蒲承君 1，崔兴博 1，杜兰兰 1，雷 娅 1，张宏宇 1，刘 芳 2，董庆利 1，刘 箐 1,*
（1.上海理工大学医疗器械与食品学院，上海 200093；2.甘肃出入境检验检疫局国际旅行卫生 保健中心，甘肃 兰州 730020）
摘 要：采用聚合酶链式反应技术对上海市52 个市场的208 份鸡腿、鸡爪、鸡翅、鸡胗、鸡胸肉中出血性大肠杆菌O157∶H7、沙门氏菌、志贺氏菌、单增李斯特菌、阪崎肠杆菌5 种食源性致病菌进行快速检测，以了解不同鸡肉食用部位各种致病菌的分布规律，并根据β概率分布确立最具代表性的部位作为评估靶点。结果显示:在208 份样品中，大肠杆菌O157∶H7和沙门氏菌未检出；阪崎肠杆菌在鸡翅中检出1 株；志贺氏菌检出2 株，分布于鸡翅、鸡胗；单增李斯特菌检出11 株，检出率达5.29%，且在鸡翅中检出率最高（4 株），鸡腿（3 株）、鸡爪（3 株）部位检出率相当，鸡胗检出率最低（1 株）。
关键词：聚合酶链式反应；致病菌；生鲜鸡肉；β概率分布；评估靶点
食源性致病菌如沙门氏菌、单增李斯特菌等是造成食源性疾病爆发的主要原因 [1]。我国2000—2006年卫生部发布的食物中毒公告显示，微生物性危害导致的食物中毒人数占总中毒人数的51.33%，大约是化学性危害导致中毒人数的212 倍 [2]。这些由致病菌所引发的急性食物中毒常出现恶心、腹痛、腹泻、发烧等症状，重者威胁呼吸、循环、神经系统，甚至留下后遗症 [3-6]。
在食源性致病菌调查中，一般采取随机取样的方法，但对取样部位并没有明确的规定。一般随机以某种肉制品的某个部位作为整体的代表取样检测，进而对致病菌的污染状况进行评价。但按照致病菌侵染机理，动物组织携带细菌数量应该有所区别，目前这种对采样部位没有明确规定，随机抽样可能存在以偏概全、盲人摸象的弊端，不仅容易造成致病菌监测漏检 [7-8]，而且不能为食源性致病菌的风险评估和预警提供准确、科学的数据。高巍等 [9]通过对生长猪胃肠道不同区段的益生菌分布数量及规律进行研究，发现乳酸菌、双歧杆菌、大肠杆菌在胃肠道不同区段的分布数量是不同的，但鸡肉不同食用部位致病菌分布有何特点，仍然缺乏基础研究数据。
聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）作为一种新的快速检测方法，被广泛应用于各种微生物的快速检测，具有快速、高效、定量、灵敏的特点 [10]。本项目从上海市52 个市场上采集了鸡翅、鸡腿、鸡爪、鸡胗、鸡胸肉共208 份样品，利用出血性大肠杆菌O157∶H7（Escherichia coli O157:H7） rfbE基因、沙门氏菌（Salmonella spp.）invA基因、志贺氏菌（Shigella spp.）iapH基因、单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)hly基因、阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii）16S rRNA基因作为特异性引物进行PCR检测，希望通过大量样品的快速检测，寻找一种可代表致病菌污染水平的部位，探讨以最具代表性的食用部位作为致病菌的评估靶点，建立准确预警系统的可能性。
1.1 材料、菌株与试剂
鸡翅、鸡腿、鸡爪、鸡胗、鸡胸肉购于闵行欧尚超市等上海市52 个超市或菜市场。
ATCC标准菌株由上海慧耘生物科技有限公司赠送,标准菌株列表如表1所示。
表1 实验用菌株
Table1 Bacterial strains used in this study
菌株编号鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）ATCC 14028猪霍乱沙门氏菌（Salmonella choleraesuis）ATCC 21493肠炎沙门氏菌（Salmonella enteritidis）ATCC 13076鲍氏志贺氏菌（Shigella boydii）ATCC 9207阪崎肠杆菌 （Enterobacter sakazakii）ATCC 29554阪崎肠杆菌 （Enterobacter sakazakii）ATCC 29004单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）ATCC 19116出血性大肠杆菌O157∶H7(E.coli O157:H7)ATCC 882346
