同时蒸馏萃取和固相微萃取对双孢蘑菇风味物质的提取分析

摘要：采用同时蒸馏萃取法和固相微萃取法对双孢蘑菇的挥发性风味物质进行提取，并通过气相色谱-质谱联用分析及鉴定。采用同时蒸馏萃取法鉴定出36 种化合物，采用固相微萃取法鉴定出34 种风味化合物，2 种方法分析出蘑菇的特征风味物质为1-辛烯-3-醇、1-辛烯-3-酮、2-辛烯-1-醇、2,6-二甲基吡嗪、2-戊基呋喃、甲基吡嗪、1-辛醇等，均以1-辛烯-3-醇含量最高。2 种提取方式相互补充相互验证。

关键词：双孢蘑菇；同时蒸馏萃取；固相微萃取；气相色谱-嗅闻-质谱联用

蘑菇种类繁多，有香菇（Lentinus edodes）、猴头菇（Hericium erinaceus）、平菇（Pleurotus ostreatus）、杏鲍菇（Pleurotus eryngii）、竹荪（Phallus indusiatus）等。蘑菇风味鲜美，含有丰富的蛋白质、齐全的维生素、真菌多糖和矿物质元素等 [1-2]，它的蛋白质含量通常约为干质量的15%～35%，远高于一般的蔬菜 [3]，并且必需氨基酸组成全面，氨基酸模式与人体接近 [4]。双孢蘑菇（Agaricus bisporus）又称白蘑菇、蘑菇、洋蘑菇，是我国培养最广、产量最大的一种食用菌，也是目前世界上消费量、养殖量最大的食用菌之一 [5]。

蘑菇之所以为消费者所喜爱，主要是它具有丰富的营养和特殊的鲜香风味。蘑菇的风味主要来自不挥发性含氮化合物和挥发性物质 [6]。其独特的香味则取决于其所含的挥发性芳香物质 [7]。主要包括挥发性含碳化合物、含硫化合物以及醛、酸、酮、酯等 [8]。蘑菇的风味非常复杂，不能由单一物质呈现，是多种组分在数量上平衡的综合结果 [9]。

不同品种的蘑菇，甚至同一蘑菇的不同生长部位，其所含的香味成分也存在差异 [10]。郑建仙等 [11-12]用同时蒸馏萃取（simultaneous distillation extraction，SDE）法提取分析香菇不同部位的风味成分，从香菇伞部分离鉴定出64 种风味化合物，从香菇柄部分离鉴定出42 种风味化合物，发现这两者的风味组成虽有一定差异，但是主要的风味成分（含硫化合物和八碳化合物）差异并不是很大，这一研究为香菇类产品的综合利用提供了相应的理论依据。

随着分离检测技术的发展，各种先进的提取分离技术开始应用于蘑菇风味的分析。张书香等 [13-14]采用固相微萃取（solid phase micro extraction，SPME）技术和气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用分析香菇挥发性香味成分，共检测出43 种挥发性风味物质，其中含量较高的成分为二甲基二硫醚（3.36%）、二甲基三硫醚（13.36%）、1,2,4-三硫杂环戊烷（3.70%）、1-辛烯-3-醇（1.11%）。GC-MS法也被应用在白灵菇风味成分分析 [15]及平菇与香菇挥发性香味成分的分析 [16]等。气相色谱-嗅闻（gas chromatographyolfactometry，GC-O）是利用人的鼻子嗅闻经气相色谱柱分离后的各个馏分，以检测样品中的活性风味物质 [17]。杨超等 [18]运用SDE方法对香竹竹叶中挥发性物质进行提取，利用GC-O与GC-MS联用的法方对其中气味活性物质进行定性分析，共鉴定出29 种气味活性物质。目前，国内外对于双孢蘑菇的研究多集中于对其营养成分如蛋白质、多糖及鲜味成分核苷酸的研究上 [19-25]，而对于双孢蘑菇风味的研究与分析鲜见报道。本实验利用SDE、SPME对双孢蘑菇的风味成分进行分析，并利用GC-O-MS对其风味物质进行分析，旨在为双孢蘑菇风味料的开发研制提供技术参数和指导。

