顾仁勇,杨万根,余 佶
(吉首大学化学化工学院,湖南 吉首 416000)
摘 要：为了综合利用八月瓜幼果资源，采用超临界CO 2萃取技术提取八月瓜多酚。探讨了不同体积分数乙醇溶液作为夹带剂对多酚的萃取效果，采用响应面法，以多酚萃取得率为响应值，考察原料与夹带剂的料液比、萃取压力和萃取温度对多酚萃取的影响，并优化萃取条件。结果表明:以体积分数95%乙醇溶液为夹带剂，可使八月瓜幼果多酚萃取得率提高约2.45 倍，产品纯度提高约15.49%；优化所得最佳条件为料液比1∶2.6（g/mL）、萃取压力37 MPa、萃取温度51 ℃，此条件下八月瓜幼果多酚萃取得率可达6.41%，产品纯度为87.69%。
关键词：八月瓜幼果；多酚；超临界CO 2萃取；夹带剂；响应面优化法
八月瓜又名八月炸、羊开口、牛腰子果等，植物学名为三叶木通，是传统药食两用野生植物果实，广泛分布于我国秦岭以南的山地、平原及东南亚、日本等地 [1-2]。八月瓜果肉营养丰富，风味独特 [3-4]。研究表明八月瓜对防癌、抗癌、预防和治疗高血压、高血脂等有显著效用 [5-6]。
湖南西部山区地理和气候条件非常适合八月瓜的生长，近几年，在当地政府的科学引导和大力推动下，湘西地区已发展八月瓜种植近10万 亩 [7]。八月瓜种植期间的蔬果作业，要摘除大约10%～15%的幼果，大量的幼果直接废弃，也给环境造成一定的污染。因此，幼果的综合利用技术具有重要的经济效益和社会效益。八月瓜幼果含丰富的多酚类物质，植物多酚具有良好的抑菌、抗氧化、清除体内自由基、降血压、防治心脑血管疾病、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化等多种生理和药理活性，被誉为“第七类营养素” [8-12]。目前，国内外有关植物多酚的提取技术和功能性研究已开展比较深入 [13-16]，但八月瓜多酚的研究尚在起步阶段，而八月瓜幼果的多酚提取及综合利用还未见报道。植物多酚的提取主要有溶剂提取、金属离子沉淀、树脂分离法和超临界萃取等方法 [17-19]。其中，超临界CO 2萃取技术因工艺简单、无溶剂残留、萃取高效、产品性质稳定等优点，在植物多酚的提取中得到了广泛的应用 [13]。但是，多酚分子极性强，在CO 2流体中的溶解度较低，直接萃取得率低，需要通过添加乙醇等极性夹带剂加大对酚类的溶解能力，从而提高萃取效果 [20-21]。
本研究以乙醇为夹带剂，超临界CO 2萃取八月瓜幼果中多酚，采用响应面法优化料液比、萃取压力和萃取温度的工艺条件，可为八月瓜幼果多酚提取及综合利用提供技术参考。
1.1 材料与试剂
八月瓜幼果由湘西地区种植户提供；CO 2（纯度99.9%） 岳阳市开诚石化物资有限公司；福林-酚试剂（生物试剂）、没食子酸标准品 上海源叶生物科技有限公司；碳酸钠、无水乙醇均为分析纯。
1.2 仪器与设备
UV-2450型紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；HA121-50-01型半连续超临界CO 2萃取装置 江苏南通华安超临界萃取有限公司；F1-130药物粉碎机 泰斯特仪器有限公司；RE-201D旋转蒸发器 郑州亚荣仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 萃取操作
将八月瓜幼果切成细条，50 ℃干燥，粉碎过80 目筛，称取粉料200 g，装入萃取罐，加夹带剂浸润30 min，启动超临界CO 2萃取装置萃取多酚。收集产品，按下式计算萃取得率:
1.3.2 多酚含量测定（福林-酚比色法）
1.3.2.1 标准曲线的建立
配制质量浓度0.002、0.004、0.006、0.008、0.010、0.012 mg/mL的没食子酸标准品样液，各取1.0 mL，分别加入稀释2 倍的福林-酚试剂4.0 mL，再加入质量分数为12.0%的Na 2CO 3溶液5.0 mL，静置2 h，用紫外-可见光分光光度计于760 nm波长处测定吸光度 [22-23]。绘制标准曲线，求得标准样品没食子酸质量浓度（Y）与吸光度（A）的线性回归方程:Y=117.43A-0.018 7（R²= 0.996 4）。
1.3.2.2 产品多酚含量测定
取样品1.0 mL，按照标准曲线测定方法处理，用紫外-可见光分光光度计于760 nm波长处测定吸光度，带入回归方程计算多酚含量。
1.3.3 夹带剂对多酚萃取效果的强化实验
称取原料200 g加入提取罐，按料液比1∶1.5（g/mL）分别加入无水乙醇和95%、90%、85%、80%乙醇溶液为夹带剂，浸润30 min。控制萃取压力30 MPa、萃取温度45 ℃、CO 2流量20 kg/h、萃取时间2.5 h进行多酚萃取，以未加夹带剂的萃取实验为对照。计算萃取得率，并测定产品多酚含量为产品纯度。