改良EC肉汤（modified EC broth，mEC+n）、改良山梨醇麦康凯琼脂（modifi ed sorbitol maconkey agar，CT-SMAC）、缓冲蛋白胨（buffered peptone water，BPW）、四硫磺酸钠煌绿增菌液（tetrathionate broth，TTB）、亚硒 酸盐胱氨酸增菌液（selenite cystine broth，SC）、亚硫酸铋琼脂（bis muth sulfite agar，BS）、沙门氏菌显色培养基、木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂（xylose lysine desoxycholat e agar，XLD）、志贺氏菌增菌肉汤-新生霉素、改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨（modified lauryl sulfate tryptosebroth，MLST）、万古霉素溶液、阪崎肠杆菌显色培养基、李氏增菌肉汤LB1、李氏增菌肉汤LB2、PALCAM选择性培养基、PALCAM选择性添加剂、脑心浸液琼脂（brain heart infusion agar，BHIA）北京陆桥技术有限责任公司；PCR的10 倍缓冲液，dNTP（2.5 mmol）、Taq DNA Polymerase（5 U/μL）、MgCl 2（25 mmol）、loading buffer（6×）、100 bp ladder DNA Marker 生工生物工程股份有限公司。
1.2 仪器与设备
LRH-70生化培养箱 上海一恒科技有限公司；G560E振荡器 上海凡劲仪器设备有限公司；Gene Amp ®PCR system 9700、凝胶成像系统 美国基因有限公司。
1.3 引物
引物由生工生物工程股份有限公司合成，序列如表2所示。
表2 PCRR引物
Table2 PCR primers
菌种名称目标基因引物引物序列（5’-3’）片段大小/bp引物序列来源出血性大肠杆菌O157∶H7rfbE大肠1大肠2 ATTGCGCTGAAGCCTTTG CGAGTACATTGGCATCGTG499SN/T 1869—2007 [11]沙门氏菌invAinvA1 invA2 GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA CATCGCACCGTCAAAGGAAC284Rahn等 [12]志贺氏菌ipaHP1 P2 GTTCCTTGACCGCCTTTCCGATACCGTC GCCGGTCAGCCACCCTCTGAGAGTAC629SN/T 1869—2007 [11]单增李斯特菌hlyhly1 hly2 CGGAGGTTCCGCAAAAGATG CCTCCAGAGTGATCGATGTT234王海艳等 [13]阪崎肠杆菌16S rRNA16S1 16S2 GGG TTGTCTGCGAAAGCGAA GTCTTCGTGCTGCGAGTTTG282SN/T 1632.2—2005 [14]
1.4 方法
1.4.1 样品处理
在无菌操作条件下用刀切碎样品，并称取检测样品25 g于自封袋中，每袋分别倒入225 mL已灭菌的前増菌肉汤液体培养基，在拍击式均质器上连续均质1～2 min，于37 ℃培养箱中培养18～24 h。每种样品分别按GB/T 4789.36—2008《食品卫生微生物学检验:大肠埃希氏菌O157∶H7 NM检验》 [15]、GB 4789.4—2010《食品微生物学检验:沙门氏菌检验》 [16]、GB 4789.40—2010《食品微生物学检验:阪崎肠杆菌检验》 [17]、GB 4789.30—2010《食品微生物学检验:单核细胞增生李斯特氏菌检验》 [18]、GB 4789.5—2012《食品微生物学检验:志贺氏菌检验》 [19]检测，并分离至选择性培养基上。
1.4.2 PCR体系配制
从选择性培养基上挑取可疑单菌落进行摇床培养12～18 h，用PCR方法鉴定（挑取可疑菌落后，无需提取DNA，PCR循环开始前，细菌经95 ℃高温裂解后可释放DNA）。PCR反应体系如表3所示。
表3 PCR反应体系
Table3 PCR reaction system and conditions
