黄 旭,贾宏新,李 辉
(辽宁省食品检验检测院,辽宁 沈阳 110015)
摘 要：参照GB/T 5009.84—2003《食品中硫胺素（维生素B 1）的测定》测定营养液补充剂中硫胺素的含量。通过对测定过程中的不确定度来源进行分析，评定出各不确定度分量，最后计算出合成标准不确定度和扩展不确定度，结果表明:试样中硫胺素含量为0.49 mg/100 g，扩展不确定度为0.052 mg/100 g。不确定度分量结果显示，标准曲线拟合产生的不确定度在不确定度合成中贡献最大，因此在营养素补充剂中硫胺素进行测定时，应对标准曲线的拟合过程加强控制，确保结果的准确性。
关键词：不确定度；硫胺素；营养液补充剂
测量不确定度是表征合理的赋予被测量值的分散性，是与测量结果相联系的参数，一切测量过程都会不可避免地产生不确定度。测量不确定度就是对测量结果质量的定量表征，测量结果的可用性很大程度上取决于其不确定度的大小。所以，测量结果表述必须同时包含赋予被测量的值及与该值相关的测量不确定度，才是完整并有意义的。检测结果的不确定度反映了结果的可靠性，同时可以反映出检测实验室人员技术仪器设备的水平。
荧光分光光度法测定营养素补充剂中硫胺素含量的测量常用的方法，在其分析过程中操作步骤比较复杂，影响因素较多，因此给出具有置信概率的检测结果，掌握对检测结果有较大影响的关键因素，是实施内部质量控制的重要工作内容。目前已经出台相关文件对校准实验室测量不确定度的评估做出了要求 [1-2]，现在许多实验室已经在检测报告中提供测量结果的不确定度，以达到对检测结果的进一步科学表述。本实验根据GB/T 5009.84—2003《食品中硫胺素（维生素B 1）的测定》 [3]对采用荧光分光光度法测定营养素补充剂中硫胺素含量过程中的不确定度来源进行全面分析，并最终给出评定结果，以找出对实验结果影响较大的环节，它能对检测数据进行客观真实的评价，给出测量结果的可信程度 [4]。测量结果的不确定度是评价一种测量方法能力优劣的指征，并与测量结果相联系的参数。
图1 荧光分光光度法测定营养素补充剂中硫胺素(VB
1
)含量操作流程图
Fig.1 Flow chart for determination of thiamine (vitamin B
1
) in nutrient supplements with fluorescence spectrophotometry
1.1 材料、试剂与仪器
实验用营养液补充剂为本实验室某次检验的余样，且样品在保质期内，符合检验要求。
硫胺素（纯度99.5%） 国药集团化学试剂有限公司；蛋白酶（酶活度≥6 000 U） 杭州沃凯电气有限公司；Taka淀粉酶（酶活度≥6 000U） 美国Sigma公司。其他化学试剂均为分析纯。
RF-5301PC荧光分光光度计 日本岛津公司；BS300S电子天平（精度为0.001 g） 德国Sartorius公司。
1.2 方法
本实验参照GB/T 5009.84—2003 [3]，对试样中硫胺素的含量进行测定。
1.2.1 样品处理
准确称取一定量试样（硫胺素含量约为10～30 μg，一般称取2～10 g试样），置于100 mL三角瓶中，加入50 mL 0.1 mol/L盐酸使其溶解，置于沸水加热1 h，凉后取出，冷却。用2 mol/L乙酸钠溶液调pH值至4.5。按每克试样加入20 mg淀粉酶和40 mg蛋白酶的比例加入淀粉酶和蛋白酶，于45～50 ℃温箱过夜保温（约16 h）。冷却至室温，定容至100 mL，然后混匀过滤，即为样品溶液。
1.2.2 氧化
将5 mL样液分别加入A、B两个反应瓶中，在避光条件下，将3 mL质量分数15%氢氧化钠溶液加入反应瓶A，作为样品空白管。将3 mL碱性铁氰化钾溶液（0.7 g/L）加入反应瓶B，作为样品管，振摇约15 s，然后加入正丁醇10 mL，将A、B两个反应瓶同时用力振摇1.5 min。标准溶液同上操作。静置分层后吸去下层碱性溶液，加入2～3 g无水硫酸钠使溶液脱水。
1.2.3 荧光测定
激发波长365 nm、发射波长435 nm、激发波狭缝5 nm、发射波狭缝5 nm的条件下依次测定下列荧光强度:1）试样空白荧光强度（试样反应瓶A）；2）标准空白荧光强度（标准反应瓶A）；3）试样荧光强度（试样反应瓶B）；4）标准荧光强度（标准反应瓶B）。
荧光分光光度法测定食品中硫胺素(VB 1)含量的计算公式为：
式中:x为试样中硫胺素含量/（mg/100 g）；c为试样被测液中硫胺素质量浓度/（μg/mL）；V
