15 种柑橘果实主要酚类物质的体外抗氧化活性比较 张 华1,2,周志钦1,3,席万鹏1,3,* (1.西南大学园艺园林学院,重庆 400716;2.重庆三峡学院生命科学与工程学院,重庆 404100; 3.南方山地园艺学教育部重点实验室,重庆 400715)
摘 要:为了明确柑橘果实主要酚类物质单体的抗氧化活性差异,利用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)法、2,2’-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(2,2’-azino-bis(3-ethylbenzthiozoline-6)- 关键词:酚酸;黄烷酮;抗氧化活性;DPPH法;ABTS法;铁离子还原法;高效液相色谱-柱后衍生系统联用技术
Comparison of Antioxidant Activity in vitro of 15 Major Phenolic Compounds in Citrus Fruits
ZHANG Hua1,2, ZHOU Zhiqin1,3, XI Wanpeng1,3,* (1. College of Horticulture and Landscape Architecture, Southwest University, Chongqing 400716, China; 2. College of Life Science and Engineering, Chongqing Three Gorges University, Chongqing 404100, China; 3. Key Laboratory of Horticulture for Southern Mountainous Regions, Ministry of Education, Chongqing 400715, China)
Abstract: The antioxidant activities of 15 major phenolic compounds in citrus were evaluated by 1,1-diphenyl- Key words: phenolic acid; flavanone; antioxidant activity; DPPH method; ABTS method; FRAP method; 中图分类号:TS201.4 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2015)11-0064-07 doi:10.7506/spkx1002-6630-201511013 酚类化合物是植物次生代谢产物的最主要类型之一,目前已经在植物界鉴定到8 000 种以上。酚类物质是具有一个或多个芳香环连接一个或多个羟基的一组化合物,主要由生物类黄酮、酚酸和单宁等三大类物质构成,各大类又由许多亚类物质组成[1]。柑橘是世界上第一大水果,其果实具有重要的营养、保健和医学价值。现有的流行病学研究表明,柑橘果实的营养保健价值与其丰富的酚类物质抗氧化活性密切相关[2]。柑橘果实中的酚类物质主要包括黄烷酮、多甲氧基黄酮和酚酸,其中包括橙皮素、柚皮素在内的15 种酚类物质被认为在柑橘各代表类型的果实中广泛存在[3-4]。尽管目前已有研究报道了宽皮柑橘[5]、柚、酸橙[6]、甜橙、柠檬[7-9]的抗氧化活性,但大多数研究主要集中评价柑橘各代表类型或品种中酚类物质的总抗氧化活性上,目前,关于柑橘酚类物质单体抗氧化活性的相关研究仍比较少见,相关信息还比较缺乏。 抗氧化活性测定方法可分为体外和体内抗氧化方法或在线和非在线抗氧化方法等。体外抗氧化方法具有实验操作简单方便、成本较低等优点,应用较为普遍。体外抗氧化活性表现为抗氧化物质对自由基的清除能力,以及对于金属离子的还原能力。