度20～40 ℃范围内MT的萃取率及分配系数均有所上升，推测当温度上升，双水相体系内分子运动的加强降低了静电排斥作用，使MT的分配系数和萃取率增加。但随着温度的升高，MT的分配系数和萃取率增加幅度较小，考虑到常温条件下双水相体系溶液的黏度低、易分相，实际生产中操作节省成本等问题，故体系的温度设定为25 ℃。
图5 温度对MT分配系数及萃取率的影响
Fig.5 Effect of temperature on partition coefficient and extraction rate
2.2 响应面优化试验结果
2.2.1 MT萃取响应面试验设计与结果
依照表1的试验因素与水平设计，采用Design-Expert 8.0.6软件根据Box-Behnken设计，以MT萃取率作为响应值进行响应面优化试验，结果见表2。
表2 Box-Behnken试验设计及结果
Table2 Box-Behnken experimental design and results
试验号X 1PEG质量分数质量分数X 3pHMT萃取率/% 1-11058.45 2 0 0 0 80.21 X 2(NH 4) 2SO 43 -171.60 4 0 1 -173.29 1 0 5 56.92 6-1-1068.58 7-10-172.53 8 0 0 0 78.15 0 1 1 80.34 1011073.92 111-1080.95 120-1172.30 1310172.83 1400079.27 150-1-174.78 1600078.70 17-10154.65 9 0 0 0
2.2.2 回归方程的方差分析结果
通过 Design-Expert 8.0.6软件模拟得到PEG质量分数（X 1）、(NH 4) 2SO 4质量分数（X 2）、pH值（X 3）对MT萃取率（Y）的二次多项回归模型方程为:
方程中各因素系数绝对值大小反映了该因素对响应值的影响程度，系数的正、负反映影响的方向 [24]。回归方程方差分析如表3所示，该模型的P值小于0.000 1，失拟项（P＞0.05）不显著，方程决定系数R 2＞0.9，说明所选模型极为显著，模型与真实值的拟合度较高。
表3 回归方程方差分析
Table3 Analysis of variance for the regression model
注:**.差异极显著，P＜0.001；*.差异显著，P＜0.05。
来源平方和自由度均方F值P值显著性模型1 071.729119.0845.75＜0.000 1** X 1PEG质量分数254.141254.1497.63＜0.000 1** X 2(NH 4) 2SO 4质量分数144.761144.7655.610.000 1** X 3pH157.531157.5360.520.000 1** X 1X 22.412.40.920.368 7 X 1X 360.37160.3735.090.000 6** X 2X 331.87131.8718.520.003 5* X 173.57173.5742.750.000 3** X2 2 110.161110.1664.02＜0.000 1**残项12.0571.72失拟项9.6733.225.440.067 7不显著纯误差2.3740.59总和720.3916 38.47138.4722.350.002 1* X3 22
2.2.3 响应面分析
图6 各因素交互作用对MT萃取率的影响
Fig.6 Interactive effect of three factors on the extraction rate of MT
双水相萃取酵母源MT的响应面见图6，结合表3回归方程方差分析可知，各因素对MT萃取率影响大小为X 1＞X 3＞X 2，即PEG质量分数对MT萃取率影响最大，其次为pH值及(NH 4) 2SO 4质量分数。交互相中X 1X 3极显著（P＜0.001），说明PEG质量分数与体系pH值间的交互作用较强，X 2X 3显著（P＜0.05），说明(NH 4) 2SO 4质量分数与pH值间的具有交互作用，PEG质量分数和(NH 4) 2SO 4质量分数之间的交互作用不显著。
2.2.4 确定最佳工艺条件
双水相萃取酵母源MT的最佳工艺条件为常温（25 ℃左右） PEG质量分数22.5%、(NH 4) 2SO 4质量分数17.46%、pH 5.98，在此工艺条件下MT的萃取率可达81.87%。在此条件下进行3次平行实验得到MT的萃取率为81.69%，与理论值差别较小，测定MT体外清除羟自由基能力是VC溶液的3.1 倍，与文献报道基本一致 [25]。以上实验结果充分验证了所建模型的正确性，所以此优化工艺条件是合理可行的。
双水相萃取酵母源MT，在单因素的基础上采用Box-Behnken试验设计以及响应面分析，确定双水相萃取最佳工艺为PEG相对分子质量2 000、PEG质量分数22.5%、(NH 4) 2SO 4质量分数17.46%、pH 5.98，常温（25 ℃左右）进行3 次萃取平行实验，萃取率可达81.69%，与理论值81.87% 相差较小，MT体外清除羟自由基能力是VC溶液的3.1 倍，所以优化后的工艺条件是可行的。本实验尝试了一种步骤简单、快速、适宜工业化生产的提取MT的方法，对相关研究具有一定的参考价值。
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Optimization of Extraction Process of Yeast Metallothionein by Aqueous Two-Phase System
WANG Yue
1, ZHANG Dongjie
1,*, WANG Ying
1,2,*, LIANG Xiaoyue
1, XU Bingzheng
1
(1. College of Food Science, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China; 2. National Coarse Cereals Engineering Research Center, Daqing 163319, China)
Abstract：In this study, an aqueous two-phase system consisting of polyethylene glycol (PEG) and ammonium sulfate was used to extract copper-induced metallothionein (MT) from a mutant strain of Saccharomyces cerevisiae. Response surface methodology was employed to optimize three factors namely PEG concentration, (NH 4) 2SO 4concentration and pH that influence extraction efficiency using the software Design-Expert 8.0.6. The optimal aqueous two-phase system for MT extraction was determined to contain 22.5% PEG 2 000, 17.46% (NH 4) 2SO 4at pH 5.98. Under these optimal conditions, the metallothionein was mainly distributed in the upper phase with an extraction rate of 81.69%. Therefore, this method can provide a new, simple, convenient, economical and highly efficient strategy for the extraction of metallothionein from yeast.
Key words：metallothionein; aqueous two-phase system extraction; response surface methodology; distribution coefficient; extraction rate
中图分类号：TS201.1
文献标志码：A
文章编号：
doi：10.7506/spkx1002-6630-201510011
收稿日期：2014-10-17
基金项目：黑龙江省教育厅新世纪人才项目(2014-2016)；黑龙江省博士后资助项目(LBH-Z13169)
作者简介：王月(1990—),女,硕士研究生,研究方向为食品质量与安全。E-mail：wangy426@126.com
*通信作者：张东杰(1966—),男,教授,博士,研究方向为农产品加工及贮藏工程和食品质量安全。E-mail：zdj_66@126.com
王颖(1979—),女,副教授,博士,研究方向为农产品加工及食品质量与安全。E-mail：wychen156@163.com