1为样品定容体积/mL；m为样品质量/g；
为试样含量由μg/g换算成mg/100 g的系数。
1.2.4 不确定度来源因果图（鱼骨刺图）
从测量模型上分析对食品中硫胺素含量的测量结果有影响的各种不确定度分量来源。各不确定度来源如图2所示。
图2 荧光分光光度法测定营养素补充剂中硫胺素(VB
1
)含量的各不确定度来源
Fig.2 The sources of uncertainty for determination of thiamine (vitamin B
1
) in nutrient supplements with fluorescence spectrophotometry
2.1 不确定度数学模型 [5-13]
2.1.1 测量模型
式中:Y为试样中硫胺素的质量分数；m为样品质量；V 1为样品定容体积；C 0为标准溶液；C n为标准曲线拟合；S 0为样品空白；rep为测量重复性；Rec为回收率。
2.1.2 测量结果重复性引入的不确定度
称取样品6 份，按照同样测量过程进行平行测定:
2.1.3 样品称量引入的不确定度u（m）
式中:a为检定证书其最大允许误差；k为分布形态。
样品称量引入的相对标准不确定度:
2.1.4 样品定容体积引入的不确定度u（V 1）
式中:u（V A）为玻璃量器的容量允差；u（V C）为温度变化产生的误差。
样品定容体积引入的相对标准不确定度:
2.1.5 标准溶液引入的不确定度
标准溶液引入的不确定度由标准物质的不确定度u（C s）和标准溶液配制过程引入的不确定度u（C p）组成。
2.1.5.1 标准物质的不确定度
2.1.5.2 标准溶液配制过程引入的不确定度u（C p）
标准溶液配制过程引入的相对标准不确定度为:
标准溶液引入的相对标准不确定度:
2.1.6 标准曲线拟合引入的不确定度u（C n）
标准曲线剩余标准差:
式中:y i为标准溶液各浓度点对应的响应值；y j为根据标准曲线算出的理论响应值；n为标准曲线的点数。
标准曲线拟合引入的不确定度:
式中:p为单一样品溶液测量次数（2 次）；c
d为单一待测样品质量浓度的平均值/（μg/mL）；c
j为标准曲线各点质量浓度理论值/（μg/mL）；
为标准曲线各点质量浓度的平均值/（μg/mL）。
标准曲线拟合引入的相对标准不确定度:
2.1.7 样品空白引入的不确定度
样品空白的标准不确定度:
样品空白的相对标准不确定度:
2.1.8 回收率引入的不确定度u（Rec）
回收率的标准不确定度:
回收率的相对标准不确定度:
2.2 测量结果以及不确定度分析 [14-26]
2.2.1 测量结果重复性引入的不确定度
对同一样品平行测定6 次（n=6），测得的结果分别为0.49、0.52、0.55、0.51、0.49、0.53 mg/100 g，测试结果的平均值为0.52 mg/100 g，测试结果的标准偏差为0.023 mg/100 g，测试结果的相对标准偏差为4.5%。
带入公式（3），得出u(rep)=0.009 4 mg/100 g；带入公式（4），得出u rep(rep)=1.8%。
2.2.2 样品称量引入的不确定度u（m）
用分析天平称取2.0 g样品（m），精确到0.001 g，实际操作中采用精度为0.001 g的电子天平称量，根据检定证书其最大允许误差为±0.000 5 g。样品称量是由一次回零称量所得，且使用的是自动显示数字的天平。
按照均匀分布（k=
），带入公式（5），得出u（m）=0.002 9 g；带入公式（6），得出u
rep（m）= 0.15%。
2.2.3 样品定容体积引入的不确定度u（V 1）
将处理后的样品转移至1 0 0 m L容量瓶中，100.0 mL A级容量瓶的标准不确定度包括玻璃量器的容量允差u（V
A）和温度变化产生的误差u（V
C）组成，JJG 196—2006
[9]《常用玻璃量器》规定，20 ℃时100 mL容量瓶（A级）的容量最大允许误差别为±0.10 mL按照均匀分布（k=
），设温度变化±3 ℃、水膨胀系数在20℃时，α= 2.1 × 10
-4/℃。
带入公式（7），得出u(V 1)=0.068 mL；带入公式（8），得出u rep(V 1)=0.068%。
2.2.4 标准溶液引入的不确定度
2.2.4.1 标准物质的不确定度
硫胺素标准物质证书上给出的相对不确定度U=0.50%，k=2。带入公式（9），得出u rep(C)=0.25%。
2.2.4.2 标准溶液配制过程引入的不确定度u（C p）