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)法、2,2’-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(2,2’-azino-bis(3-ethylbenzthiozoline-6)-sulphonic acid,ABTS)法和铁离子还原(ferric reducing/antioxidant power,FRAP)法是3 种常用体外抗氧化活性检测方法(“非在线”法)。随着高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)的不断发展,HPLC-DPPH和HPLC-ABTS联用技术(“在线”法)不仅可以用于分离分析提取物中成分和化合物的含量,还可在线快速分析单个化合物的抗氧化活性[10]。“非在线”法化学反应时间充分,可以从反应程度说明物质抗氧化活性强弱;“在线”法化学反应时间较短,则是从化学反应速率角度说明抗氧化活性强弱。但是,由于各种方法反应原理和条件不同,测定的结果并不完全一致,需要同时配合使用才可以提高评价的可靠性和准确性。 本实验使用ABTS法、DPPH法、FRAP法3 种离线方法和HPLC-ABTS和HPLC-DPPH两种在线体外评价方法,对15 种柑橘果实主要酚类物质单体的抗氧化活性进行比较分析和综合评价,旨在为柑橘资源的开发利用提供信息。 1 材料与方法 1.1 试剂与材料 酚类标准物质单体:柚皮苷(纯度98%)、橙皮苷(纯度98.0%)、橙皮素(纯度97%)、圣草次苷(纯度98%)、芦丁(纯度99%)、地奥司明(纯度97.3%)、川陈皮素(纯度98%)、甜橙黄酮(纯度98.7%)、橘皮素(纯度98.1%)、阿魏酸(纯度99%)、没食子酸(纯度99%)、绿原酸(纯度98%) 北京百灵威公司;圣草酚(纯度≥95.0%)、柚皮素(纯度95%)、咖啡酸(纯度≥98%) 美国Sigma公司。15 种常见酚类标准物质详细信息见表1。 表 1 15 种柑橘果实主要酚类物质单体 Table 1 Fifteen major phenolic monomers in citrus fruits
VC(L-ascorbic acid,纯度99%) 北京百灵威公司;二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、DPPH、ABTS、2,4,6-三吡啶基三嗪(2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine,TPTZ)、色谱级甲酸 美国Sigma公司;无水乙醇、冰醋酸、醋酸钠、氯化铁、NaHCO3等为分析纯 天津光复精细化工研究所。 1.2 仪器与设备 Milli-Q Advantage A10超纯水系统双蒸水制备仪 美国密理博公司;电子天平(感量0.1 mg) 德国赛多利斯集团;KQ-100B超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;LDL-5A菲恰尔离心机 上海菲恰尔分析仪器有限公司;紫外-可见分光光度计 美国铂金埃尔默公司。 Waters e2695型高效液相色谱分析系统(配有四元梯度泵、Waters XTerra MS C18保护柱(20 mm×3.9 mm,5 µm)、自动进样器、柱温箱、Waters 2998型光电二极管阵列PAD检测器)、Waters柱后反应系统(配有柱后衍生泵、柱后反应线圈、柱后衍生反应温度控制器、Waters 2489双通道紫外-可见光检测器)、Waters EmpowerTM 2 Chromatography数据分析工作站 美国Waters公司。 1.3 方法 1.3.1 溶液的配制 准确称取15 种酚类物质标准品单体固体粉末各10.00 mg,分别用DMSO溶解并定容至10.00 mL,配成1.00 mg/mL酚类标准物质贮备液,保存在-20 ℃冰箱中。 