1.3.4 超临界萃取条件优化
在固定CO 2流量20 kg/h和萃取时间2.5 h条件下，采用Box-Behnken试验设计，以料液比、萃取压力和萃取温度为3 个因素，在单因素试验基础上，进行三因素三水平响应面优化试验，以萃取得率为响应值，优化萃取条件。试验因素水平见表1。
表1 响应面试验因素与水平
Table1 Factors and levels used in response surface design
水平因素A料液比（g/mL）B萃取压力/MPaC萃取温度/℃-11∶2.03045 0 1∶2.53550 1 1∶3.04055
1.3.5 乙醇提取八月瓜幼果多酚
称取已粉碎过筛的原料50 g，加95%乙醇溶液400 mL，50 ℃恒温提取2.5 h，抽滤，收集滤液，采用旋转蒸发器进行浓缩，收集产品，按1.3.1节公式计算萃取得率，并测定多酚含量。
2.1 夹带剂对多酚萃取效果的强化结果
图1 夹带剂体积分数对萃取得率(A)和多酚纯度(B)的影响
Fig.1 Effect of entrainer concentration on the extraction yield and purity of polyphenols
由图1可见，使用不同体积分数乙醇溶液为夹带剂，八月瓜幼果多酚的萃取得率为对照组的1.42～2.45 倍，产品纯度比对照组提高了4.58%～15.49%，表明使用乙醇为夹带剂对多酚萃取有明显的强化效果。不同体积分数乙醇溶液的萃取效果相比，使用95%乙醇溶液和无水乙醇的萃取效果最佳，萃取得率分别达5.21%和5.24%，产品纯度分别为86.87%和86.72%，但两者强化效果相差不大。酚类物质分子极性大，在单纯的CO 2流体中的溶解度有限，通过添加乙醇等极性夹带剂后能加大对酚类的溶解能力，从而明显提高萃取效果 [21]。考虑经济成本，选择95%乙醇溶液为夹带剂进行萃取条件优化试验。
2.2 单因素试验结果
2.2.1 料液比对多酚萃取的影响
固定萃取压力30 MPa、萃取温度45 ℃，料液比分别为1∶0.5、1∶1.0、1∶1.5、1∶2.0、1∶2.5、1∶3.0，按1.3.1节所述方法进行多酚萃取，以萃取得率为评价指标，考察萃取效果。
图2 料液比对多酚萃取得率的影响
Fig.2 Effect of solid/liquid ratio on the extraction yield and purity of polyphenols
由图2可见，在料液比1∶0.5～1∶2.5范围内，多酚萃取得率逐渐提高，至1∶2.5时达最高值5.92%。之后随夹带剂添加量增大，萃取得率呈现缓慢降低的趋势，这可能是乙醇加入过多使超临界CO 2流体溶解度饱和所致。因此，最适料液比为1∶2.5。
2.2.2 萃取压力对多酚萃取的影响
固定萃取温度45 ℃、料液比1∶2.5，分别控制萃取压力20、25、30、35、40、45 MPa，按1.3.1节所述方法进行多酚萃取，以萃取得率为评价指标，考察萃取效果。
图3 萃取压力对多酚萃取得率的影响
Fig.3 Effects of extraction pressure on the extraction yield and purity of polyphenols
由图3可见，随萃取压力增大，多酚萃取得率先增加而后降低，压力为35 MPa时萃取得率达最高值6.32%。增大萃取压力可增大超临界CO 2流体的密度，从而增大对萃取物的溶解度和减少分子间的传质距离，使萃取得率增加。但压力过高，溶质的扩散系数减小，传质阻力增大，萃取能力反而下降 [24]。选择最适萃取压力为35 MPa。
2.2.3 萃取温度对多酚萃取的影响
固定萃取压力35 MPa、料液比1∶2.5，萃取温度分别为35、40、45、50、55、60 ℃，按1.3.1节所述方法进行多酚萃取，以萃取得率为评价指标，考察萃取效果。
图4 萃取温度对多酚萃取得率的影响
Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction yield and purity of polyphenols
由图4可见，在35～60 ℃范围内，随萃取温度升高，多酚萃取得率先增大后减少，至50 ℃萃取得率达最高值6.41%。萃取温度升高，一方面因为增加了物质的扩散系数而利于萃取，另一方面则降低了CO 2的密度，使物质溶解度降低而降低萃取得率 [24]。选取最适萃取温度为50 ℃。
2.3 萃取条件响应面优化试验结果