标准溶液配制过程引入的不确定度由标准物质称量引入的不确定度u（m 1）和稀释定容过程引入的不确定度两部分组成。
标准溶液储备液配制:准确称取100 mg经氯化钙干燥24 h的硫胺素，溶于0.01 mol/L盐酸中，并稀释至1 000 mL，配成0.1 mg/mL的标准储备液。
标准使用液配制:取10.00 mL 0.1 mg/mL的标准储备液稀释至100.0 mL，配成10 μg/mL的标准中间液。取10.00 mL 10 μg/mL的标准中间液至100.00 mL，配成1 μg/mL的标准中间液。取0、1、5、10.00 mL 1 μg/mL的标准中间液至100.00 mL，配成0 μg/mL（标准使用液第1点）、0.01 μg/mL（标准使用液第2点）、0.05 μg/mL（标准使用液第3点）、0.1 μg/mL（标准使用液第4点）的标准使用液。取2、5 mL 10 μg/mL的标准中间液至100.00 mL，配成0.2 μg/mL（标准使用液第5点）、0.5 μg/mL（标准使用液第6点）的标准使用液。
以标准使用液第4点为例，标准溶液配制过程为:标准储备液:C 1=m 1/V 1；标准中间液:C 2=V 2×C 1/V 3；标准中间液:C 3=V 4×C 2/V 5；标准使用液:C p=V 6×C 3/V 7。
标准使用液配制过程最终表达式:
式中:V 2为1 000 mL容量瓶，u（V 容量瓶-1 000 mL）；V 2、V 4、V 6为10.00 mL吸管，u（V 吸管-10 mL）；V 3、V 5、V 7为100 mL容量瓶，u（V 容量瓶-100 mL）；第2、3、5、6点:分别用到1、5、2、5 mL分度吸管，100 mL容量瓶（4 次）。
（1）标准物质称量过程中分析天平最大允差
用分析天平称取100 mg标准品，实际操作中使用精度为0.000 1 g的电子天平称量，根据检定证书其最大允许误差为±0.000 5 g。样品称量是由一次回零称量所得，且使用的是自动显示数字的天平。
按照均匀分布（k=
），则天平的最大允许误差导致的标准不确定度:
天平的最大允许误差导致的相对标准不确定度:
（2）标准溶液逐级稀释定容过程中玻璃量器的不确定度
使用玻璃量器:1 000 mL容量瓶1 次、100 mL容量瓶7次、10.00 mL单标线吸管3次、1 mL分度吸管1 次、2 mL分度吸管1 次、5 mL分度吸管2 次。
玻璃量器的不确定度包括玻璃量器的容量允差u（V A）和温度变化产生的误差u（V C）组成依据公式（7）计算。
以10 mL单标线吸管的不确定度为例:JJG 196—2006规定，20 ℃时10.00 mL单标线吸管（A级）的容量最大允许误差为±0.020 mL。
10.00 mL单标线吸管引入的标准不确定度:
其中:
设温度变化为±3 ℃，水膨胀系数在20 ℃时，α=2.1×10 -4/℃。
10.00 mL单标线吸管引入的相对不确定度:
其他因素均查表，通过计算得出。
标准溶液配制过程引入的相对标准不确定度带入公式（10），得出:
标准溶液引入的相对标准不确定度:带入公式
（11），得出u rel（C 0）=0.89%。
2.2.5 标准曲线拟合引入的不确定度u（C n）
表1 标准曲线拟合原始数据的计算
Table1 Calculation of standard curve fitting original data
注:y理论值，y j=a+bc i；c理论值，c j=（y i-a）/b；符号代表意义同公式（12）、（13）。
c
i/（μg/mL）c理论值（c
j-）
2y
iy理论值（y
i-y
j）
20.00113.531.150.40.068 0.00113.441.050.40.462 0.010.00957.107.017.50.261 0.01056.747.217.50.097 0.050.048392.0034.7536.11.887 0.049391.0135.2636.10.746 0.10.1061 671.1575.9871.916.835 0.1061 668.8676.3671.920.097 0.20.1916 317.00136.73143.444.276 0.1976 299.20140.9143.46.170 0.50.50113.53358.66357.90.570 0.50213.44359.34357.92.059∑=0.86Σ=0.359Σ=94.067 0 =0.14s
y=3.067n=12p=2 c