DPPH自由基溶液的配制:分别称取0.0196 g DPPH粉末于500 mL甲醇溶液中,配制为0.1 mmol/L的DPPH自由基溶液,现配现用。 ABTS+•溶液的配制:5 mL ABTS(7 mmol/L)溶液和88 µL过磷酸钾水溶液(140 mmol/ L),混合避光反应12 h,得ABTS+•。取1 mL ABTS+•反应液加入100 mL无水乙醇,然后用无水乙醇逐级稀释至该溶液在400 nm波长处的吸光度为0.70±0.02。ABTS+•反应液在24 h之内用完。 1.3.2 单体抗氧化活性的非在线测定 DPPH自由基抗氧化活性测定参照Brand-Williams等[11] (1) 式中:Ai为空白对照组的吸光度;Aj为加样品溶液的吸光度。 ABTS+•抗氧化活性的测定参照Arnao等[12]的方法,稍作修改。准确吸取50 µL 1 mg/mL的酚类物质单体贮备液,加入3 mL已经预先混合的ABTS反应试剂,充分混匀,室温反应10 min,在400 nm波长处测定吸光度。添加等量的DMSO溶液作为空白对照组。每个分析样品重复3 次。按照下式计算样品的ABTS+•抑制率。 (2) 式中:A0为空白对照组吸光度;At为样品溶液吸光度。 样品的FRAP值测定参照Benzie等[13]的方法。取50 µL提取物,加入3 mL已经预先混合的FRAP反应试剂(0.1 mol/L pH 3.6醋酸缓冲液、10 mmol/L TPTZ(溶于40 mmol/L 盐酸)、20 mmol/L氯化铁以体积比10∶1∶1混合)。超声波振荡30 s,反应10 min,混合均匀后在593 nm波长处测定吸光度。以VC水溶液为标样,制作标准曲线,得到吸光度(y)与VC含量(x)之间的回归方程。样品的FRAP值(还原Fe3+的抗氧化活性)用VC当量抗氧化能力(ascorbic acid equivalent antioxidant capacity,AAEAC)来表示(mg/L)。每个样品重复测定3 次。 1.3.3 HPLC-DPPH/ABTS抗氧化活性的在线测定 HPLC系统参数的设置参考张元梅等[3]已经报道的方法(略有改动)。Sunfire-C18柱(4.6 mm× 柱后衍生自由基分析系统参数的设置参见Jeon等[14]的方法,略有改动。0.1 mmol/L DPPH自由基溶液引入流速0.4 mL/min,检测波长517 nm;ABTS•+溶液(400 nm波长处吸光度为0.70±0.02),引入流速0.4 mL/min,检测波长400 nm,柱后温度25 ℃。 1.4 数据处理 使用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析和皮尔森相关性分析。采用Origin 7.5作图软件作图。所得数据用 ±s的形式表示。使用抗氧化活性综合(antioxidant potency composite,APC)指数法[15]进行酚类标准物质单体抗氧化活性比较,按照下式计算APC指数。 (3) 2 结果与分析 2.1 基于DPPH法、ABTS法和FRAP法酚类物质单体抗氧化活性分析 表 2 15种常见柑橘酚类标准物质的抗氧化活性 Table 2 Antioxidant capacities of 15 major phenolics in citrus fruits
注:同列小写字母不同表示差异显著(P<0.05);—. 化合物未被检测出;酚类物质清除DPPH自由基和ABTS+•的能力由柱后衍生系统在517、400 nm波长处检测出。