2.3.1 Box-Behnken试验设计及结果
采用Design-Expert 8.05软件进行试验设计和数据处理。以料液比、萃取压力和萃取温度为3 个试验因素，根据单因素试验结果选定因素水平，以萃取得率为响应值，设计试验。试验设计及结果见表2。
表2 响应面试验设计及结果
Table2 Response surface design arrangement and experimental results
试验号A料液比B萃取压力C萃取温度萃取得率/% 1 0 0 0 6.25 2 6.41 3 1 1 0 5.88 0 0 0 4 5.62 5 0 -115.42 1 0 1 -1105.56 7 0 1 -15.82 6 8 -15.74 9 0 1 1 5.94 1 0 100-1-14.93 11-10-14.98 121-105.45 13-1015.87 140006.37 15-1-105.04 160006.38 170006.33
2.3.2 模型的建立及显著性检验
对表2中的试验数据进行多元回归拟合，得到以多酚萃取得率（Y）为响应值的回归方程:
Y=6.35+0.16A+0.30B+0.17C-0.023AB-0.25AC-0.092BC-0.42A 2-0.45B 2-0.38C 2
表3 回归方程的方差分析
Table3 Analysis of variance (ANOVA) for regression equation
注:*.差异显著（P＜0.05）；**.差异极显著（P＜0.01）；R
2=0.986 9，
=0.970 1。
方差来源平方和自由度均方F值P值显著性模型3.8490.4358.63＜0.000 1** A料液比0.1910.1926.390.001 3** B萃取压力0.7010.7095.59＜0.000 1** C萃取温度0.2410.2432.670.000 7** AB2.025×10 -312.025×10 -30.280.614 3 AC0.2610.2635.020.000 6** BC0.03410.0344.700.066 8 A 20.7410.74102.11＜0.000 1** B 20.8310.83114.62＜0.000 1** C 20.5910.5981.41＜0.000 1**残差0.05177.283×10 -3失拟0.03630.0123.120.150 5不显著纯误差0.01543.820×10 -3总离差3.8916
由表3可见，所得二次方程模型极显著，同时失拟项不显著，表明回归方程具有显著意义。方程相关系数R
2=0.986 9，调整相关系数
0.970 1，说明方程能解释97.01%的响应值变化，拟合程度良好，可以用该方程推测试验结果。由方差分析可知，3 个因素A、B、C对响应值影响极显著，二次项A
2、B
2、C
2对响应值曲线效应影响极显著，交互项AC对响应值曲面效应影响极显著，交互项AB和BC影响不显著；3 个因素对萃取得率影响的顺序为:B＞C＞A，即萃取压力＞萃取温度＞料液比。
2.3.3 响应面分析
图5 各因素交互作用对萃取得率影响的等高线和响应面
Fig.5 Contour and response surface plots showing the interactive effects of extraction parameters on the extraction yield of polyphenols
响应面图坡度大表明因素对响应值影响大，等高线密集呈椭圆形表示两因素交互影响加大，而坡度平缓、等高线呈圆形则与之相反。
由图5可见，随料液比、萃取压力和萃取温度水平数的增大，多酚萃取得率首先明显增高，随后缓慢降低，表明3 个因素对萃取得率都具有明显影响，在所选范围内萃取得率存在极值。图5a中沿萃取压力方向比料液比方向的响应面坡度大，等高线更加密集，表明萃取压力对萃取得率的贡献更大，等高线接近圆形，表明两因素的交互作用不明显。同理，图5b显示，萃取温度和料液比对萃取得率的贡献相差不大，但两者等高线密集，行状趋向椭圆，表明两者交互作用明显；图5c显示，萃取压力对萃取得率的贡献要大于萃取温度，压力和温度交互作用不明显。
2.3.4 萃取条件优化及验证实验结果
利用模型优化的八月瓜多酚最佳萃取条件为料液比1∶2.57、萃取压力36.57 MPa、萃取温度50.74 ℃，预测八月瓜多酚萃取得率为6.42%。考虑到实际操作性，将萃取条件修正为:料液比1∶2.6（g/mL）、萃取压力37 MPa、萃取温度51 ℃。在此条件下进行验证实验，重复3 次，八月瓜多酚平均萃取得率为6.41%，与预测值接近，表明优化所得条件可靠。 按照1.3.2节方法测定萃取所得产品多酚含量，重复3 次，测得产品纯度为87.69%。