d=0.096 a=0.37b=7.5×10
2r=0.999 8
标准曲线拟合引入的标准不确定度:带入公式（12）及（13），得出u（C n）=0.003 3 μg/mL。
标准曲线拟合引入的相对标准不确定度:带入公式（14），得出u rel(C n)=3.4%。
2.2.6 样品空白引入的不确定度
平行做6 个样品空白，不加样品，其余操作同测量过程。样品空白不确定度测定结果分别为9.4、9.3、10.3、 9.8、10.0、9.5，平均值
标准偏差S（S
0）=0.36；带入公式（15），得出u（S
0）=0.06；样品空白的相对标准不确定度:带入公式（16），得出u
re（S
0）=0.6%。
2.2.7 回收率引入的不确定度u（Rec）
称取重复性样品测定的样品6 份，添加标准溶液，按照样品测量过程进行平行测定，测定结果见表2。
表2 回收率实验结果
Table2 Results of recovery test
测定结果n回收率/%回收率平均值/%标准偏差/%相对标准偏差/% 186.1 292.3 388.9 498.6 589.5 6104.9 93.47.17.6
带入公式（17），得出u（Rec）=2.9%；带入公式（18），得出u rel（Rec）=3.1%。
2.3 计算相对合成标准不确定度和合成标准不确定度
相对合成标准不确定度为带入下列公式,结果为：
试样中硫胺素含量的测定结果平均值为0.52 mg/100 g，因此合成标准不确定度为:
2.4 扩展不确定度
按国际惯例，95%置信概率下取包含因子k=2，将合成标准不确定度乘以包含因子计算得到测量结果的扩展不确定度为:
2.5 报告测量结果
某一样品测定荧光强度79.96 AU，样品空白荧光强度9.51 AU，样品定容体积100 mL，样品的质量为2.000 g。按照计算公式，则试样中硫胺素的含量为 0.49 mg/100 g。测定结果报告为:（0.49±0.06）mg/100 g，k=2。
2.6 各分量不确定度汇总
以上测定各分量不确定度汇总表见表3。
表3 各分量的不确定度汇总表
Table3 Summary of uncertainty components
项目分量x值标准不确定度u（x）相对标准不确定度u（x）/x测量结果重复性rep/（mg/100 g）0.520.009 41.8样品质量m/g2.0000.000 290.015样品定容体积V 1/mL1000.0680.068标准溶液C 0/（μg/mL）0.140.120.89标准曲线拟合C n/（μg/mL）0.0960.003 33.4样品空白S 0/AU9.70.060.6回收率Rec/%93.42.93.1
检验结果的不确定度分别来自于测量结果重复性、样品质量、样品定容体积等表3中所列出的7个分量。各个分量对不确定度的影响也有很大差别。从表3可以得出，标准曲线拟合、回收率对检验结果的不确定度影响最大，而此类分量也是实际检验过程中无法避免的，切实存在于系统误差之中。
参照GB/T 5009.84—2003测定营养液补充剂中硫胺素的含量。通过对测定过程中的不确定度来源进行分析。本实验测量过程中不确定度来源主要为人员的重复测定、标准曲线的拟合以及回收率，其中标准曲线拟合在不确定度合成中产生的贡献最大。在今后的类似检测过程中均应对标准曲线的拟合过程加强质量控制。
参考文献：
[1] 国家质量技术监督局计量司组. 测量不确定度评定与表示指南[M].北京: 中国计量出版社, 2005: 1-25.
[2] 国家标准化管理委员会. JJF 1059.1—2012 测量不确定度评定与表示[S]. 北京: 中国标准出版社, 2012.
[3] 国家标准化管理委员会. GB/T 5009.84—2003 食品中硫胺素(维生素B 1)的测定方法[S]. 北京: 中国标准出版社, 2003.
[4] 刘智敏, 刘风. 现代不确定度方法与应用[M]. 北京: 中国计量出版社, 1997: 40-51.
[5] 倪晓丽. 化学分析测量不确定度评定指南[M]. 北京: 中国计量出版社, 2008: 58-67.
[6] 李慎安. 测量不确定度表达百问[M]. 北京: 中国计量出版社, 2000: 99-104.
[7] 国家质量监督检验检疫总局. JJG 646—2006 移液器检定规程[S].北京: 中国计量出版社, 2007.
[8] 中国合格评定国家认可委员会. CNAS-CL07: 2011 测量不确定度的要求[S]. 北京: 中国标准出版社, 2011.