由表2可知,由DPPH法和ABTS法测定的15 种酚类物质对DPPH自由基的清除率和ABTS+•的抑制率明显不同。在DPPH自由基捕获法中,15 种酚类物质抑制DPPH自由基清除效果由大到小的顺序依次是:咖啡酸((32.47±5.96)%)和没食子酸((32.52±2.40)%)> 在ABTS+•捕获法中,15 种酚类物质对ABTS+• 在FRAP法测定方法中,15 种酚类物质还原Fe3+的抗氧化活性由大到小的顺序依次是:没食子酸((1 175.33±18.33) mg/L)> 2.2 基于在线HPLC-DPPH/ABTS法酚类物质单体的抗氧化活性分析 在线HPLC-DPPH/ABTS抗氧化活性检测系统由HPLC系统和柱后衍生系统组成。HPLC系统用来检测有无酚类标准物质从色谱柱中被洗脱出来,如果相对于空白样品检测结果,检测到有正色谱峰说明有酚类物质被洗脱出来;反之则没有。柱后系统用来检测DPPH自由基溶液或者是ABTS+•溶液的光吸收响应值,在进样品之前,系统会自动将DPPH自由基溶液或ABTS+•溶液的光吸收数值归零。当有抗氧化物质清除掉DPPH自由基或ABTS+•时候,柱后系统便会检测出倒峰,色谱倒峰面积越大,代表其抗氧化活性越强。由表2可知,在1~8号生物类黄酮中,只有圣草酚、圣草次苷和芦丁检测出色谱倒峰。在9~11号3 种多甲氧基黄酮均未检测出倒峰。12~15号4 种酚类物质均检测出倒峰。HPLC-DPPH法测定的倒峰面积明显小于HPLC-ABTS法测得的峰面积。 利用HPLC-DPPH 在线法检测酚类物质的倒峰面积由大到小的顺序是:咖啡酸((36.90±1.24)× 利用HPLC-ABTS在线法检测出酚类物质的倒峰面积由大到小的顺序是:咖啡酸((31.05±2.85)× 2.3 酚类物质单体的抗氧化活性综合评价
1. 柚皮苷;2. 柚皮素;3. 橙皮苷;4. 橙皮素;5. 圣草次苷;6. 圣草酚;7. 地奥司明;8. 芦丁;9. 川陈皮素;10. 甜橙黄酮;11. 橘皮素;12. 咖啡酸;13. 阿魏酸;14. 没食子酸;15. 绿原酸。 图 1 15 种柑橘果实主要酚类物质抗氧化活性APC指数 Fig.1 APC indexes for antioxidant activities of 15 major phenolics in citrus fruits 表 3 15 种柑橘果实主要酚类物质抗氧化活性及排序 Table 3 Ranking of 15 major phenolic compounds in citrus fruits by antioxidant activity
注:同一列括号中的数据表示不同标准品经过同一种抗氧化活性方法测定的抗氧化活性强弱排序。
由于各种化合物化学性质不同,且各种方法反应原理和条件也存在差异,因此,使用各种方法测定得到的抗氧化活性结果并不完全一致。如果能将各种测定方法的抗氧化活性结果综合起来,即可直接比较各种化合物的抗氧化活性差异[16-17]。本实验依据Seeram等[15]报道的APC指数法对5 种测定结果进行了综合评价(图1和 3 讨 论 大量研究表明,植物酚类物质具有抗氧化活性,能有效清除自由基,还原金属离子[2]。目前,少数柑橘酚类物质的抗氧化活性也已有报道,胡春等[18]发现橙皮苷具有清除羟自由基的作用。葡萄柚、橘、橙的果皮和果肉中的柚皮素和柚皮苷均有一定的抗氧化活性[19-22]。本研究结果表明,柑橘果实15 种主要酚类化合物均都具有清除自由基和还原金属离子的能力(表1),各单体化合物抗氧化活性差异较大,依次为:没食子酸>咖啡酸>绿原酸>阿魏酸>圣草酚>圣草次苷>芦丁>橙皮素>柚皮素>地奥司明>橙皮苷>川陈皮素>甜橙黄酮>柚皮苷>橘皮素。孙丽萍等[23]对山奈酚、咖啡酸、异鼠李素、绿原酸、高良姜素和对香豆酸6 种化合物的抗氧化活性进行了比较,结果显示抗氧化活性由强到弱的顺序为:山奈酚>咖啡酸>异鼠李素>绿原酸>高良姜素>对香豆酸。与本实验发现的咖啡酸抗氧化活性高于绿原酸抗氧化活性的结果相一致。