菌种名称10×PCR buffer/μL dNTP/ μL Taq酶/ μL引物1+ 2/μL模板/μL水/μLMgCl 2/ μL反应条件出血性大肠杆菌O157∶H75212+2530395 ℃、5 min；95 ℃、15 s，55 ℃、30 s，72 ℃、1 min，；72 ℃、5 min；35 个循环沙门氏菌540.52+2528.5395 ℃、5 min；95 ℃、1 min，58 ℃、1 min，72 ℃、2 min；72 ℃、10 min；35 个循环志贺氏菌5212+2530395 ℃、5 min；95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s；72 ℃、5 min；35 个循环单增李斯特菌520.53+3528.5395 ℃、5 min；95 ℃、30 s，55 ℃、45 s，62 ℃、30 s；72 ℃、5 min；35 个循环阪崎肠杆菌5412+2528394 ℃、5 min；94 ℃、30 s，57 ℃、30 s，72 ℃、30 s；72 ℃、7 min；35 个循环
1.4.3 PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定
将PCR扩增后的产物用1.5%（80 mL 0.5×TAE中加1.2 g琼脂糖）的琼脂糖凝胶电泳分离，取10 μL PCR产物与2 μL 6×loading buffer混合后点样，100 V电泳40 min，取出凝胶，在凝胶成像仪上观察。
1.4.4 菌株冻存
目的菌经检出后，菌液与甘油以1∶1混合存于经灭菌后的冻存管中，放-80 ℃保存。
1.4.5 β概率分析
通过当前实际取样检测的数值推测上海市整体的致病菌分布的概率情况。一般来说，阳性率推测总体符合β函数的概率分布，β(α 1，α 2)表达式中β分布，具有形状参数α 1和α 2，一般对应着:
α 1= S+1，α 2= n-S+1
式中:n是当前取样数；S是阳性检出数。以@Risk软件定义β分布，即可得到95%置信区间的概率。
2.1 选择性培养基分离结果
图1 选择性培养基分离结果
Fig.1 Separation results with selective plates
样品经分离至选择性培养基上所得菌落形态如图1所示。样品共计208 份，出现出血性大肠杆菌O157∶H7、沙门氏菌可疑菌落的平板分别为126、141 个，出血性大肠杆菌O157∶H7在山梨醇麦康凯琼脂平板上，典型菌落中心呈现较暗的灰褐色，边缘无色，沙门氏菌在亚硫酸铋琼脂平板上，典型菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色，但经PCR鉴定后均非目标菌（图1中未显示）；出现志贺氏菌可疑菌落的平板共计148 个，其中1号平板为阳性对照，2、3号平板分别为闵行欧尚超市的鸡胗、内江支路菜市场的鸡翅，典型菌落呈粉红色至无色，半透明、光滑、湿润、圆形、边缘整齐或不齐；出现阪崎肠杆菌可疑菌落的平板共计65 个，其中4号平板为阳性对照，5号平板为龙江菜市场的鸡翅，典型菌落呈蓝绿色，不透明、光滑、湿润、圆形、边缘整齐；出现单增李斯特菌可疑菌落的平板共计78 个，6号平板为阳性对照，7～17号平板为所测部分样品，典型菌落为小的圆形灰绿色菌落，周围有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷。
2.2 PCR检测结果
图2 志贺氏菌PCR检测结果
Fig.2 PCR results of Shigella
图3 志贺氏菌PCR检测结果
Fig.3 PCR results of Shigella
图4 阪崎肠杆菌PCR检测结果
Fig.4 PCR results of Enterobacter sakazakii
图5 单增李斯特菌PCR检测结果
Fig.5 PCR results of Lsiteria monocytogenes
对2.1节中出现可疑菌落的平板进行PCR鉴定，通过凝胶成像系统进行观察，最终检出2 株志贺氏菌，分别分布于欧尚超市鸡胗（图2中3号泳道）、内江支路菜市场鸡翅（图3中6号泳道），大小为629 bp；阪崎肠杆菌检出1 株，分布于龙江菜市场鸡翅（图4中5号泳道），大小为282 bp；单增李斯特菌检出11 株，分别分布于凤城农贸市场鸡爪、双辽菜市场鸡翅、扬州路农贸市场鸡翅、引翔港菜市场鸡翅、国太菜市场鸡爪、东安菜市场鸡爪、周家嘴莲花超市鸡腿、阜新菜市场鸡翅、国太菜市场鸡腿、国京菜市场鸡爪、心诚农贸市场鸡胗（图5中2、3、5、6、8～14号泳道），大小为234 bp。