1 材料与方法

双孢蘑菇（鲜）市购；无水乙醚、正己烷、无水硫酸钠（均为分析纯）北京化工厂；正构烷烃混合标准品（C 8～C 26）美国Sigma公司。

多功能料理机九阳股份有限公司；高速冷冻离心机日本日立公司；同时蒸馏萃取装置美国Knotes公司；RV10型旋转蒸发仪德国IKA公司；6890-5973i气相色谱-质谱联用仪美国安捷伦公司；电热鼓风干燥箱上海一恒科学仪器有限公司；SL型电子天平上海民桥精密科学仪器有限公司；DF-101S恒温加热磁力搅拌器河南予华仪器有限公司；75 μm碳分子筛/聚二甲基硅氧烷（carboxen/polydimethylsiloxane，CAR/ PDMS）萃取纤维和手动固相微萃取进样器、40 mL固相微萃取专用样品瓶美国Supelco公司；Sniffer 9 000嗅闻仪瑞士Brechbuhler公司。

准确称取双孢蘑菇鲜品100 g，切成约3 cm边长的小块，置于1 000 mL圆底烧瓶中，加500 mL去离子水。装上SDE装置，用电热套加热，保持蘑菇汤沸腾。另取30 mL无水乙醚溶液和30 mL正己烷溶液加入100 mL的圆底烧瓶中，以水浴锅加热，设置初始温度为30 ℃，待电热套中大圆底烧瓶中水沸腾再将温度设置为40 ℃，提取3 h。冷却至室温，向有机萃取液中加入适量干燥处理（500 ℃，4 h）的无水硫酸钠，塞进瓶塞置于冰箱中24 h。

将提取液从冰箱中取出，恢复至室温后，通过干燥的无水硫酸钠层过滤至圆底烧瓶中。用旋转蒸发仪浓缩（温度保持在40 ℃）至2 mL左右，然后用分析纯N 2吹扫至约1 mL待分析。

准确称取5.0 g双孢蘑菇样品，切丁后装入40 mL样品瓶中，在50 ℃的恒温加热磁力搅拌器中平衡1 h然后将CAR/PDMS（75 μm）萃取头插入样品瓶顶空部分，在60 ℃条件下萃取1 h后拨出，迅速插入GC-MS进样口，进行GC-MS分析。

GC条件:色谱柱:DB-Wax毛细管柱（30 m× 0.25 mm，0.25 μm）；载气（纯度99.99%）氦气；流量1.0 mL/min；进样口温度230 ℃；升温程序:起始温度35 ℃，保留5.0 min，以10 ℃/min升至85 ℃，保持1 min；进样量10 μL；分流比25∶1。

MS条件:电子电离源；离子源温度220 ℃；传输线温度250 ℃；质量扫描范围45～500 u；电子能量70 eV。

挥发性风味物质定性分析主要依据GC-MS分析获得的总离子流色谱图进行分析鉴定。分离出的风味化合物首先与GC-MS所配备的Wiley 6.0（32万个化合物）或NIST 98（10.7万个化合物）标准谱库进行匹配鉴定（要求匹配度不小于80），所得的风味化合物在初步鉴定的基础上尽可能与正构烷烃混合标准品的保留指数（retention index，RI）（风味化合物的RI通过正构烷烃混合标准品（C 8～C 26）计算得到）或文献中相同化合物的RI进一步确认，检索确定其化学结构，采用峰面积归一法确定相应物质中各化合物的相对含量。

嗅闻口传输线温度250 ℃；火焰离子化检测仪（flame ionization detector，FID）和嗅闻口间分流比1∶1；载气:氮气；载气流速1.2 mL/min；进样量2 μL；不分流模式。

GC-O检测:分3 个时间段（0～20、20～40、40～60 min）嗅闻，各时间段由3 个不同的感官评价员参与，每个人每个样品分析3 次，共分析9 次，记录气味特征和保留时间。

香味提取稀释分析:通过调节FID和嗅闻口间的分流比（1∶1、1∶10……）得到特征风味物质，（分流比是进样口通过软件设置），以风味稀释因子（factor dilution，FD）为指标，FD值越大则表明此风味物质对整体风味的贡献越大，当FD=1时，则认为此物质对整体风味的影响可以忽略。

2 结果与分析

采用SDE法和SPME法提取双孢蘑菇中挥发性风味物质的GC-MS总离子流图（图1）。各色谱图经质谱图人工解析，经由GC-MS技术进行风味鉴定，结果如表1、2所示。

其中采用SDE提取双孢蘑菇获得的挥发性风味物质有36 种，检测出1-辛烯-3-酮（0.30%）、2-甲基-3-辛酮（0.51%）、3-辛烯-2-酮（0.90%）、1-辛烯-3-醇（1.84%）、1-辛醇（0.40%）、2-辛烯-1-醇（0.33%），其中以1-辛烯-3醇含量最高，具有浓郁的蘑菇香味。这些风味物质在蘑菇中相互协调或者互补，共同组成了蘑菇的特有风味。由GC-MS分析结合不同评价员对双胞蘑菇的香气描述以及RI，进一步确认鉴定出:蘑菇香味的5 种化合物，花香的3 种化合物，炒香的2 种化合物，甜香的3 种化合物，果香的2 种化合物，肉香、脂香的2 种化合物，其他的6 种化合物。