本课题组前期的研究发现,14 种野生宽皮柑橘果肉的抗氧化活性与总酚酸含量呈极显著正相关(P<0.01,DPPH:r = 0.843;FRAP:r = 0.917; ABTS:r = 0.907;氧自由基吸收能力(oxygen radical absorption capacity,ORAC): 现有研究表明,植物酚类化合物的抗氧化活性差异不仅与酚羟基的糖基化、甲氧化以及酚羟基的数目和取代位置相关,也与C2、C3位双键的有无相关[25]。本实验结果表明,糖基化的酚类物质的抗氧化活性均低于相对应的酚类物质糖基配苷。如柚皮苷、橙皮苷和圣草次苷分别是柚皮素、橙皮素和圣草酚C7位羟基糖基化的产物,即糖基化的类黄酮抗氧化活性要小于相对应的糖基配苷。侯留鑫等[26]的研究结果显示,柚皮素的抗氧化活性显著大于柚皮苷。绿原酸与咖啡酸的不同在于咖啡酸的羧基被糖基化即为绿原酸,其抗氧化活性强于绿原酸,这与本实验结果相同。蒋柳云等[27]的报道显示,黄酮苷的抗氧化活性随着糖基中糖的增多而减小。侯留鑫等[26]的研究也证明了黄酮苷元的抗氧化活性大于黄酮糖苷,黄酮二糖苷的抗氧化活性大于黄酮四糖苷。有研究表明,黄酮类化合物羟基成苷后,原分子会失去络合过渡金属离子的能力,从而不能有效络合可以催化过氧化链式反应的一些重要金属离子,造成抗氧化活性降低[28]。 酚类物质羟基甲氧基化也会直接影响其抗氧化活性。川橙皮素、甜橙黄酮和橘皮素均属于多甲氧基黄酮。其结构特点是苯环上的羟基高度甲氧基化,没有酚羟基。本实验结果显示,3 种多甲氧基黄酮抗氧化活性均较差。这可能是由于黄酮类化合物甲氧基化后,原分子氧糖苷的形成改变了分子的平面结构和亲脂性所致[29]。单杨等[30]研究发现,酚类物质羟基甲氧基化会降低酚类化合物的抗氧化活性。同时,羟基的糖基化或甲氧基化造成羟基数目的减少,也会降低其抗氧化活性[1]。如圣草酚的B环上有两个羟基,橙皮素和柚皮素的B环上有一个酚羟基,圣草酚的抗氧化活性强于橙皮素和柚皮素。其原因为酚羟基越多,则与活性自由基结合的氢原子也越多。当酚羟基与自由基结合后,由于羟基中氧原子的pπ共轭效应具有强烈的斥电子作用,使得与活性自由基反应后生成的酚类自由基更稳定[31],从而有利于清除自由基。 现有研究表明,黄酮类化合物B环上的羟基是黄酮类化合物抗氧化、清除自由基的主要活性部位[32]。本研究中,圣草酚B环上的邻二酚羟基表现出较强的抗氧化活性。此外,黄酮类化合物A环上C7位酚羟基也是一个重要的抗氧化活性基团。C7位酚羟基糖基化的柚皮苷、橙皮苷和圣草次苷与未糖基化的柚皮素、橙皮素和圣草酚相比,其抗氧化明显降低。黄酮类化合物C环上的C3位的羟基似乎对抗氧化活性不大。芦丁C3位具有糖基,但是芦丁仍然具有较强的抗氧化活性。这和Cholbi等[33]的研究结果一致,这可能是因为C3是醇羟基,其与酚羟基相比较稳定,不易失电子,可增加化合物的水溶性而对抗氧化活性意义不大。C2、C3位双键对抗氧化活性的影响说法不一。理论上分析,双键延长了共轭体系,有利于B环失电子后自旋形成更稳定的自由基从而中断链式反应。而一旦双键被氢化后,缩短了共轭体系,改变了分子的平面结构,降低了羟基的作用,黄酮类物质的抗氧化活性会降低。本研究发现,地奥司明和橙皮苷两者抗氧化活性差异不显著,证明C2和C3位双键的有无对黄酮类化合物抗氧化活性影响不大,这与Husain等[31]的研究结果相一致。Mora等[34]研究指出,芹菜素C2、C3位双键氢化为柑橘素后,抗氧化活性下降很大,双键对活性影响较大。 4 结 论 柑橘果实酚类物质的抗氧化活性明显不同,在检测的15 种柑橘主要酚类物质中,没食子酸、咖啡酸、绿原酸和阿魏酸4 种酚酸的抗氧化活性最强,圣草酚、圣草次苷和芦丁的抗氧化活性中等,橙皮素、柚皮素、地奥司明、橙皮苷、川陈皮素、甜橙黄酮、柚皮苷和橘皮素的抗氧化活性最低,柑橘酚类化合物的抗氧化活性差异主要与酚羟基的结构修饰密切相关。 参考文献: [1] BALASUNDRAM N, SUNDRAM K, SAMMAN S. 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