综上，此次致病菌检出情况为:单增李斯特菌＞志贺氏菌＞阪崎肠杆菌＞沙门氏菌=出血性大肠杆菌O157∶H7。
2.3 鸡肉各部位致病菌分布情况
表4 鸡肉各部位致病菌分布
Table4 Pathogens distribution in different parts of chicken
部位样品总数检出数检出率/%鸡翅52611.54鸡腿5235.77鸡爪5235.77鸡胗4824.17鸡胸400
由表4可知，鸡翅受致病菌污染最严重，鸡胸肉污染较轻，但由于鸡胸肉采样量太少，难以此结果作为致病菌污染的评估靶点。综合鸡翅、鸡腿、鸡爪、鸡胗进行分析，其受污染的严重程度依次为:鸡翅＞鸡腿=鸡爪＞鸡胗。
2.4 通过β概率分布获得的总体推测平均值
表5 5β概率分布结果
Table5 Results of probability distribution
%菌种样品置信区间/% 510203040506070809095志贺氏菌鸡翅0.6751.011.562.072.593.153.784.545.547.148.64志贺氏菌鸡胗0.731.091.692.242.83.44.084.915.997.719.32阪崎肠杆菌鸡翅0.6751.011.562.072.593.153.784.545.547.148.64单增李斯特菌鸡翅3.794.665.896.887.828.769.7610.921.23514.5216.44单增李斯特菌鸡腿2.623.334.365.236.056.887.798.8410.1612.1713.98单增李斯特菌鸡爪2.623.334.365.236.056.887.798.8410.1612.1713.98单增李斯特菌鸡胗0.731.091.692.242.83.44.084.915.997.719.32
表5为β概率分布结果，志贺氏菌在鸡翅、鸡胗中95%的置信区间上阳性检出可分别达到8.64%、9.32%，单增李斯特菌在鸡翅、鸡腿、鸡爪、鸡胗中95%的置信区间上阳性检出可分别达到16.44%、13.98%、13.98%、9.32%，阪崎肠杆菌在鸡翅中95%的置信区间上阳性检出为8.64%。
综上可知，在95%置信区间，单增李斯特菌在鸡翅中检出率最高，可作为原料鸡肉最具代表性的食用部位，以此为致病菌的风险评估提供一定的理论依据。
目前，原料鸡肉受沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157∶H7的污染最为严重 [20-21]。单增李斯特菌对低温具极强耐受性，据Valero等 [22]对猪肉中沙门氏菌和单增李斯特菌的分布进行研究，发现沙门氏菌在6、7、8月份检出率最高，在11月至次年4月检出率极低，单增李斯特菌在2月仍能检出。从此次上海市所采集食用原料鸡肉各部位（鸡翅、鸡腿、鸡爪、鸡胗、鸡胸）共计208 份样品来看，大肠杆菌O157∶H7和沙门氏菌均未检出，志贺氏菌、阪崎肠杆菌检出率极低，分别为0.96%、0.48%，单增李斯特菌检出率较高，达5.29%。
大多食源性致病菌均能引起胃肠炎、败血症等疾病 [3,23-24]。单增李斯特菌能够通过宿主肠屏障和一系列的靶器官进行移植，随淋巴系统和血液循环系统进入肝、脾，并在肝中繁殖 [25-26]，但就此次单增李斯特菌在鸡肉不同部位的分布情况而言，鸡翅检出率最高，鸡腿、鸡爪的检出率相当，在鸡胗中检出率却极低，受禽流感影响，鸡肝在上海各大菜场并不常见，因此，对于单增李斯特菌在鸡肝中的分布规律并未作探讨。Sasaki等 [27]对家禽产品中单增李斯特菌的污染情况做了相关调查，发现家禽产品在禽产品加工厂内已经受到了单增李斯特菌的污染，但在鸡胸肉中的检出率却明显高于鸡肝，本研究由于鸡胸仅采集样品4份，数量较少，难以统计出单增李斯特菌在鸡胸肉中的污染情况。孙晓明等 [28]通过对莱阳市4 个鸡肉销售市场的鸡肉各部位（鸡脖、鸡翅、鸡腿、鸡爪、鸡肝）的致病菌（沙门氏菌、亚利桑那菌、大肠杆菌）进行研究发现，大肠杆菌检出率最高，就检出部位而言，鸡爪受致病菌污染最为严重，鸡翅污染最轻。王欢等 [29]对合肥市4 家超市的冰鲜鸡肉各部位（鸡翅、鸡爪、鸡胸肉）的菌落总数进行测定，发现鸡翅受微生物污染最严重，和本实验的结果一致，但对于微生物易分布于鸡翅的机理，仍缺乏相关研究。本研究所调查5 种致病菌在鸡翅中检出率最高，达11.54%，可作为鸡肉中致病菌污染的评估靶点。按照国标规定致病菌不得检出，从本实验结果来看，上海市市售鸡肉常见部位均受到志贺氏菌、阪崎肠杆菌及单增李斯特菌的污染，存在一定的安全隐患。