采用SPME提取双孢蘑菇获得的挥发性风味物质有34 种化合物。其中癸醛是最重要的风味化合物，相对含量占总风味物质的32.23%。对蘑菇风味影响最重要的八碳化合物，本实验共检测出正辛醛（0.31%）、1-辛烯-3-酮（0.48%）、2,3-二辛烯酮（0.63%）、3-辛烯-2-酮（2.14%）、2-辛烯醛（0.90%）、1-辛烯-3-醇（3.22%）、1-辛醇（0.49%）、2-辛烯-1-醇（0.33%）、2-丁基-2-辛烯醛（0.25%），其中以1-辛烯-3-醇含量最高，这与SDE提取双孢菇挥发性风味物质的结果一致。其他的一些化合物如2-戊基呋喃具有甘草味或者果香味，2,5-二甲基吡嗪具有爆米花味，2,6-二甲基吡嗪具有巧克力味，对蘑菇风味的形成起着协调或者互补的作用。由GC-MS分析结合不同评价员对双胞蘑菇的香气描述以及RI，进一步确认鉴定出:蘑菇香味的4 种化合物，花香的2 种化合物，炒香的2 种化合物，甜香的2 种化合物，果香的1 种化合物，青草味的2 种化合物，其他的4 种化合物。

采用2 种方法，鉴定出对双孢蘑菇风味贡献较大的几类化合物48 种，其中包括醇类11 种、醛类11 种、酮类13 种、杂环化合物12 种、酸类1 种。2 种方法均检测出的物质有21 种，分别是3-甲基丁醛、正己醛、2-戊基呋喃、甲基吡嗪、正辛醛、1-辛烯-3-酮、2,6-二甲基吡嗪、正己醇、壬醛、3-辛烯-2-酮、1-辛烯-3-醇、糖醛、苯甲醛、1-辛醇、2-辛烯-1-醇、苯乙醛、苯乙酮、香叶基丙酮、苯甲醇、2-乙酰吡咯、二氢-5-戊基-2（3H）-呋喃。

蘑菇中的重要的八碳化合物SDE检测出6 种，SPEM测得的蘑菇中的八碳化合物有9 种，均以1-辛烯-3醇含量最高。

表1 SDE-GC-MS联用分析双孢蘑菇风味成分
Table1 Flavor compounds in Agaricus bisporus extracted and analyzed by SDE-GC-MS

注:—.未检测出；A.化合物的质谱、RI、风味与标准品对照鉴定；B.化合物的质谱与数据库（Wiley 6.0 & NIST 98）对照RI与文献一致；C.通过GC-O-MS嗅闻气味。下表同。

序号RI风味描述化合物相对含量/%FD鉴定方法1908果香3-甲基丁醛7.3010A 21 054硫味二甲基二硫化物0.1610B 31 066青草味正己醛9.821A 41 158—5-甲基-2己酮0.49——51 165—2-庚酮3.46——61 198—3-甲基丁醇0.31——71 204炒瓜子香2-戊基呋喃0.4820A 81 239—正戊醇0.63——91 247坚果香、炒香甲基吡嗪0.4620C 101 263果香正辛醛0.771B 111 281蘑菇味1-辛烯-3-酮0.3020B 121 289—2-甲基-3-辛酮0.51——131 300爆米花味2,5-二甲基吡嗪0.8440C 141 308巧克力味2,6-二甲基吡嗪2.1440C 151 338青草味正己醇0.9310A 161 372—壬醛3.22——171 385熟蘑菇味3-辛烯-2-酮0.9040A 181 428蘑菇味1-辛烯-3-醇1.8420B 191 437甜香糠醛1.9820B 201 497杏仁味苯甲醛32.2310A 211 515脂肪香2-壬烯醛0.4620A 221 553花香1-辛醇0.401A 231 580花香2-十一烷酮0.4910A 241 604蘑菇味2-辛烯-1-醇0.3310B 251 614花香苯乙醛2.0040A 261 621肉味2-乙酰噻唑0.621A 271 632—苯乙酮0.98——281 818酸败味己酸0.251A 291 835—香叶基丙酮0.37——301 858花香苯甲醇10.091A 311 909甜味、蜂蜜味苯乙醇0.251A 321 949坚果香2-乙酰吡咯0.311B 331 977—甲酚0.87——342 021甜香二氢-5-戊基-2（3H）-呋喃酮1.0910B 352 388果香2,4-二叔丁基苯酚0.351B 362 419—吲哚0.10——