2.4 乙醇提取八月瓜幼果多酚实验结果
用95%乙醇溶液为提取溶剂，于50 ℃恒温提取八月瓜幼果多酚2.5 h。测定得多酚提取得率为4.37%，产品纯度为81.46%，两项指标均低于超临界CO 2萃取结果，表明采用超临界CO 2萃取八月瓜幼果多酚有明显的优势。
以体积分数95%乙醇溶液为夹带剂，能有效强化超临界CO 2萃取八月瓜幼果多酚的萃取效果，使多酚萃取得率提高约2.45 倍，产品纯度提高约15.49%。采用Box-Behnken试验设计，以多酚萃取得率为响应值，优化料液比、萃取压力和萃取温度的取值，方差分析显示所建模型回归效果极显著，拟合度良好；料液比、萃取压力和萃取温度对多酚萃取得率存在极显著影响，萃取温度和料液比之间存在极显著的交互影响；3 个因素的影响顺序为萃取压力＞萃取温度＞料液比；优化所得最佳条件为料液比1∶2.6、萃取压力37 MPa、萃取温度51 ℃，此条件下八月瓜幼果多酚萃取得率为6.41%，产品纯度87.69%。
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Optimization of Supercritical CO 2Extraction Conditions of Polyphenols from Young Fruits of Holboellio latifolia by Response Surface Methodology
GU Renyong, YANG Wangen, YU Ji
(College of Chemistry and Chemical Engineering, Jishou University, Jishou 416000, China)
Abstract：Polyphenols were extracted from the young fruits of Holboellio latifolia by supercritical CO 2extraction. The effect of ethanol concentration on extraction efficiency was examined. The extraction conditions solid/liquid ratio (namely material/entrainer ratio), extraction pressure and temperature were investigated and the optimum extraction conditions were obtained by response surface methodology. The results showed that the extraction yield and purity of polyphenols were enhanced by 2.45 times and 15.49%, respectively, when using 95% ethanol as the entrainer, in comparison to those obtained without the entrainer. The optimum extraction conditions for solid/liquid ratio, extraction pressure and temperature were 1:2.6 (g/mL), 37 MPa and 51 ℃, respectively. Under these conditions, the extraction yield and purity of polyphenols reached 6.41% and 87.69%, respectively.
Key words：young fruits of Holboellio latifolia; polyphenols; supercritical CO 2extraction; entrainer; optimization by response surface methodology
中图分类号：TS201.1
文献标志码：A
文章编号：
doi：10.7506/spkx1002-6630-201510015
收稿日期：2014-12-01
作者简介：顾仁勇(1972—),男,教授,硕士,研究方向为食品加工与保藏。E-mail：gry8565398@163.com