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Detection of Contamination of Five Main Foodborne Pathogens and Distribution Probability Assessment in Commercial Raw Chicken
PU Chengjun
1, CUI Xingbo
1, DU Lanlan
1, LEI Ya
1, ZHANG Hongyu
1, LIU Fang
2, DONG Qingli
1, LIU Qing
1,*
(1. College of Food Science and Medical Instrument, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China; 2. International Travel Health Care Center of Gansu Entry and Exit Inspection and Quarantine Bureau, Lanzhou 730020, China)
Abstract：In order to understand the distribution patterns of pathogens in different parts of raw chicken, PCR was used to detect Escherichia coli O157:H7, Salmonella, Shigella, Listeria monocytogenes and Enterobacter sakazakii that distribute on drumstick, claw, wing, breast and gizzard in 208 samples collected from 52 local markets in Shanghai. Then we established evaluation of the target point according to beta probability distribution. The results indicated that no Escherichia coli O157:H7 or Salmonella were detected in all samples, 1 strain of Enterobacter sakazakii was detected in chicken wing, 2 strains of Shigella were detected in chicken wing and gizzard, and 11 strains of Listeria monocytogenes were detected with a detection rate of 5.29%, including 4 in chicken wing, 3 in drumstick, 3 in claw and 1 in gizzard.
Key words：PCR; pathogens; raw chicken; beta probability distribution; target point evaluation
中图分类号：R155.5
文献标志码：A
文章编号：1002-6630(2015)10-0201-05
doi：10.7506/spkx1002-6630-201510040
收稿日期：2014-06-11
基金项目：大学生创新创业训练计划项目(XJ2013231)；上海市科委重点支撑项目(13430502400)；国家质检总局科技项目(GSCIQ_2010IK220)
作者简介：蒲承君(1992—),女,本科,研究方向为食品微生物。E-mail：chengjunpu@hotmail.com
*通信作者：刘箐(1970—),男,教授,博士,研究方向为食源性致病菌致病机理及快速检测技术。E-mail： liuq@usst.edu.cn