[9] 李安. 质检测量中不确定度评定[J]. 误差与不确定度, 2005(8): 67-68.
[10] 臧慕文. 分析测试不确定度的评定与表示[J]. 分析试验室, 2005, 24(12): 85-90.
[11] 曹宏燕. 分析测试中测量不确定度及评定第三部分: 分析测试中主要不确定度分量的评定[J]. 冶金分析, 2005, 25(3): 82-87.
[12] 王承忠. 测量不确定度原理及在理化检验中的应用[J]. 理化检验:物理分册, 2003, 39(1): 57-60.
[13] 卫生部. GB 2760—2011 食品添加剂使用标准[S]. 北京: 中国标准出版社, 2011.
[14] 蔡秋, 朱明. 高效液相色谱法测定茶饮料中苯甲酸结果不确定度评定[J]. 食品科学, 2007, 28(2): 277-280.
[15] 崔淑华, 郭庆龙, 刘冰. 液相色谱法测定鸡肉中二氯二甲吡啶酚残留量的测量不确定度评定[J]. 食品科学, 2007, 28(12): 397-400.
[16] 杨秀培, 肖丹, 山桂云. 白酒中己酸乙酯测定的不确定度评估[J]. 食品科学, 2006, 27(7): 214-217.
[17] 丁明, 屈明华, 韩素芳. 液相色谱测定茶油中维生素E结果的不确定度评定[J]. 中国粮油学报, 2008, 23(5): 190-193.
[18] 张淑霞, 鲁慧芳, 高亚辉. GC-MS-MS法测定浓缩苹果汁中对硫磷残留量的不确定度评定[J]. 粮油加工, 2010(10): 153-156.
[19] 吴小松, 刘沐雨, 曹玉发, 等. HPLC法测定婴儿配方奶粉中维生素A含量的不确定度评定[J]. 食品工业科技, 2013, 34(9): 309-311.
[20] 刘征辉, 赵琳琳, 魏静娜, 等. LC-MS/MS法测定奶粉中三聚氰胺的不确定度评定[J]. 现代测量与实验室管理, 2012(2): 23-24; 52.
[21] 霍艳敏, 王艳丽, 王骏, 等. 高效液相色谱法测定婴幼儿乳粉中烟酰胺的不确定度评定[J]. 食品科学, 2011, 32(16): 330-333.
[22] 张宝华. 荧光分光光度计检定结果的不确定度评定[J]. 河北化工, 2010(4): 69-73.
[23] 郑怀东, 刘学光, 关丽. 气相色谱法测定河蟹中多氯联苯残留量的不确定度分析[J]. 食品科学, 2011, 32(16): 334-337.
[24] 牛华, 牛之瑞, 冯雷. 梅高效液相色谱法测定辣椒粉中罗丹明B的测量不确定度评估[J]. 食品科学, 2014, 35(8): 165-168. doi:10.7506/ spkx1002-6630-201408033
[25] 郝晓莉, 赵瑛博, 陈芳芳. 分光光度法测定白菜中亚硝酸盐的不确定度评定[J]. 食品科学, 2013, 34(6): 208-210.
[26] 张素娟. 气相色谱法测定白酒中乙酸乙酯含量的不确定度分析[J].食品科学, 2010, 31(2): 151-153.
Evaluation of the Uncertainty of Measurement for Determination of Thiamine Content in Nutritional Supplements by Fluorescence Spectrophotometry
HUANG Xu, JIA Hongxin, LI Hui
(Liaoning Institute for Food Inspection and Testing, Shenyang 110015, China)
Abstract：In this study, the thiamine (vitamin B 1) content of nutritional supplements was determined according to the Chinese national standard GB/T 5009.84—2003: Determination of Thiamine (Vitamin B 1) in Foods. By analyzing the sources of uncertainty in the determination of thiamine, we obtained the uncertainty components and finally calculated the combined standard uncertainty and expanded uncertainty. The results showed that thiamine content in the sample was 0.49 mg/100 g, and the expanded uncertainty was 0.052 mg/100 g. The uncertainty of standard curve fitting was the most important component of the combined standard uncertainty. Therefore, more attention should be paid to standard curve fitting in order to obtain more accurate results for the determination of thiamine in nutritional supplements.
Key words：uncertainty; thiamine; nutritional supplements
中图分类号：TS207.3
文献标志码：A
文章编号：
doi：10.7506/spkx1002-6630-201510035
收稿日期：2014-04-23
作者简介：黄旭(1982—),男,工程师,学士,研究方向为食品检验。E-mail：41856453@126.com