表2 SPME-GC-MS联用分析双孢蘑菇风味成分
Table2 Flavor compounds in Agaricus bisporus extracted and analyzed by SPME-GC-MS

序号RI嗅闻气味特征化合物名称相对含量/%FD鉴定方法1908果香3-甲基丁醛7.3010A 2975—2-戊酮0.16——31 064青草味正己醛9.821A 41 178炒瓜子香吡啶0.4910A 51 202炒瓜子香2-戊基呋喃3.4620A 61 247坚果香甲基吡嗪0.4520C 71 262蘑菇香正辛醛0.311B 81 280蘑菇味1-辛烯-3-酮0.4820B 91 289—2,3-二辛烯酮0.63——101 306巧克力味2,6-二甲基吡嗪0.4640C 111 312果香6-甲基-5-庚烯-2-酮0.771B 121 336青草味正己醇0.3010A 131 361硫味二甲基三硫化合物0.51——141 373—壬醛0.84——151 384熟蘑菇味3-辛烯-2-酮2.1440A 161 395—三甲基吡嗪0.93——171 406—2-辛烯醛0.90——181 426蘑菇味1-辛烯-3-醇3.2220B 191 435甜香糠醛1.8420B 201 473清香2-乙基-1-己醇1.981B 211 478—癸醛32.23——221 483—3-壬烯-2-酮0.46——231 494杏仁味苯甲醛0.4010A 241 550花香1-辛醇0.491A 251 601蘑菇味2-辛烯-1-醇0.3310B 261 613花香苯乙醛2.0040A 271 625—苯乙酮0.62——281 629—正壬醇0.98——291 630—2-丁基-2-辛烯醛0.25——301 832—香叶基丙酮0.37——311 855花香苯甲醇9.891A 321 943坚果香2-乙酰吡咯0.251B 332 021甜香二氢-5-戊基-2（3H）-呋喃酮1.0110B 342 179—十六酸甲酯0.89——

3 结论

从表1、2可知，采用SDE方法分离鉴定出的化合物和SPME获得的挥发性成分从化合物的总数上看整体差别不大（SDE获得挥发性风味成分化合物36 种，SPME方式获得34 种），但从分析出的化合物的组成上看差别很大，测定出的共同化合物仅有21 种（但蘑菇中重要的挥发性的香味物质均测出）。

不同的萃取方式所获得的挥发性化合物不尽相同，这是由萃取方法本身的特点所决定的，SDE萃取时间较长，可以把香气成分最大限度的萃取出来，而SPME是顶空吸附样品的挥发性、半挥发性成分，所以对于半挥发性的成分的测定灵敏度偏低，同时因为受萃取头的限制，使用时间长，固定液流失，吸附力随之下降，从定量上讲也要弱于SDE的方式。而从定性来讲，SPME法由于其简单无破坏的特点对于挥发性化合物的鉴定更准确，SDE法具有良好的重复性和较高的萃取量，适合于香精香味成分的定量分析；SDE法具有快速简便、不使用溶剂和样品检测非破坏性等优点，适合于香精的剖析定性 [26]。所以实验采用的2 种提取方式是相互补充相互验证。

以SDE和SPME 2 种提取方式分离出双孢蘑菇的香味物质并进行了分析，为双孢蘑菇香味物质在生产上的应用提供了可靠地数据参考。然而由于时间和条件的限制，实验中仍存在一些问题需要深入研究。

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Comparative Application of SDE and SPME for Analysis of Aroma-Active Compounds in Button Mushroom (Agaricus bisporus)

Abstract：Aroma-active compounds in Agarucs bisporus were isolated by simultaneous distillation extraction (SDE) or solid phase micro extraction (SPME) and analyzed by gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry (GC-O-MS). A total of 36 and 34 kinds of aroma-active compounds were identified by SDE and SPME, respectively. The following characteristic flavor compounds were identified: 1-octene-3-ol, 1-octene-3-one, 2-octene-1-ol, 2,6-dimethyl pyrazine, 2-pentyl furan, methyl pyrazine, n-octanol etc. 1-Octene-3-ol was identified by both methods as the most abundant compound. The two extraction methods can be used to complement and validate each other.

Key words：Agaricus bisporus; simultaneous distillation extraction (SDE); solid phase micro extraction (SPME); gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry (GC-O-MS)

作者简介：吕艳杰(1977—),女,工程师,硕士,研究方向为食品添加剂。E-mail：roc530@sohu.com

同时蒸馏萃取和固相微萃取对双孢蘑菇风味物质的提取分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结 论

3 结论